Cannabidiol通过诱导宿主内质网应激和先天免疫反应抑制SARS-CoV-2复制

时间:2022年1月21日
来源:sciencemag

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Cannabidiol通过诱导宿主内质网应激和先天免疫反应抑制SARS-CoV-2复制

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摘要

SARS-CoV-2的传播和持续的COVID-19大流行凸显了新疗法的必要性。在这里我们报道了大麻酚(CBD)抑制SARS-CoV-2在细胞和小鼠中的感染。CBD及其代谢物7-OH-CBD(而不是THC或其他同类大麻素类药物)可能阻断SARS-CoV-2在肺上皮细胞中的复制。CBD在病毒进入后起作用,抑制病毒基因表达,逆转SARS-CoV-2对宿主基因转录的许多影响。CBD部分通过上调宿主IRE1αRNase内质网(ER)应激反应和干扰素信号通路来抑制SARS-CoV-2的复制。在来自全国COVID队列协作组的匹配人群中,CBD(每份医疗记录口服100mg/ml溶液)与SARS-CoV-2阳性检测呈显著负相关。这项研究强调CBD是一种潜在的预防SARS-CoV-2早期感染的药物,值得进一步临床试验。我们警告目前不要使用非医学配方,包括食用食品、吸入剂或topicals作为预防或治疗疗法。



简介

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)是导致2019年冠状病毒病(COVID-19)的罪魁祸首,这场大流行继续在全球范围内造成广泛的发病率和死亡率。SARS-CoV-2是已知的第七种感染人类的冠状病毒。这些冠状病毒包括SARS-CoV、229E、NL63、OC43、HKU1和MERS-CoV,可引起从普通感冒到更严重的疾病的一系列症状(1)尽管最近有疫苗,SARS-CoV-2仍在迅速传播(2)强调了替代治疗的必要性,特别是对于那些倾向于或获得疫苗有限的人群。迄今为止,很少有治疗方法能阻断SARS-CoV-2的复制和病毒的产生。

SARS-CoV-2是一种正义单链RNA(+ssRNA)包膜病毒,由一个脂质双层和四个驱动病毒颗粒形成的结构蛋白组成。尖峰(S)、膜(M)和包膜(E)是病毒膜的整体蛋白,促进病毒离子出芽,同时也吸收核衣壳蛋白(N)和病毒基因组RNA进入新生病毒离子。与它的近亲SARS-CoV一样,SARS-CoV-2主要通过病毒S蛋白与血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合进入人体细胞(5)之后,S蛋白通过跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)或其他蛋白酶水解成两个促进病毒进入宿主细胞的非共价结合肽(S1,S2)。这个N-S1端与ACE2受体结合C-S2末端介导蛋白水解后的病毒细胞膜融合。根据细胞类型,病毒进入也可以发生在ACE2结合后,而不依赖于蛋白水解裂解(68)进入细胞后,SARS-CoV-2基因组被翻译成两个大的多肽,被两种病毒蛋白酶Mpro和PLpro裂解(9,10),以产生15种蛋白质,此外还合成亚基因组rna,该rna编码另外10种辅助蛋白和4种结构蛋白。这些蛋白质使病毒能够复制、组装和发芽。为了抑制SARS-CoV-2β冠状病毒以及其他正在进化的致病性病毒的感染,我们测试了许多针对宿主应激反应途径的小分子的抗病毒潜力。

一个潜在的调节宿主应激和抗病毒炎症反应的是大麻酚(CBD),一个成员的大麻素类天然产物(11)制作单位大麻(大麻科;大麻/大麻)。大麻是指含有精神药物四氢大麻酚(THC)0.3%或更少,通常具有较高CBD含量的大麻植物或其衍生材料。相比之下,大麻指的是欧洲栗按干重计THC含量超过0.3%的材料。THC通过与大麻素受体结合起作用,CBD加强了这种相互作用(11)尽管有大量的研究和许多未经证实的与含CBD的产品有关的声明,但CBD本身的生物作用尚不清楚,具体的靶点也大多是未知的(12)然而,CBD口服液是FDA批准的药物,主要用于治疗癫痫(13)因此,CBD具有药物地位,是可行的治疗,不能作为膳食补充剂在美国销售(12)尽管有限,一些研究报告某些大麻素对丙型肝炎病毒(HCV)和其他病毒有抗病毒作用(14).

结果

高纯度CBD抑制人肺上皮细胞SARS-CoV-2复制

为了检测CBD对SARS-CoV-2复制的影响,我们在感染SARS-CoV-2之前,用0-10μM的CBD预处理表达外源性人ACE-2受体(A549-ACE2)的A549人肺癌细胞2小时。48小时后,我们监测细胞的病毒尖峰蛋白(S)的表达和病毒滴度。在无毒条件下,CBD可显著抑制病毒复制,EC50为1μM(图1A;图S1A)。CBD还抑制了人Calu3肺和Vero E6猴肾上皮细胞中SARS-CoV-2的复制(图S1B),在有效剂量下未观察到毒性(图S1C,D)。最后,我们检测了三种SARS-CoV-2变异株(α、β和γ),它们感染细胞的能力被CBD抑制(图1C).


当从其来源植物中分离出来时,天然非合成CBD通常与其他大麻素一起提取,代表了天然产物不可避免的残留复杂性(12)为了验证CBD确实对病毒抑制起作用,我们使用100%定量核磁共振(qNMR)分析了CBD参考标准品以及来自四种不同来源的CBD纯度。这些来源包括两个化学品供应商(供应商A和B)和两个商业供应商(供应商C和D)。实验之间惊人的一致性1核磁共振和新近建立的量子力学HiFSA(1H迭代全自旋分析)观察到的所有材料的剖面图证实了1)所使用的化合物确实是CBD,纯度至少为97%(图1B)大麻素含量不超过0.2%,且不高于0.2%。在病毒A549-ACE2感染试验中,对这些不同CBD样本的分析显示,ec50的范围在0.6-1.8μM之间,可能反映了生物检测的内在变异性(图1A)。在用于抑制病毒感染的剂量下,未观察到任何CBD制剂的毒性(图S1 E-G)。

CBD代谢物7-OH-CBD具有抗病毒活性,但不是一组密切相关的CBD同系物

CBD通常作为欧洲栗提取物,特别是与富含大麻植物的精神活性THC结合使用。因此,我们确定同源大麻素,特别是大麻植物产生的结构和极性密切相关的类似物,是否也能抑制SARS-CoV-2感染。值得注意的是,在这一组中,只有CBD是一种有效的药剂,而这些结构上密切相关的同源物没有或非常有限的抗病毒活性,这些同源物共享生物合成途径,形成了从中纯化的CBD的生物遗传学决定的残余复杂性欧洲栗:THC、大麻酚酸(CBDA)、大麻酚(CBD V)、大麻酚(CBC)或大麻酚(CBG)(图2 A、D;见方法)。在感兴趣的剂量范围内,这些大麻素对A549-ACE2细胞没有毒性(图S2)。值得注意的是,CBD与THC(1:1)联合使用显著抑制CBD疗效,与THC的竞争抑制一致。


CBD在肠道和肝脏中迅速代谢为两种主要的代谢物,7-羧基-大麻酚(7-COOH-CBD)和7-羟基-大麻酚(7-OH-CBD)。7-COOH-CBD水平高出40倍,7-OH-CBD水平为人血浆CBD水平的38%(15)CBD及其7-OH-CBD代谢物是治疗癫痫的有效等电位成分(13)与CBD一样,7-OH-CBD能有效地抑制A549-ACE2细胞中SARS-CoV-2的复制(图2C)对细胞无毒(图S2H,I)。对每天服用FDA批准的CBD溶液(Epidiolex)1500毫克的健康患者的血浆水平进行分析,结果显示,该药物的最大浓度(C最大值)7天时CBD和7-OH-CBD分别为1.7μM和0.56μM;C最大值与高脂肪食物共服可进一步提高数倍(15)总的来说,这些结果表明CBD及其代谢物的有效血浆浓度在抑制人类SARS-CoV-2感染的治疗范围内。

CBD在病毒进入细胞后的早期阶段起作用

CBD可能通过阻断病毒进入宿主细胞或在感染后的后期阶段起作用。据报道,CBD可降低包括A549在内的一些上皮细胞ACE2的表达(16)我们首先确定了CBD是否抑制了A549-ACE2、Calu-3和veroe6细胞中的SARS-CoV-2受体。ACE2的表达没有下降(图3A;图S4A,B)。此外,用SARS-CoV-2峰蛋白或水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白假型慢病毒的分析(17)结果表明,10μM-CBD对刺状病毒进入细胞的抑制作用较弱,提示其抗病毒作用主要是由其它机制引起的。通过使用抗spike抗体,可以有效地阻止spike伪型慢病毒感染,而不是VSVg,证实了该方法的稳健性(图3B和无花果。S3 A和B)。与病毒进入的微不足道的影响相比,CBD在感染后2小时和6小时抑制宿主细胞中SARS-CoV-2尖峰蛋白表达非常有效(约95-99%)(图3C)即使在有抗棘蛋白抗体以防止再感染的情况下也是如此(图3D)提示CBD在感染周期的早期,即进入后的步骤中起作用。在感染后15h,CBD对抑制SARS-CoV-2也有部分有效(约60%)(图3C)提示可能对病毒的装配和释放产生二次作用。为了评估CBD是否可能阻止病毒蛋白酶Mpro或PLpro处理病毒蛋白,我们测定了它们的活性体外(图S4C,D)。CBD不影响两种蛋白酶的活性,增加了CBD靶向宿主细胞过程的可能性。


CBD抑制病毒RNA表达,逆转病毒诱导的宿主基因表达变化

与这一解释相一致,经CBD处理24小时的受感染A549-ACE2细胞的RNA序列分析显示,SARS-CoV-2诱导的基因表达变化显著受到抑制。CBD有效地消除了病毒RNA在宿主细胞中的表达,包括编码穗蛋白、膜蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白的RNA(无花果。4 A和B)SARS-CoV-2和CBD均诱导细胞基因表达的显著变化(图S5和S6)。病毒感染后细胞的主要成分(PCA)基本恢复正常,而不是单纯治疗的细胞(图4C).使用Metascape进行的聚类分析揭示了一些有趣的模式和相关主题(图4D,无花果。S7和S8)。例如,病毒诱导的与染色质修饰和转录相关的基因(簇1)被CBD逆转,尽管CBD本身没有效果。同样,病毒对核糖体和中性粒细胞(第3类)基因的抑制作用在很大程度上被CBD逆转,但药物本身没有效果。这与第5和第6类不同,CBD单独诱导与宿主应激反应相关的基因的强烈激活。这些结果表明,CBD可以阻止病毒蛋白翻译和相关的细胞变化。

为了更好地了解CBD的特异性抗病毒作用,我们分析了未感染或SARS-CoV-2感染细胞的裂解产物中的rna序列,这些细胞用灭活的CBDV同源物处理24小时。用CBD病毒诱导的尖峰蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白的病毒基因诱导率仅为60%,而CBD的诱导率为99%(图5A,B)在A549-ACE2细胞中,CBDV治疗引起的转录组变化比CBD少,并且在逆转SARS-CoV-2诱导的转录变化方面基本无效(图5C).使用Metascape的聚类分析显示只有几个簇显示CBDV逆转了病毒转录组的变化(图5D)这些包括CBDV诱导的自噬和脂质代谢(第1类)以及受到CBDV抑制的蛋白质翻译/细胞周期/DNA复制(第3类)。


CBD诱导内质网应激反应和IRE1α活性是其抗病毒作用的关键机制

特别令人感兴趣的是与内质网(ER)应激反应、未折叠蛋白反应(UPR)和干扰素诱导相关的三组基因,它们被CBD选择性上调而不是CBDV上调(图6A)相反,与氧化应激反应相关的基因是由两种大麻素诱导的。当内质网蛋白折叠机械的工作负荷超过其能力时,细胞会经历内质网应激。在内质网应激下,分泌蛋白以未折叠的形式积聚在细胞器内,从而触发一系列称为UPR的细胞内信号通路,这是更大的细胞应激反应的一部分,维持整个细胞内的蛋白质稳态(18)UPR途径由三种ER跨膜蛋白(IRE1α、PERK和ATF6)控制,它们包含一个内质网管腔结构域,能够直接或间接地感知错误折叠的蛋白质。作为对内质网应激的反应,这些传感器中的每一个都会启动转录和翻译变化,从而增加蛋白质折叠能力,并试图恢复体内平衡。然而,如果内质网的压力是不可恢复的,UPR会转换输出信号并发出细胞死亡的信号。我们通过qRT-PCR(图S9A)验证了CBD诱导IRE1α、PERK和ATF6基因表达,与先前的报告一致(19)独创性分析证实CBD诱导UPR的作用明显大于CBDV(图S9B、S10B、S11)。

许多研究报告了令人信服的证据表明,不饱和蛋白反应是过度活跃的,并需要复制其他密切相关的冠状病毒家族成员(20,21)令人惊讶的是,尽管seq-1途径并没有被seqea单独激活(表1;无花果。S12、S13、S14)。相反,PERK在功能上被SARS-CoV-2和CBD激活。IRE1α是一种具有双功能激酶/内啡肽酶(RNase)活性的单程ER跨膜蛋白。作为对内质网应激的反应,IRE1α经历了寡聚和自磷酸化,这一过程通过变构激活其核糖核酸酶(RNase)来启动xbp1mrna的生产性剪接。剪接XBP1编码一种转录因子,可上调许多宿主应激反应,包括内质网伴侣诱导和内质网相关降解(ERAD)成分(22) (图6E).


比较普遍定期审议分支机构GSEA不另作说明转录组测序
换褶
CBD与模拟特权1.432.46
IRE1型1.382.29
ATF6ND公司*1.40
病毒vs mock特权1.921.85
IRE1型不丰富2.67
ATF6ND公司*0.91
CBD+病毒vs mock特权1.453.24
IRE1型1.442.76
ATF6ND公司*1.24

表1对CBD和/或SARS-CoV-2病毒应答的PERK、IRE1或ATF6基因表达和功能的诱导。

RNA-seq基因表达数据用于GSEA的三个GO术语“PERK介导的UPR”、“IRE1介导的UPR”和“ATF6介导的UPR”(基因本体编号3649836936500)。标准化富集分数显示在“GSEA NES”栏下(分数越高=富集程度越高)。PERK、IRE1和ATF6之间转录表达差异的折叠变化在“RNA序列折叠变化”列下显示。

*ND=由于没有足够的基因来获得可靠的数值而未确定。


CBD强烈激活IRE1αRNase活性,如分析XBP1剪接所示,使用RNAseq数据量化剪接的XBP1以及通过qRT PCR直接确认(图6B;图S15)。如前所述,CBD在病毒存在或不存在的情况下诱导XBP1剪接,而CBDV没有明显的作用,可以与单独的病毒相媲美。在没有病毒的情况下,CBD诱导XBP1剪接的时间过程和剂量-反应曲线与CBD抑制A549-ACE2细胞中病毒尖峰蛋白表达的时间过程和剂量反应曲线一致(图6C)此外,虽然IRE1α基因敲除对SARS-CoV-2感染没有显著影响,但它改变了CBD的剂量反应,显著降低了CBD的抗病毒作用,使其对SARS-CoV-2的EC50增加了约2倍(图6D;图S16)。这些结果表明,CBD诱导IRE1α是其抗病毒作用的重要组成部分。

CBD诱导干扰素表达作为其抗病毒活性的一部分

CBD抑制病毒感染和促进RNA降解的另一个机制是通过诱导干扰素信号通路。干扰素是宿主对病原体暴露最早的固有免疫反应之一(23)。如报告所示(24),SARS-CoV-2感染抑制干扰素信号通路(图7A,以及图S17)。该途径中有许多基因,如ISG15、IFIT1、IFIT3、SOCS1和OAS1,后者是一种干扰素诱导的基因,可导致RNase L活化和RNA降解(25),在病毒存在下,CBD单独作用下可适度上调(图7A无花果。第18、19节)。这些结果与CBD降低有效病毒滴度以使干扰素途径正常激活的可能性相一致。同时,CBD有效地逆转了病毒诱导的细胞因子,这些细胞因子在感染的后期会导致致命的细胞因子风暴(图7B)相反,不活跃的同源基因CBDV不会显著诱导干扰素途径中的基因或阻止细胞因子的诱导(图6A,7安,7摄氏度,图S20A、B和S21)。

为了直接测试干扰素可能部分解释CBD抗病毒活性的可能性,我们在2.5μM CBD治疗和病毒感染之前,将ACE2-A549细胞暴露于抗I型(α,β,ο)和II型(γ)干扰素的混合抗体中。结果表明,抗干扰素抗体降低了CBD的抗病毒作用,部分挽救了SARS-CoV-2感染(图7D)总的来说,这些结果表明CBD部分通过激活IRE1α和干扰素途径抑制SARS-CoV-2感染,导致病毒RNA降解和随后病毒诱导的宿主基因表达改变,包括细胞因子。

CBD治疗显著抑制SARS-CoV-2在小鼠体内的复制

包括阳离子两亲药物在内的几种药物可阻断SARS-CoV-2在培养细胞中的复制,但不能体内(26),我们确定了CBD是否降低了雌性K18-hACE2小鼠的病毒滴度(27)在用SARS-CoV-2(2x10)经鼻激发前,小鼠每天两次腹腔注射CBD(20或80 mg/kg),持续7天4PFU)。在挑战之后,CBD的管理继续每天两次,持续4天(图8A)CBD治疗在感染后第5天显著抑制了病毒在肺部和鼻甲的复制,呈剂量依赖性(无花果。8B-C段)低剂量CBD使肺和鼻甲的病毒载量分别降低4.8倍和3.7倍,而高剂量则分别使肺和鼻甲的病毒滴度降低40倍和4.8倍。在此期间,小鼠没有临床疾病迹象,体重也没有明显变化(图8D)这些结果证实了CBD作为SARS-CoV-2感染早期抗病毒药物的临床前疗效。


CBD的使用与SARS-CoV-2感染的适应症呈负相关

鉴于高纯度CBD制剂由大量个体服用,我们检查了CBD处方或使用的药物记录是否与SARS-CoV-2感染的适应症相关(即,阳性的COVID-19测试和/或接近COVID-19测试的COVID-19诊断)。口服CBD 100毫克/毫升溶液(CBD100)通常用于治疗癫痫发作(见患者分析补充资料)。全国COVID队列协作(N3C)1212例患者分析(28)有癫痫发作相关病史和CBD100的用药记录显示,6.2%(75名患者)的N3C数据显示,在他们的N3C数据中,有6.2%(75名患者)的症状是SARS-CoV-2感染。这一比率明显低于没有任何CBD100记录的匹配对照组患者(例如,CBD100患者为6.2%,非CBD100患者为8.9%,p=0.014;多变量logit模型优势比(OR)为0.65,p=0.009,95%C.I.[0.47,0.90])。CBD100患者的人口统计学和用药史与对照组相似。这些病人的病史包括癫痫发作相关的疾病,疾病预防控制中心的高危症状列表(29)以及其他潜在的混杂因素,如行动不便、慢性疼痛或发育障碍,这些都会限制公众互动和接触COVID-19。在对531名CBD100患者的亚组分析中,这种负相关更为显著,这些患者可能在第一次COVID-19测试之日服用CBD100(例如,这些CBD100患者中有4.9%,而531名匹配对照组中为9.0%,p=0.011;OR=0.48,p=0.006,95%C.I.[0.29,0.81])(图9;表S4患者分析补充资料,详细描述了患者数据分析方法和结果)。


讨论

我们的研究结果表明,CBD及其代谢产物7-OH-CBD在SARS-CoV-2感染的早期甚至晚期具有阻断作用。这一机制似乎部分通过激活IRE1αRNase和干扰素途径介导。除了这些基于细胞的发现,临床前研究表明,CBD治疗降低了SARS-CoV-2感染小鼠肺部和鼻甲的病毒滴度。最后,对一个国家样本患者进行COVID检测时有100毫克/毫升CBD消费记录的分析显示,与SARS-CoV-2阳性检测结果显著减少有关。这种负相关对许多敏感性分析(包括匹配和结果模型的变化)是可靠的,值得进一步研究CBD对抗SARS-CoV-2感染的潜力,例如在其他大型、多站点电子健康记录数据集或预期实验设计中进行验证。

CBD抗病毒活性的一个机制是在宿主对病毒病原体的免疫反应激活后直接或间接诱导干扰素途径。事实上,干扰素已经被临床测试为治疗COVID-19的潜在疗法(30)当严重的内质网应激过度激活时,IRE1α的RNase活性导致许多内质网局限性mRNAs(RIDD)的核内溶解衰变,随后激活RIG-I和干扰素(18)尽管SARS-CoV-2诱导了IRE1α的激酶活性,但在XBP1剪接监测到的RNase活性中没有激活。因此,CBD诱导的IRE1α的RNase活性可能是病毒RNA降解和RNA片段诱导干扰素产生的潜在原因。需要进一步的研究来确定CBD的抗病毒作用是否与ER应激反应有关。重要的是,CBD还能抑制病毒感染时细胞因子的激活,降低免疫细胞募集和随后肺部及其他受影响组织中细胞因子风暴的可能性。这些结果补充了先前的研究结果,即CBD抑制巨噬细胞等免疫细胞中细胞因子的产生(31)因此,CBD不仅有可能在感染的早期起到抗病毒作用,而且在感染后期保护宿主免受免疫系统过度活跃的影响。

CBD作为一种潜在的SARS-CoV-2预防剂具有许多优点。CBD作为一种THC含量小于0.3%的食品添加剂,广泛存在,无限制使用。通过合理的处方、质量控制和给药,CBD可以预防性地使用,而不是最近的抗病毒药物。CBD的摄入有多种可能,包括吸入和鼻腔给药。CBD阻止病毒进入细胞后的复制,因此,很可能有效地对抗带有突变棘蛋白的病毒变体。与雷米昔韦或抗病毒抗体等药物不同,CBD给药不需要在医院注射。最后,CBD只伴有轻微的副作用(32).

然而,在CBD被进一步考虑甚至作为COVID-19的治疗线索之前,有几个问题需要仔细检查(12)尽管市面上有许多CBD和CBD的产品,但它们在质量、CBD含量以及口服后的药代动力学特性方面存在很大差异,这些大多是未知的。CBD具有很强的疏水性,形成大的胶束结构,这些胶束结构被困在肝脏中并被分解,从而限制了口服给药后其他组织可获得的药物量。非活性载体和制剂佐剂对临床可获得浓度有显著影响。由于CBD在食用油中作为制剂广泛销售,我们分析了调味商业大麻油,发现在代表性样品中CBD含量仅为0.30%(图S22)。CBD的纯度和标记为CBD的材料的化学成分也很重要,特别是考虑到我们的研究结果,其他大麻素如THC可能起到对抗CBD抗病毒功效的作用。这基本上消除了大麻作为抗病毒CBD的有效来源的可行性,以及与其法律地位相关的问题。最后,其他CBD给药的方法,如呼吸机和吸烟,增加了对潜在肺损伤的担忧。

为了进一步评估CBD作为阻断SARS-CoV-2感染的治疗方法的前景,需要进一步研究CBD给患者的最佳方式以及临床试验。我们的动物研究为临床试验中评价CBD作为抗SARS-CoV-2治疗剂提供了临床前支持。我们提倡精心设计的安慰剂对照临床试验,使用已知浓度和高度特性化的配方,以确定CBD在预防和治疗早期SARS-CoV-2感染中的作用。必要的人体内浓度、最佳路线和配方仍有待确定。我们强烈警告,在目前可用的配方中,尤其是在不了解该天然产品的严格随机临床试验的情况下,将CBD作为预防或治疗药物的诱惑,包括食用药物、吸入剂或topicals(33).

材料和方法

研究设计

本研究的目的是确定从大麻植物中提取的天然产物大麻酚(CBD)是否具有抑制SARS-CoV-2感染细胞的潜力。为此,我们使用了三种不同的人类或猴子细胞系。我们测试了四种来自化学和天然来源的CBD独立制剂,也测试了相关的大麻素化合物和代谢物。我们用RNA-seq分析证明,与不活跃的大麻素CBDV相比,CBD能有效地清除感染细胞中的SARS-CoV-2病毒RNA,激活ER应激反应和XBP1剪接,诱导干扰素途径的表达,抑制病毒对细胞因子的诱导。我们用IRE1α敲除细胞和抗干扰素阻断抗体证明IRE1和干扰素都有助于CBD的抗病毒活性。最后,利用国家COVID队列协作组在适当的IRB协议下的人类患者组的医疗记录,我们分析了服用CBD的患者与SARS-CoV-2检测阳性风险的相关性。统计方法见图表和方法。

材料、细胞和病毒

高纯度CBD是从两家化工公司或两家在线商业渠道获得的。7-OH-CBD从Cerilliant公司(德克萨斯州Round Rock)购买。使用的所有商业化合物均经核磁共振验证,如下所述。含大麻素的大麻油含有1500毫克以上的大麻素,来自蓝鸟植物(路易斯维尔,科罗拉多州,美国)。大麻提取物欧洲栗生物质来自霍普施泰纳有限公司(美国华盛顿州亚基马市)。低CBD大麻油是从网上商业来源获得的。ta549-ACE2细胞由tenOever及其同事慷慨提供(24)Verate6和cells是从Calo6公司购买的。SARS-CoV-2(nCoV/Washington/1/2020)由Natalia Thornburg(疾病控制中心)通过新兴病毒和虫媒病毒参考中心(德克萨斯州加尔维斯顿)提供,并由BEI资源部提供体内研究。SARS-CoV-2变异体由BEI资源公司提供。α变异体为BEI编号NR-54000,从英格兰公共卫生部分离出hCoV-19/England/204820464/2020。β变异体是来自非洲卫生研究所的BEI编号54009,B.1.351(20H/501Y.V2)。γ变异体为BEI编号54982,来自日本国立传染病研究所的hCoV-19/Japan/TY7-503/2021。通过两次传代在VeroE6细胞中制备病毒储备,并通过限制VeroE6细胞上的稀释菌斑滴度来测定储备滴度(如下所述)。

SARS-CoV-2感染检测

所有SARS-CoV-2感染都是在芝加哥大学Howard T.Rickett区域生物污染实验室在生物安全等级3的条件下进行的。体内感染是在美国路易斯维尔大学区域生物污染实验室生物防御和新兴传染病预测医学中心的ABSL-3条件下进行的。DMEM+2%FBS中的细胞用CBD或其他抑制剂处理,或用2倍稀释液处理2小时,从10μM开始,每次试验三次。在含有适当浓度药物的培养基中,A549-ACE2细胞感染的MOI(多重感染)为0.5。在含有适当浓度药物的培养基中,感染veroe6细胞的MOI为0.1。48h后,用3.7%福尔马林固定细胞,封闭,用1:1000稀释的小鼠抗棘突抗体(GTX632604,GeneTex)探针4h,冲洗后用抗鼠HRP探针1小时,洗涤后用DAB底物培养10分钟。光镜下计数阳性细胞(n>40)为盲样。用菌斑法测定病毒滴度。简单地说,在37℃下用一系列的病毒样品稀释液感染E6细胞单层1小时。然后移除病毒接种物并用含有1.25%羧甲基纤维素的MEM覆盖介质代替。细胞孵育72小时后,去除覆盖培养基,用10%福尔马林固定,用0.25%结晶紫溶液染色。在稀释池中计数斑块,在10-100个斑块之间,并计算病毒样本的原始浓度。利用GraphPad棱镜对数据进行分析和绘图,并从响应曲线的非线性拟合中提取EC50值。

结晶紫毒性试验

在2%DMEM中用不同浓度的不同化合物处理细胞,从10μM开始,下降1/2,再稀释6次。细胞与药物孵育48小时。细胞用10%福尔马林溶液固定30分钟。然后用1%结晶紫溶液染色30分钟,然后干燥板,并通过在TECAN M200平板阅读器上测量595nm处的吸光度来评估结晶紫染色的量。将吸光度读数标准化为未经药物治疗的对照孔的吸光度读数,以测量有无药物治疗的细胞生长差异。

棘蛋白和抗体中和试验

A549-ACE2细胞在感染前2小时或感染后2、6、15小时用10μM的CBD处理。用0.5的MOI感染细胞2小时。然后,用含有CBD或DMSO的培养基代替感染培养基,并在37℃下培养16小时。在一个实验中,感染后2小时加入CBD,用CBD或DMSO和μM中和抗体(活性基序001414)代替感染介质。16小时后,用10%福尔马林固定样品,并用IHC法测定穗蛋白。中和抗体的效率通过在37°C下将400 pfu病毒(含或不含100μM抗体)培养1小时来测试。然后用该混合物感染A549-ACE2细胞16小时。如上文所述,对棘状阳性细胞进行量化。

干扰素抗体中和试验

A549-ACE2细胞在感染前2小时用2.5μM的CBD、1μg/ml的人IFN-γ抗体(MAB285-100)和1:25稀释的人Ⅰ型干扰素中和抗体混合物(PBL assety Science 39000-1)处理。然后用0.5moi感染细胞并孵育24小时,之后收集上清液并用上述菌斑试验测定活性病毒。

CRISPR-Cas9产生IRE1α基因敲除细胞

慢病毒库是利用带有单导RNA(sgRNA)的扁豆蛋白蛋白v2(Addgene)和针对IRE1序列(CGGTCACTCACCCCGAGCC)的慢病毒库。用4μg/mL嘌呤霉素培养基对感染的A549-ACE2细胞进行多克隆筛选和保存1周。

大麻素的描述

CBD可通过从大麻然后诱导植物原料发生化学脱羧反应,或通过植物原料或提取物中所含大麻素的脱羧,进而分离出CBD。cannadivarin(CBDV)是一种天然存在的CBD同源物n-丙酯代替CBDn-戊基侧链。大麻酚(CBG)以大麻酚酸的形式存在,是四氢大麻酚酸和CBDA的代谢前体欧洲栗四氢大麻酚(THC)是四氢大麻酚酸脱羧后得到的环化CBD同源物。THC存在于欧洲栗在两个Δ中9-独联体和Δ9-反式立体异构体。大麻素(CBC)以大麻酚酸的形式存在,代表第三种可能的大麻素酸代谢物,在香叶基残基中含有一个铬烯环。

大麻素类化合物的获取、分离与表征

在本研究中,从天然来源纯化CBD,使用(a)由Bluebird Botantials(路易斯维尔,CO,USA)生产的大麻素注入大麻油,每液体盎司含有1500毫克大麻素,中链甘油三酯,以及(b)用超临界流体萃取(SFE)和CO制备的大麻提取物2欧洲栗符合大麻资格的生物质,由霍普施泰纳有限公司(美国华盛顿州亚基马市)制造,CBD总含量为54.7%,按CBD+CBDa*0.877计算。这些CBD制剂的典型纯度在90–97%范围内,包括通过qHNMR测定的杂质(例如残留溶剂)。产品的详细结构分析目前在一本杂志上发表。简言之,方法可概括如下:

净化程序

CBD,CBC,CBG,Δ9-反式-THC,Δ9-独联体-采用离心分配色谱(CPC)、逆流分离技术和双相液-液溶剂体系从大麻油中分离出THC和CBDV,并从粗大麻SFE提取物中分离出CBDA。

结构解析法

商业来源的CBD和其他大麻素样品的身份通过1D验证1核磁共振氢谱分析,作为qNMR测量,通过与公布的CBD的真实HiFSA剖面进行比较(12).除了总体上的良好匹配外,H-4“ax的高度耦合指纹信号还作为高度特异性的身份标记。结合文献中的参考数据,结合1D/2D核磁共振和LC-HRMS分析,确定了商业来源或天然来源大麻素的结构。

核磁共振样品制备

对于作为溶液提供的商业样品,在真空和450μL氘化甲醇(MeOH)中小心地除去溶剂-d4)用精密注射器加入残留物中。用玻璃移液管将溶液转移到5-mm核磁共振管中,用25μL溶剂冲洗小瓶三次,然后将冲洗液转移到同一个核磁共振管中,最终体积为525μL。将商业和分离样品作为固体直接称重到5-mm核磁共振管中,并使用精密注射器添加500μL溶剂。为了分析商业大麻油制剂,将10滴(0.25毫升相当于14-15滴)直接加入到5毫米核磁共振管中。在0.01mg精密天平上测定了大麻油在核磁共振管中的净重为198.50mg,并加入了0.90mg二硝基苯甲酸作为内标;325μL氯化镉和10μL镉增加了外径,并对管道进行了火焰密封。

核磁共振数据采集与处理及qNMR评价

全部1核磁共振数据是在Bruker 600 Avance III双通道上获得的13直接低温探头。时域(TD)设置为64k,弛豫延迟(D1)为60秒,90度激励脉冲用于32次信号平均扫描。所有样品的接收器增益(RG)为32,除了一个质量限制样品<1mg(RG=101)和大量大麻油样品(RG=2;使用15度激励脉冲)。用100%qNMR方法和公开发表的工作表,用定量核磁共振法(qNMR)测定大麻油中的样品纯度和CBD含量(https://gfp.people.uic.edu/qnmr/content/qnmr计算/100p.html)所有CBD样品的qNMR纯度均>97%,含杂质,且在1.0%以上的样品中未检出大麻素类同系物。采用绝对qHNMR内标法(IC-abs-qNMR)测定大麻油中CBD的含量为0.30%。

假型慢病毒产生

293 T和293 T-ACE2细胞在DMEM(康宁10017CV)和1倍丙酮酸钠(Gibco 11360070)和10%FBS(HyClone SH30910)中培养。用SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1)spike蛋白或VSV-G假定型的慢病毒颗粒如所述(19)简单地说,用第三代慢病毒包装载体(HDM-Hgpm2、HDM-tat1b、pRC-CMV-Rev1b)、转移载体(噬菌体-CMV-ZsGreen-W)和SARS-CoV-2尖峰(HDM-IDTSpike fixK)或VSV-G(HDH-VSVG)转染293个T细胞。转染后36小时和60小时收集的上清液混合,注射器过滤并冷冻在一次性使用的小份中?80°C。用于慢病毒生产的所有质粒均由Jesse Bloom博士(西雅图华盛顿大学)提供。

假病毒结合试验

293个T-ACE2细胞接种于1.2×104每96个孔的细胞在黑色壁上,干净的底板。第二天,在二甲基亚砜中制备2倍稀释度的CBD储备液(10 mM),然后在完全DMEM或假病毒制剂中制备1:1000稀释液。SARS-CoV-2棘状假病毒未稀释,VSV-G假病毒在完全DMEM中稀释1:1500。细胞和假病毒分别在37℃下用CBD稀释液预处理2小时和1小时。细胞被假病毒感染72小时,用4%多聚甲醛固定,用核标记物(hoechst33342,ThermoFisher H3570)染色并成像。293个T-ACE2细胞由jessebloom博士(西雅图华盛顿大学)慷慨提供。

假病毒中和试验

293t或293t-ACE2细胞接种于1.2×104每96个孔的细胞在黑色的壁上,干净的底板。第二天,将SARS-CoV-2尖峰中和抗体(Sino Biological 40592-R001)在完全DMEM中稀释至300 ng/100ul/96孔,随后进行3倍稀释。中和抗体与假病毒孵育1小时。37℃时,细胞被假病毒感染+/?中和抗体72小时,用4%多聚甲醛固定,用核标记物hoechst33342染色并成像。

蛋白酶抑制试验

在室温下,在96孔黑色平板中,在25°C条件下进行两次测定。在pH值为7.3的Tris HCl中,含有不同浓度抑制剂(10或50μM)和3CLpro酶(0.4μM)或PLpro酶(0.3μM)的反应培养约5分钟。然后用TVLQ-AMC探针底物(40μM)引发3CLpro反应,用LKGG-AMC探针底物(40μM)引发PLpro反应。线性摇动反应板5 s,然后在协同作用下测量随时间(1 min-3 h)的荧光发射强度(激发λ:364 nm;发射λ:440 nm)。每个分析包含2-3个阳性对照孔(DMSO)和2个阴性对照孔(不含蛋白酶的分析成分)。在3h时将数据标准化至阳性对照井,并将其指定为任意值100。

免疫印迹法

A549-ACE2细胞经CBD、载体(DMSO)处理或24小时不处理。首先用冰冷的PBS清洗细胞。通过在4℃下用添加蛋白酶抑制剂(Roche 4693159001)、PMSF(Roche 10837091001)和磷酸酶抑制剂(GB-450)的Laemmli样品缓冲液(Bio-rad 1610747)直接溶解细胞制备全细胞提取液。蛋白质样品最终在98℃下煮沸5分钟。用ACE2抗体(Abcam 108252)和α-微管蛋白(invitrogenma1–19401)作为对照,进行免疫印迹。为了验证A549-ACE2中IRE1α基因敲除,使用了细胞、IRE1α抗体(细胞信号,3294S)和GAPDH(细胞信号,5174S)。用Licor-Odyssey-Fc对印迹进行成像和定量。

RNA测序

用人血管紧张素转换酶2(ACE2)蛋白稳定地高表达肺泡A549细胞,每孔接种10000个细胞。将大麻酚或载体加入细胞中。用二甲基亚砜(Sigma-Aldrich,D2650-100 mL)将大麻酚(Cayman Chemical,90080)溶解在10 mM储备溶液中。CBD的最终浓度为10μM。然后去除病毒储备,并用含药物的2%FBS-DMEM培养基代替。在提取总RNA之前,将细胞培养24小时,然后使用NuclearSpin 96 RNA试剂盒(Takarabio,740709)。每个实验条件下进行三次独立的生物复制,总共有12个RNA样本。RNA样本质量检查、文库构建和测序由芝加哥大学基因组学研究所按照标准协议进行。平均RNA完整性评分为8.9。所有12个样本通过NovaSeq 6000测序仪进行两次测序,以产生成对的末端100 bp读数。两个来自FASTQ下游的样本流在处理前合并为两个样本流。如上所述,从大麻油中分离出cannadivarin(CBDV),并与CBD进行了相同的研究。CBDV样本的RNA完整性平均得分也为8.9。

使用本地Galaxy 20.05实例分别分析了CBD和CBDV处理细胞的RNA序列数据(34).使用Trim-Galore对原始测序读数执行质量和适配器修剪!0.6.3款(35).使用RNA STAR 2.7.5b将读数映射到人类基因组(UCSC hg19带GENCODE注释)和SARS-COV-2基因组(NCBI组件ASM985889v3,Ensembl注释)(36)。根据featureCounts 1.6.4计算每个样本的映射读取数(37)生成每个基因的读取计数。使用DESeq2 1.22.1分析原始计数在实验条件下的差异表达(38),并生成标准化的基因表达矩阵和样本的PCA图。

通过观察者的基因组片段数,选择1.9个(39)使用对齐读取来自RNA星的数据(见上文)。XBP1读取的总次数按上面的featureCounts计数。对于每个样本,通过将包含选择性剪接位点的读数除以总的XBP1读数来确定相对的XBP1剪接。

qRT-PCR

用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher,4368813)从RNA样品中合成cDNA。在分子生物学级水中稀释cDNA样本,并使用Applied Biosystems PowerUp SYBR Green Master Mix(ThermoFisher,A25776)在罗氏LightCycler 96仪器上进行qRT PCR实验。结果用Roche LightCycler 96软件进行分析。RPL13A作为参考基因。使用了以下引物对(基因名:正向引物、反向引物):

ERN1:CCGAACGTAGTCGCTACTTCCT、CGCAAGTCTCTTCTGCTCCACA。

EIF2AK3:gtcccaaggcttggaatctgtc,cctaccagagagagttctgg。

ATF6:CAGAGAGTACCAACGCTTAGCC、GCAGACTCCAGGGTGTGGAG。

IFIT1:gccttgctgaaggtggagaa,atccaggcgataggatc。

IFIT3:CCTGGAATGCTTACGGCAAGCT、GAGCTCTGCCCAA。

ISG15:CTCTGAGCCATCCTGGTGAGA,AAGGTCAGCCAGAACAGGGTCGT。

OAS1:aggaaggtgctctcgaggtag,ggactgaggaggagagacaacaggt。

SOCS1:ttcgctctagcgtgaagtgg,tagtgccagcagctcgagaga。

备选拼接XBP1:gctgagtcgcagggt,ctgggtccagttgtccagaat。

总计XBP1:tgaaacagagtagcagctcttaactc。

RPL13A:CTCAaggtgtgttgaggcatcc,联系TCCAGCAACCGTGAG。

可变基因聚类

选取前5000个变异最大的基因,用Morpheus软件分析归一化后的基因表达数据(https://software.broadinstitute.org/morpheus).对涉及CBD和SARS-CoV-2的RNA序列实验的基因表达数据采用6个聚类的K均值聚类,对涉及CBD和SARS-CoV-2的RNA序列实验的基因表达数据采用5簇K均值聚类。对于每个基因,所有样本的标准化表达值通过减去平均值并除以标准差进行转换。转化后的基因表达值用于生成热图。

XBP1剪接分析

qRT-PCR用于定量剪接型XBP1(XBP1s)的相对表达,方法是使用特定的引物对人类选择性剪接的XBP1和总的XBP1(引物序列如上所述)(40)通过计算XBP1与总XBP1信号的比值,确定XBP1的选择性剪接的相对百分比(%XBP1s)。

创新途径分析

表达式数据(日志2折叠改变)和预测的基因激活状态被叠加到干扰素信号通路和内质网应激通路的地图上。数字是通过使用IPA(QIAGEN公司)生成的。用Morpheus软件分析基因的标准化表达值(log2)。对于每个基因,所有样本的标准化表达值通过减去平均值并除以标准差进行转换。转化后的基因表达值用于生成热图。IPA预测的RNA-seq数据中相关通路的激活z评分也由Morpheus软件绘制。

基因集富集分析

为了确定6个聚类的主题,使用Metascape对每个聚类中的基因进行功能基因集富集分析(41)选择以下类别进行富集分析:GO分子功能、KEGG功能集、GO生物过程、典型途径和KEGG途径。Metascape的其他参数:最小重叠=3,p值截止值=0.05,最小富集度=1.5。确定病毒感染时CBD逆转哪些活性的基因集,输入基因列表包括被病毒显著下调的基因(差异表达比较veh infect vs veh mock,q值截止0.01),同时也被CBD显著上调(差异表达比较CBD感染vs veh infect,q值截止0.01)。第二个列表包括被病毒显著上调的基因(比较veh infect与veh mock的差异表达),同时也被CBD显著下调(比较CBD感染与veh感染的差异表达)。使用相同的Metascape方法对这两个基因列表进行基因集富集分析。同样的分析也在RNA序列实验中进行,包括CBDV和SARS-CoV-2的差异表达数据,q值截止值为0.05。GSEA v4。使用1.0对基因本体论术语PERK介导的未折叠蛋白应答和IRE1介导的未折叠蛋白应答进行特定的基因集富集分析,这些数据来自于涉及CBD和SARS-CoV-2的RNA-seq实验(42,43).

小鼠CBD治疗与SARS-CoV-2攻击

9至11周龄雌性K18-hACE2小鼠(27)从杰克逊实验室购买(库存034860)。驯化后,小鼠接受CBD治疗(20或80mg/kg),每日两次腹腔注射,体积为0.1ml。每次治疗前立即制备注射溶液。首先,将供应商D的CBD粉末溶解在100%乙醇中。然后将CBD溶液与Cremophor EL(Millipore Sigma 238470)和PBS溶液按1:1:18的比例混合。以1:1:18混合100%乙醇、克莫泊尔EL和PBS制备溶媒注射溶液。对于每一次注射,CBD的最终量为每公斤小鼠体重20毫克或80毫克,具体取决于治疗组。对照组仅用溶媒治疗或不接受治疗。治疗7天后,麻醉所有动物,并通过鼻内滴注0.05 ml的2 x 10^4 pfu的SARS-CoV-2(nCoV/Washington/1/2020)激发。激发后,CBD治疗继续每天两次,持续4天。每天两次监测小鼠临床疾病的发展情况。每天测量一次体重。在病毒攻击5天后,所有动物被人道地安乐死,收集鼻甲和肺组织。组织在无菌PBS中使用手持式组织匀浆器(Omni International)进行均质,并储存在?病毒滴定80°C。

TCID法从小鼠组织中提取SARS-CoV-2病毒50化验

Vero E6细胞(ATCC#CRL-1586)以20000个细胞/孔的密度接种到96个孔的平底组织培养板(Nunc)中,并在37°C和5%CO下培养过夜2以及湿度。匀浆组织在4℃下以8000 rpm离心10 min,收集上清液并连续稀释10倍(最多10?7)在病毒生长培养基中(DMEM含有5%的FBS和1%的抗生素/抗真菌溶液)。隔夜培养后,用PBS冲洗细胞板两次,并将连续稀释液一式四份添加到每个孔中。在37°C的温度下,在加湿的培养箱中用5%的CO培养板23天后,用含10%中性福尔马林的0.1%结晶紫染色,并对细胞病变(CPE)发展进行评分。TCID50剂量按Reed和Muench法计算(44)并校正每克肺匀浆的重量。路易斯维尔大学动物管理委员会批准了所有动物护理工作。所有与SARS-CoV-2活病毒有关的工作都得到了大学机构生物安全委员会的批准,并在生物安全三级控制范围内进行。

病人资料分析

所有患者数据分析均由国家COVID队列协作组织和芝加哥大学生物科学部机构审查委员会(IRB21–0591)批准,由于研究人员无法轻易确定研究参与者的身份,因此他们同意放弃同意,研究人员不与参与者联系,也不会重新确认参与者的身份。患者数据分析方法和结果的详细说明见患者分析补充资料。

统计分析

数据显示为平均值±标准差。对于RNA序列差异表达分析,使用DESeq2版本1.22.1,校正最小FDRP值(Q值)对于涉及CBD和SARS-CoV-2的RNA序列实验,显著性阈值为0.01;对于涉及CBD和SARS-CoV-2的RNA序列实验,显著性阈值为0.05。在基因集富集分析中,Metascape的使用量最小P值显著性阈值为0.05。对于药物治疗的EC50计算,使用GraphPad Prism软件对四个参数进行非线性曲线拟合。Prism还用于非配对t检验和单因素方差分析,其统计学意义为p<0.05。有关患者数据统计分析方法,请参阅《患者分析补充》的统计分析部分。


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