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寄生虫感染宿主之后，可以将虫体所在的周围组织通过激光显微切割技术切割捕获下来用于后续的转录组测序、蛋白质谱研究，为更好地揭示寄生虫感染宿主后引起的宿主免疫应答机制提供更加均质和精准的样本。
寄生虫感染宿主之后，可以将虫体所在的周围组织通过激光显微切割技术切割捕获下来用于后续的转录组测序、蛋白质谱研究，为更好地揭示寄生虫感染宿主后引起的宿主免疫应答机制提供更加均质和精准的样本，保证组学的数据更加客观、可靠，真实地还原生物体内发生的生物学过程。
近期，Macha´ček T等人在PLoS Pathog上发表了“Mechanisms of the host immune response and helminth-induced pathology during Trichobilharzia regenti (Schistosomatidae) neuroinvasion in mice”的文章，通过毛毕吸虫感染小鼠的实验模型，进行了从行为测试到“组学”的分析，研究了毛毕吸虫感染宿主的过程中所引起的宿主免疫反应及其病理机制。
该研究中，作者建立了毛毕吸虫感染小鼠的实验模型，进行了从行为测试到“组学”的分析（图1），首先通过常规体重或行为学的一些检测，探究了寄生虫感染对小鼠行为和运动的影响；其次通过对感染脊髓中寄生虫的DNA载量，特异性抗体以及免疫细胞的检测，鉴定了寄生虫感染所引起的炎症反应；另外通过组织学分析和流式细胞术检测，对寄生虫在不同感染时间段的炎症反应和免疫细胞群类型进行了分析；最后也通过转录组和蛋白组的分析，对感染小鼠和未感染小鼠脊髓中差异表达基因和蛋白进行鉴定，并通过免疫组化和显微成像的方式进行验证。
图1. 实验流程图。未感染小鼠和感染小鼠的测试及分析流程总结。
首先，通过建立毛毕吸虫感染的小鼠模型，并对其进行分析发现，毛毕吸虫感染会触发外周免疫并侵入中枢神经系统，尤其是脊髓，从而导致小鼠运动功能的缺陷。紧接着，作者对脊髓进行了组织学检测，以阐明受影响最严重的中枢神经系统段的感染过程（图4），结果发现，在感染7天时，能够检测到位于白质中的完整的毛毕吸虫个体，随着时间的延长，会导致嗜酸性粒细胞的外渗，最终在感染28天时可达到消除寄生虫的效果。而在整个感染期间，嗜酸性粒细胞是浸润整个神经系统数量最多的细胞，很有可能是消除寄生虫的必要条件。
图4. 毛毕吸虫感染脊髓前后不同时间段的组织学检测。
在随后的研究中，作者进一步对感染及未感染寄生虫的脊髓进行了转录组和蛋白组学的研究。通过转录组分析发现，受感染的脊髓中，其转录本涉及的信号通路都与免疫系统相关，也进一步表明，在寄生虫感染的过程中产生了寄生虫特异性的抗体，从而来抵抗或者消除毛毕吸虫的侵袭。另外，基于转录组数据发现，小鼠脊髓的感染也与神经生理通路的下调有关。
为了更好地了解迁移虫体附近的生物学过程，作者用MMI厂家的SmartCut Plus激光显微切割系统对离迁移虫体100 μm以内的小鼠脊髓节段白质组织进行了激光显微切割和捕获，体积为7.5×106μm³，并对其进行了质谱分析（图8）。结果，在感染和未感染的脊髓中共鉴定出1690种蛋白质，其中，在感染的脊髓中发现了15种蛋白质，包括一些可能参与宿主免疫反应的蛋白；在未感染的小鼠中发现了另外的35种蛋白，主要是与细胞骨架和细胞信号通路有关。总的来说，激光显微切割捕获的感兴趣的特定位置小鼠脊髓组织蛋白组学分析表明，在感染7天时，寄生虫周围已经存在宿主免疫反应激活的标记物，其中精氨酸酶是M2型的小胶质/巨噬细胞中最丰富的蛋白。另外，基于蛋白组学的研究还发现，迁移的血吸虫在饮食中没有选择性，因为在它们的消化道中检测到与神经组织和宿主免疫系统有关的蛋白质混合物。
图8.毛毕吸虫脊髓组织的蛋白质组学分析。(A)感兴趣区域的示意图；(B) 激光显微切割捕获寄生虫周围100μm内的小鼠脊髓组织；(C)激光显微切割神经组织的蛋白质组学分析总结。
除此以外，作者还借助免疫组化和2D/3D成像等实验方式对转录组和蛋白组研究中鉴定到的差异表达基因和蛋白进行了进一步的验证。
总之，这篇文章全面地研究了毛毕吸虫侵入小鼠脊髓后的病理和免疫应答机制，神经生理功能的显著下调导致感染小鼠的运动缺陷，宿主的免疫反应以嗜酸性炎症为主，可消除感染。精氨酸酶的大量产生，也可能会防止广泛的组织损伤。由于毛毕吸虫在寄生虫学、免疫学或病理学上与人类神经病原体的相似性，因此，为进一步研究神经感染提供了合适的实验模型。
关于MMI用于寄生虫的研究在之前也有相关文献发表（如下图所示），通过MMI CellCut激光显微切割系统用于禽变形嗜血杆菌和疟原虫的单血期和卵母细胞的分离，并成功地用于DNA的分离、扩增和测序，为开发多种核遗传标记设计引物提供重要信息。
值得注意的是，通过激光显微切割技术可以在可视化状态下有目的性地选择感兴趣的特定位置的组织或细胞，保留了其空间位置信息。通过下游的转录组学、基因组学、蛋白组学等组学手段，可以更加精准地研究相应组织的基因表达、基因变异以及蛋白质组等，更加真实地揭示组织中发生的生物学过程及机制。
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德国Molecular Machine & Industries (MMI)是专门致力于将显微操作技术与高精度激光技术相结合应用于生命科学领域的一家专业公司，其标志性产品MMI CellCut激光显微切割系统和CellEctor单细胞挑选系统成为目前世界上性能优异的均质样本/单细胞获取平台。基因有限公司作为MMI在中国区合作伙伴，可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑、售后安装、应用培训、联系试用等。
参考文献
[1]Macha´ček T, Leontovyč R, Sˇmı´dova´ B, Majer M, Vondra´ček O, Vojtěchova´ I, et al. (2022) Mechanisms of the host immune response and helminth-induced pathology during Trichobilharzia regenti (Schistosomatidae) neuroinvasion in mice. PLoS Pathog 18(2): e1010302. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302
[2] Palinauskas V, Dolnik OV, Valkiūnas G, Bensch S. Laser microdissection microscopy and single cell PCR of avian hemosporidians. J Parasitol. 2010 Apr;96(2):420-4. doi: 10.1645/GE-2247.1. PMID: 20001098.
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