Iso-seq全长转录组测序发现参与光形态建成的可变剪接事件

时间:2023年1月30日
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台湾中央研究院Shu-Hsing Wu研究团队利用PacBio Iso-seq全长转录组测序技术对拟南芥转录本异构体进行了精确和全面的描述,并在实验上证实了拟南芥光形态发育中具有调控功能的AS异构体的存在。

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光开关对植物幼苗光形态发育有重要作用,使幼苗获得光合能力和生存适应性。光信号通过不同的光感受器被感知,触发了下胚轴伸长、顶端钩和子叶开放的抑制等。这些生理变化是光诱导的转录组和翻译组通过在转录、转录后、翻译和翻译后水平上的基因表达调控的结果。选择性剪接(Alternative splicing, AS)是一种重要的转录后调节机制,确保转录组的可塑性,以实现植物的最佳发育和对环境刺激的适当响应。然而,传统RNA测序技术读长短,极大地限制了全长剪接异构体的精确测定。在拟南芥中,超过60%的多外显子基因发生AS,其中许多基因可产生多个剪接异构体。只有零星的研究报道了这些AS异构体在光响应和光形态建成中的生物学功能。

台湾中央研究院Shu-Hsing Wu研究团队利用PacBio Iso-seq全长转录组测序技术对拟南芥转录本异构体进行了精确和全面的描述,并在实验上证实了拟南芥光形态发育中具有调控功能的AS异构体的存在。

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1. 测序数据

研究人员使用PacBio Iso-seq对4天大的黄化苗经4小时黑暗(D4h)或4小时光照(L4h)处理后的RNA进行了测序。

在D4h和L4h条件下,分别获得了73,746和88,303个高质量的全长reads。并且,测序所得的转录本大多数在当前注释转录本的5 '和/或3 '端有序列扩展(图1)。由此可见, Iso-seq 高质量全长reads能提供更加完整的全长转录组库。

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图1. 显示5' UTR、3 ' UTR长度的箱形图

在D4h和L4h数据集中分别鉴定出21,197和23,743个基因模型。其中约30%为Iso-seq鉴定出的新的基因模型,有671个基因此前未在TAIR10中注释(图2)。

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图2. TAIR10、Iso-seq和新(TAIR-10未注释)基因模型中的基因数量

作者还研究了TAIR10无注释基因模型的独特AS事件是否具有剪接连接中的典型二核苷酸特征(GU-AG)。结果显示,79.4%的Iso-seq基因模型具有规范的拼接位点(GU-AG)。与其他长读测序数据比较发现,Iso-seq数据集的结果(79.4%、88.9%)显著高于Nanopore直接RNA测序数据集的31%(图3)。纳米孔基因模型中典型剪接位点比例低可能是测序错误未校正的结果。

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图3. 三个长读测序数据集中鉴定的独特AS事件中典型GU-AG剪接位点的分析

综上所述,该研究中获得的高质量基因模型显著增加了去黄化过程中表达的转录组的完整性。

2. 新识别的转录本

Iso-seq结果识别的671个无注释转录本的平均长度为962 bp,最长和最短的转录本分别为2796和332 bp。在671个新转录本中,此前通过纳米孔测序从2周龄拟南芥RNA中检测到122个。

在这671个新转录本中,546个(81%)具有单外显子,125个(19%)具有多外显子。在35个(5%)多外显子新基因模型中发现了AS异构体。作者分析了AS的主要类型的发生频率,包括内含子保留(intron retention,IR)、可变供体(altD)和可变受体(altA)位点、外显子跳跃(exon skipping,ES)、隐蔽型内含子(cryptic intron,CI)和隐蔽型外显子(cryptic exon,CE)。大约30%的AS异构体有altA或altD位点,CE、CI和ES分别占AS异构体的1%、10%和5%,IR是最常见的AS异构体(34%)。对于D4h和L4h样本,30%的AS转录本具有多个AS事件(altA/D、CE/CI、ES、IR或混合AS类型)(表1)。

表1. 由Iso-seq标识的AS事件的数量、频率和类型

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下图即为来自At3g09600的同一基因的多个转录本异构体(图4),作者通过RT-PCR验证了这些AS异构体的存在。At3g09600编码了一个昼夜节律时钟相关的MYB转录因子REVEILLE 8 (RVE8)。

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图4. At3g09600 (RVE8)基因模型

在转录本数据中,有202个基因显示了跨越TAIR10中单独注释转录本的序列证据。这些可能是转录起始/结束位点(TSS/TES)、转录通读或TAIR10中注释错误的结果。图5显示了分别跨越At4g32780和At4g32785、At4g18590和At4g18593的融合转录本的例子。由此可见,Iso-seq可以帮助改进目前对拟南芥基因组的注释。

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图5. 具有融合转录本的新基因模型

综上所述,该 Iso-seq数据集有助于识别由AS引起的全长转录本异构体以及广泛存在的基因融合事件,极大地扩展了转录组的多样性,并为未来转录过程、结构、稳定性及其对去黄化过程的贡献的机制研究提供了丰富的序列资源。

3. AS异构体的功能研究

AS异构体可以编码蛋白质异构体,以扩大蛋白质组储备,从而在植物发育中发挥调节功能。那么,以上发现的可变剪接是否会影响后续的发育过程呢?

为了评估AS是否在光形态发育中起调节作用,作者重点研究了具有IR (最常见的AS形式)的基因座编码转录因子(transcription factors ,TF)。TF通常作为同二聚体或异二聚体发挥功能。作者假设,一个TF IR异构体可以与其注释的蛋白形成异二聚体,从而发挥调控作用。

作者主要研究了两种AS剪接异构体BBX22IR、BBX24IR(图6),通过在野生型拟南芥中过表达HA标记的BBX22IR和BBX24IR来表征BBX22IR和BBX24IR的生物学功能。

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图6.两种AS剪接异构体BBX22IR和BBX24IR

BBX22是光形态建成的正调控因子。黑暗条件下,4天大的野生型(WT)和过表达BBX22IR的转基因植物之间没有显著的表型差异(图7左)。然而,在连续光照4天下,HA-BBX22IR的下胚轴明显短于WT,因此HA-BBX22IR对光敏感(图7右)。BBX22IR和BBX22一样,可能在光形态发生过程中作为光介导的下胚轴伸长抑制的正向调节因子。

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图7. 野生型(WT)和HA-BBX22IR转基因株系在黑暗(左)或连续光照(右)下的生长情况

BBX22IR在光形态发生中的积极作用可能依赖于与BBX22的异二聚体,或者BBX22IR的同二聚体来发挥后续的生物学功能。BBX22同二聚体可促进抑制下胚轴伸长的目标基因的表达。BBX22在长时间光照下的会发生光降解,然而BBX22IR蛋白水平却不会受到选择性降解的影响。当BBX22发生降解之后,BBX22和BBX22IR结合形成的异二聚体或BBX22IR同二聚体会替代BBX22同二聚体发挥作用,正调控光形态建成(图8)。

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图8. BBX22IR在光形态发生发育中的功能模型

而在BBX24IR的研究中,作者检测了3个HA-BBX24IR过表达系和WT在黑暗(左)或光照(右)条件下4天的幼苗去黄化表型(图9)。HA-BBX24IR表达增加的幼苗在光照下比WT的下胚轴明显更短,在黑暗中生长时没有观察到明显差别。

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图9. 野生型(WT)和HA-BBX24IR转基因株系在黑暗(左)或连续光照(右)下的生长情况

HA-BBX24IR幼苗的光敏感表型表明,与BBX24在光形态形成发育中的消极作用相比,BBX24IR在这一过程中起着积极的调节作用。如在光形态发育过程中BBX24IR对BBX24的主要负作用的模型(图10)所示,BBX24与BBX24IR所形成的异二聚体不能促进后续目标基因的表达。

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图10. BBX24IR在光形态发生发育中的功能模型

综上,作者研究并证实了BBX22IR和BBX24IR蛋白异构体可以分别与其注释的蛋白BBX22和BBX24相互作用,以调节光形态建成。光形态建成的正调控因子BBX22和负调控因子BBX24的表达分别在转录、转录后和翻译后水平上受到复杂的调控。BBX异构体的各种稳定性和功能可以对光形态发育进行高度多变的调控,以响应不断变化的光环境。

Summary

PacBio Iso-seq成功地加强了植物生长发育过程中转录本异构体的鉴定。在上述研究中检测到的基因模型中,超过三分之一是新的基因模型或之前在拟南芥基因组中未注释的基因模型。PacBio HiFi reads 既长且准,能获得准确的全长转录本异构体信息,允许对每个测序的转录本进行AS、alt-TSS/alt-TES或选择性多聚腺苷酸化(Alternative polyadenylation,APA)的准确注释,从而能够明确地确定基因结构,进行调节元件或蛋白质编码的功能分析。

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原文链接:https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-022-02620-2

基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商,自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内,一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训,技术支持,应用培训与售后维护工作,赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

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