NMDA受体中钙通透性与镁阻滞的分子机制

赫布神经可塑性被认为是学习和记忆的细胞基础，其发生依赖于突触前神经递质释放与突触后去极化时Ca2+内流的巧合检测。这一过程在分子水平上由N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体（NMDAR）介导，该受体结合谷氨酸和甘氨酸，并在膜去极化解除Mg2+通道阻滞时促进Ca2+内流。然而，NMDAR中Ca2+通透性和Mg2+阻滞的结构机制尚未完全阐明。研究人员利用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）证明，Ca2+通过阳离子选择性过滤器的狭窄收缩区涉及部分脱水，这由数个Ca2+结合位点证实。相比之下，Mg2+通过水网络结合在选择性过滤器外部并保持水合状态，从而充当通道阻滞剂。此外，选择性过滤器周围的脂质网络以电压依赖性方式影响Mg2+结合的稳定性。该研究详述了启动神经可塑性的跨膜化学机制。

研究人员针对NMDAR介导赫布可塑性中Ca²⁺通透与Mg²⁺电压依赖性阻滞的结构机制不明这一长期存在的问题，选取具有高Ca²⁺通透性和Mg²⁺敏感性的GluN1a-2B NMDAR亚型，利用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）结合局部精修技术，解析了激动剂结合状态下Ca²⁺和Mg²⁺存在时的高分辨率结构，并结合分子动力学（MD）模拟与双电极电压钳（TEVC）电生理学实验，揭示了离子识别与阻滞的分子基础。该研究成果发表于《Nature Neuroscience》。

关键技术方法包括：利用冷冻电镜解析GluN1a-2B NMDAR在结合激动剂（甘氨酸和谷氨酸）及不同阳离子（CaCl₂、MgCl₂或无二价阳离子加EDTA）条件下的三维结构，通过局部精修获得跨膜域（TMD）2.3Å至3.0Å的分辨率；采用分子动力学模拟计算不同膜电位下Mg²⁺与天冬酰胺笼（Asn-cage）残基的距离分布；利用双电极电压钳技术记录爪蟾卵母细胞表达的野生型及突变体NMDAR的电流-电压关系，分析Mg²⁺阻滞的浓度效应与电压依赖性参数（IC₅₀、V₅₀、δ）。

研究结果如下：

Cryo-EM captures several calcium sites within the NMDAR channel pore

研究人员通过冷冻电镜在阳离子选择性过滤器内捕获了至少五个Ca²⁺结合位点（State-1至State-5）。这些位点位于由GluN1a Asn616和GluN2B Asn615-616构成的“天冬酰胺笼”（Asn-cage）内。结构显示Ca²⁺在穿过狭窄收缩区时需与Asn侧链直接或间接相互作用，经历部分脱水过程，从而揭示了Ca²⁺的渗透路径。在无二价阳离子（EDTA处理）的样本中未观察到相应密度，证实了这些位点对应Ca²⁺离子。

Two magnesium binding sites around the selectivity filter

与Ca²⁺不同，研究人员仅在选择性过滤器外观察到两个明确的Mg²⁺结合位点：位于Asn-cage上方的“上位”点和下方的“下位点”。上位点的Mg²⁺保持水合并通过水分子网络与GluN1a Asn616和GluN2B Asn615间接作用，无法进入并穿越狭窄的Asn-cage。下位点的Mg²⁺则位于细胞内入口处。由于Mg²⁺脱水所需能量远高于Ca²⁺，导致其无法像Ca²⁺那样部分脱水并通过孔道，从而表现为通道阻滞剂。Asn残基的突变显著改变了Mg²⁺阻滞的效力和电压依赖性。

A lipid network surrounds the NMDAR pore and affects voltage-dependent Mg²⁺block

研究人员发现两个磷脂（PL1和PL2）对称地结合在GluN1a-GluN2B界面，紧邻Asn-cage的“背部”。分子动力学模拟表明，在存在脂质的情况下，Mg²⁺在静息电位（-70 mV）下比在去极化电位（0 mV）下更接近Asn-cage，显示出电压敏感性；而在无脂质模型中这种电压依赖性消失。这表明紧密结合的脂质参与了电压敏感的Mg²⁺阻滞调控。

Mutations on lipid-binding residues affect Mg²⁺block

研究人员对脂质结合口袋周围残基进行定点突变，电生理学分析显示这些突变显著改变了Mg²⁺阻滞的IC₅₀值和电压依赖性（V₅₀和δ值）。根据突变影响的电压特异性，可分为影响所有测试电压、仅影响-60/-40 mV以及仅影响-20 mV的组别。荧光尺寸排阻色谱（FSEC）证实突变体仍保持四聚体结构，排除了因蛋白折叠错误导致的功能改变，表明脂质微环境通过局部结构变化调节Mg²⁺阻滞。

讨论部分总结指出，本研究提出的分子机制是：NMDAR的Asn-cage能够通过直接与Ca²⁺配位并使其部分脱水从而促进Ca²⁺通透性；而Asn-cage无法使Mg²⁺脱水（此过程能耗远高于Ca²⁺），导致Mg²⁺以水合形式结合在选择性过滤器外部，形成电压依赖性的通道阻滞。研究鉴定出的两个Mg²⁺结合位点（上位点和下位点）分别对应胞外和胞内的阻滞位点。此外，研究发现脂质网络（PL1和PL2）是NMDAR蛋白结构的组成部分，能够响应电场变化诱导Asn-cage残基的局部构象改变，进而调节Mg²⁺的结合与电压敏感性。最后，研究比较了NMDAR与AMPA受体（AMPAR）在QNR位点孔径上的差异，指出NMDAR的狭窄孔径强制Ca²⁺脱水，而AMPAR孔径较大可能允许Ca²⁺不脱水通过，揭示了两者钙渗透机制的根本不同。