肝转移是结直肠癌（CRC）患者死亡的主要原因。为解析其潜在机制，研究人员对三名结直肠癌肝转移（CRLM）患者的配对原发结直肠肿瘤、癌旁组织及肝转移灶，以及三名非转移性CRC患者的肿瘤和癌旁组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。分析显示，与非转移性患者相比，CRLM患者中烯醇化酶2阳性（ENO2+）癌细胞显著富集。功能表征结合生物信息学及小鼠模型表明，ENO2+癌细胞表现出增强的上皮-间质转化（EMT）表型，是CRLM的关键驱动因子。机制上，ENO2蛋白在癌细胞内直接与巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）结合，通过抑制C末端Hsc70相互作用蛋白（CHIP）介导的泛素化降解来稳定MIF。这种ENO2-MIF相互作用激活了MIF信号通路，促进了强有力的肿瘤细胞-巨噬细胞串扰，从而驱动M2巨噬细胞极化，空间转录组学证实了ENO2+癌细胞与M2巨噬细胞的共定位。类器官和体内模型均证实，CRC细胞中的ENO2通过MIF通路诱导M2巨噬细胞极化，进而促进肝转移。敲除ENO2可显著抑制小鼠模型中的肿瘤生长和肝转移。ENO2-MIF相互作用抑制剂吡硫氧（pyrithioxin）能有效减轻小鼠的肝转移负荷。综上，该研究确定ENO2通过稳定MIF以协调M2巨噬细胞极化，是CRLM的关键驱动因子，凸显了ENO2-MIF轴作为CRLM治疗策略的潜力。
论文解读：ENO2-MIF轴驱动结直肠癌肝转移的免疫代谢调控机制
研究背景与意义
结直肠癌（CRC）是全球第三大恶性肿瘤，肝转移是导致患者死亡的首要原因，超过70%的CRC相关死亡由肝转移引起。尽管手术、化疗及免疫治疗取得了进展，微卫星稳定（MSS）型CRC对单药免疫检查点阻断疗法存在原发性耐药，患者五年生存率仍低于20%。肝脏转移微环境是一个动态重塑的生态系统，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），特别是免疫抑制性的M2极化亚群，是促进转移定植的关键架构师。然而，肿瘤细胞究竟释放何种信号启动并维持这种病理性重编程，仍是领域内亟待解决的关键科学问题。近期研究提示，糖酵解酶如烯醇化酶2（ENO2）除其经典代谢功能外，还具有调节基因转录和蛋白稳定性的非代谢“兼职功能”，但ENO2是否作为CRLM中基质细胞串扰的枢纽仍未可知。本研究旨在通过对配对原发灶与转移灶的单细胞图谱解析，揭示ENO2在CRLM中的核心作用及机制，相关成果发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
关键技术方法概述
本研究主要采用以下关键技术：首先，收集3例非转移性CRC患者和3例CRLM患者的配对临床样本（包括原发灶、癌旁组织及肝转移灶），进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）构建细胞图谱；其次，利用生物信息学模块分析识别转移倾向性癌细胞亚群；第三，应用分子生物学手段（如Co-IP、GST pull-down、分子对接及定点突变）验证ENO2与巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）的直接互作及结构基础；第四，通过体内外共培养系统及流式细胞术评估巨噬细胞极化状态；第五，构建脾内注射及皮下移植瘤小鼠模型评估ENO2对肝转移及肿瘤生长的影响；最后，采用计算机虚拟筛选结合体内药效实验验证ENO2-MIF相互作用的小分子抑制剂。
研究结果
单细胞图谱揭示肝转移病灶恶性程度增高
通过对CRLM患者配对样本的单细胞测序分析，研究人员发现肝转移灶中的癌细胞相较于原发灶表现出显著的恶性特征。具体而言，转移灶癌细胞显示出更高的拷贝数变异（CNV）评分，同时伴随着增殖驱动基因和缺氧反应基因的转录上调。功能分析进一步证实，转移部位的癌细胞具有更强的增殖能力和缺氧适应能力。这表明肝转移灶形成了一个独特的、具有高基因组不稳定性及恶劣微环境的生态位。
基于模块分析的转移倾向性癌细胞亚群发现
研究人员通过模块分析模型对癌细胞进行聚类，识别出“Module 11”基因集与转移特征高度吻合。在TCGA-COAD数据集中，该模块内的多个基因与CRC不良预后显著相关。进一步分析显示，原发肿瘤中的癌细胞亚群3表现出明显的上皮-间质转化（EMT）特征。这些数据共同指向一个具有转移启动潜能的特定癌细胞亚群，其特征即为高表达包括ENO2在内的特定基因谱。
ENO2驱动转移进程并作为治疗靶点
从“Module 11”和癌细胞亚群3中筛选出10个候选基因，多因素Cox回归分析仅显示ENO2是显著的预后决定因子。临床样本验证证实ENO2在CRC原发灶及肝转移灶中高表达，且与患者生存负相关。体内实验表明，敲除ENO2可显著抑制C57BL/6 J小鼠皮下成瘤及脾内注射后的肝转移结节形成。药理学抑制ENO2（ENOblock）同样有效阻断了其促转移功能。多重免疫荧光显示ENO2缺失导致E-钙粘蛋白（E-cadherin）丢失和波形蛋白（vimentin）获得减少，证实其通过诱导EMT促进转移。
ENO2通过与MIF直接互作协调M2巨噬细胞极化
CellChat细胞通讯分析显示，ENO2+ 癌细胞是微环境中MIF信号通路的主要信号枢纽，与巨噬细胞的通讯显著增强。机制上，Co-IP联合质谱、GST pull-down及分子对接模拟证实ENO2与MIF存在直接的物理结合。破坏预测的互作界面可完全消除两者的结合。这解释了为何ENO2+ 癌细胞能特异性地向巨噬细胞发送强效的MIF信号。
ENO2通过抑制泛素介导的降解稳定MIF
邻近连接试验（PLA）证实了细胞内源性ENO2-MIF互作。功能上，敲低ENO2导致MIF蛋白水平下降，而过表达则增加MIF丰度。蛋白酶体抑制剂MG132处理可逆转这一现象，提示ENO2通过干扰泛素-蛋白酶体途径稳定MIF。进一步研究发现，ENO2通过抑制E3连接酶CHIP介导的MIF多聚泛素化，阻止其降解，从而增强下游STAT3和NF-κB（p65）的磷酸化激活。
ENO2诱导M2巨噬细胞极化驱动肝转移
空间转录组学揭示了ENO2+ 癌细胞与M2样巨噬细胞在转移灶中的显著共定位。体外共培养和患者来源类器官（PDOs）模型显示，ENO2高表达的癌细胞能显著诱导巨噬细胞向M2表型（CD206high /CD86low ）极化，反之亦然。体内救援实验表明，MIF抑制剂ISO-1或M2极化抑制剂LPS可消除ENO2过表达引起的促转移效应；而IL-4或MIF过表达则可挽救ENO2敲除导致的转移抑制。这确立了ENO2-MIF-巨噬细胞轴在体内外的因果联系。
ENO2招募HSP90拮抗CHIP介导的MIF泛素化降解
质谱鉴定到热休克蛋白90（HSP90）是ENO2的互作蛋白。Co-IP证实ENO2作为支架招募HSP90至MIF。由于CHIP是已知靶向HSP90客户蛋白进行降解的E3连接酶，研究人员发现ENO2通过竞争性抑制CHIP与MIF的结合，阻断其对MIF第66位赖氨酸（K66）的泛素化修饰，从而保护MIF不被降解。
鉴定并验证吡硫氧作为ENO2-MIF互作抑制剂及其体内抗转移效应
基于计算机虚拟筛选，研究人员从6723个小分子中筛选出吡硫氧（pyrithioxin dihydrochloride）作为潜在的ENO2-MIF互作抑制剂。该化合物能破坏ENO2与MIF的结合，增加MIF泛素化。分子动力学模拟显示其与互作界面稳定结合。体内实验证明，口服吡硫氧（10或20 mg/kg）能显著减少MC38细胞诱导的肝转移结节数量，降低生物发光信号，并抑制肿瘤组织中MIF、p-STAT3及p-P65的表达水平。
讨论与结论
本研究揭示了CRLM的新机制：ENO2结合MIF，抑制其CHIP介导的泛素化降解，从而激活MIF通路，诱导M2巨噬细胞极化，驱动免疫抑制和转移增殖。这一机制依赖于ENO2+ 癌细胞与M2巨噬细胞的共同参与。研究不仅重新定义了ENO2作为一种信号支架连接肿瘤代谢重编程与免疫逃逸的功能，还鉴定了ENO2-MIF相互作用的小分子抑制剂吡硫氧，为干预肝转移提供了有效的临床前概念验证。该研究强调了靶向肿瘤-免疫细胞互作界面在治疗难治性CRLM中的转化潜力。
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