细胞内蛋白质接触位点图谱揭示甲型流感病毒感染期间paraspeckles被劫持

甲型流感病毒（IAV）在感染期间劫持宿主细胞机制，但许多宿主-病毒蛋白质相互作用仍未表征，特别是在其天然环境中。研究人员应用了细胞内交联质谱（in-cell cross-linking mass spectrometry, XL-MS），结合结构建模和功能分析，绘制了IAV感染的人细胞中蛋白质-蛋白质接触位点。这揭示了之前未识别的病毒-宿主相互作用，这些相互作用与空间组织过程相关。研究人员识别了与病毒表面糖蛋白血凝素（haemagglutinin, HA）的特定糖型成熟相关的宿主因子，通过膜结合的内质网-高尔基体系统。在细胞核中，研究人员观察到在多个细胞系中paraspeckles（相分离的无膜区室）的逐渐解体。机制上，病毒核蛋白（nucleoprotein, NP）和非结构蛋白1（non-structural protein 1, NS1）与宿主paraspeckle蛋白相互作用，病毒核酸内切酶PA-X降解paraspeckles内包含的长链非编码RNA，病毒RNA聚合酶II（RNA polymerase II, Pol II）被抑制，驱动paraspeckle破坏，从而释放促进IAV复制的宿主因子。这些发现揭示了IAV在感染期间利用和重塑宿主区室的机制。

**甲型流感病毒-宿主蛋白质接触位点的原位解析与副斑点劫持机制**

**研究背景与问题**
甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）作为全球性健康威胁，其复制依赖于多达14种病毒蛋白与宿主因子之间的蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interactions, PPIs），这些相互作用通常局限于细胞区室和细胞器。然而，在天然细胞环境中，许多IAV-宿主PPI仍未被表征。现有研究多采用亲和纯化-质谱（affinity purification–mass spectrometry, AP–MS）和酵母双杂交等方法，但这些技术依赖裂解细胞，破坏了天然细胞结构，且无法提供相互作用位点的原子分辨率结构信息。因此，亟需一种能够在原位捕获动态、空间解析的病毒-宿主接触位点的方法，以揭示IAV如何利用和重塑宿主细胞区室，从而为抗病毒策略提供新靶点。

**研究概述与结论**
为了克服上述局限，研究人员应用了细胞内交联质谱（in-cell cross-linking mass spectrometry, XL-MS）技术，结合基于AlphaFold的结构建模和功能分析，系统绘制了IAV感染的人肺上皮细胞（A549）中病毒-宿主蛋白质接触位点。该研究首次在天然细胞环境中获得了数百个病毒-宿主蛋白对的残基-残基接触位点（距离在40 Å以内），揭示了此前未被识别的病毒-宿主相互作用。关键发现包括：IAV通过核蛋白（nucleoprotein, NP）和非结构蛋白1（non-structural protein 1, NS1）与宿主paraspeckle蛋白相互作用，病毒核酸内切酶PA-X降解paraspeckles的结构性长链非编码RNA NEAT1_2，以及病毒RNA聚合酶II（RNA polymerase II, Pol II）的抑制，三者协同驱动paraspeckles（相分离的无膜核区室）的逐步解体。Paraspeckle的破坏释放了促病毒宿主因子，从而增强IAV复制。该研究发表于《Nature Microbiology》，为理解IAV如何在亚细胞器水平上操纵宿主机制提供了空间解析的蓝图，并揭示了病毒劫持宿主的新机制。

**关键技术与方法**
研究人员采用结构宿主-病毒相互作用组分析（structural host–virus interactome profiling, SHVIP），该方法结合了细胞内交联质谱（in-cell XL-MS）与生物正交非天然氨基酸标记（L-homopropargylglycine, HPG），以富集新合成的病毒蛋白。感染IAV（A/WSN/33 H1N1株）的A549细胞在感染后5–14小时进行HPG标记，随后使用DSSO（disuccinimidyl sulfoxide）交联剂处理，通过点击化学富集标记蛋白，胰酶消化后经强阳离子交换（SCX）和尺寸排阻色谱（SEC）分级，最后用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析。此外，结合AlphaFold2-multimer、AlphaFold 3及AF3x、GRASP进行结构建模，并通过近接连接实验（proximity ligation assay, PLA）、短干扰RNA（siRNA）功能筛选、荧光原位杂交（FISH）、CRISPR–Cas9基因敲除、定量PCR（qPCR）和深度定量糖蛋白组学（DQGlyco）等方法进行验证。样本来源包括人A549、Calu-3、HeLa细胞、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）及原代人支气管上皮细胞（HBEpCs）。

**研究结果**

**1. Mapping IAV–human contact sites using in-cell cross-linking**
通过SHVIP方法，研究人员在IAV感染的人A549细胞中，以2%假发现率（FDR）阈值得到了包含13,588个独特残基对交联的数据集，涵盖2,015种蛋白质，其中110个病毒-病毒和867个病毒-宿主交联，涉及9种病毒蛋白和139种宿主蛋白。该网络与已知IAV感染周期相关宿主因子（如RAB11A、KHSRP、TDP-43等）高度重叠，且与功能基因本体（Gene Ontology）术语（如RNA加工、剪接、运输、未折叠蛋白反应等）一致，证明了其在天然细胞环境中捕获相互作用的能力。

**2. Extensive in-cell cross-linking network**
进一步分析显示，交联网络中的宿主蛋白亚细胞定位与病毒蛋白功能匹配，优于以往AP–MS研究（如参考文献13、15、26）中出现的定位不一致现象。例如，M2、HA和NA等膜蛋白在以往研究中常被报道与核内因子相互作用，而本研究的in-cell XL-MS数据则呈现更合理的定位。此外，将宿主-宿主交联映射到蛋白质数据库（PDB）结构，发现93%的交联残基Cα-Cα距离在DSSO约束的40Å以内，验证了交联数据的结构可靠性。

**3. In situ validation of selected host–IAV interactions by proximity ligation assay**
研究人员通过PLA对选定的病毒-宿主蛋白对（如NP–FUS、NS1–hnRNPK、HA–ERP29、M2–SLC3A2等）在IAV感染细胞中进行了原位验证。所有测试的病毒-宿主对均产生可重复的PLA信号，高于单抗体背景和阴性对照，信号强度从弱（如M1–ANP32A）到强（如NP–SFPQ）不等，确认了这些接触位点的存在。

**4. Cross-linking network and short interfering RNA screening reveal host factors and functional hypotheses**
基于交联网络，研究人员对33个宿主基因进行了siRNA功能丧失筛选，发现其中15个基因显著影响IAV复制（以萤光素酶活性为指标）。例如，RPL35和RPL10A敲低降低复制，而SLC3A2（与M2交联）敲低则增加感染，提示其具有限制作用。此外，NP–hnRNPM相互作用通过AlphaFold模型获得高置信度预测，并在后续独立研究中被证实，表明SHVIP策略可有效识别关键宿主因子。

**5. The steps of the early secretory pathway of HA mapped by XL-MS**
HA交联网络重建了其从内质网（ER）到高尔基体的早期分泌途径。HA与ER伴侣蛋白CANX、CALR、PDIA3、ERP29及TMX1交联，与ER-高尔基体中间区（ERGIC）的凝集素LMAN1和LMAN2交联，以及与高尔基体酶B4GALT1和TM9SF2交联。通过siRNA敲低和深度定量糖蛋白组学（DQGlyco）分析，研究人员发现LMAN2、B4GALT1和TM9SF2敲低后HA的糖基化发生位点特异性改变，且TM9SF2敲低导致HA总量减少并向高甘露糖型富集，揭示了这些因子在HA成熟中的具体作用。

**6. IAV proteins interact with paraspeckles and disrupt their integrity**
通过空间蛋白质组学分析，研究人员发现IAV相关宿主蛋白在核体（尤其是paraspeckles）中显著富集。SHVIP鉴定出NP和NS1与14种paraspeckle蛋白（如NONO、SFPQ、PSPC1、FUS等）存在交联。FISH实验显示，在IAV感染（WSN株）后4–8小时内，A549、Calu-3、MEFs、HeLa及原代HBEpCs中paraspeckle数量显著减少，NEAT1_2信号变异系数（CV）降低。类似现象在H1N1/California/pdm09和H3N2/Aichi/68株感染中也被观察到，表明该效应具有广谱性。

**7. Disruption of paraspeckles enhances IAV replication by liberating proviral host factors**
机制研究表明，单独表达NP或NS1即可降低paraspeckle数量，而PA-X过表达则通过降解NEAT1_2（其序列中含有139个PA-X切割基序GCUG）导致paraspeckle解体。Pol II抑制剂α-amanitin处理也可破坏paraspeckle，但时间延迟（20小时），提示Pol II抑制在后期发挥作用。功能上，NEAT1、NONO或FUS的敲除或敲低可增强IAV复制（2–2.5倍），而NONO过表达则抑制病毒。AP–MS分析表明，感染后原本与NONO结合的paraspeckle蛋白（如hnRNPK、SFPQ等）转而与NP和NS1结合，释放这些促病毒因子。因此，IAV通过三重机制（NP/NS1蛋白质相互作用、PA-X介导的NEAT1_2降解、Pol II抑制）破坏paraspeckle，释放宿主因子以促进自身复制。

**总结与讨论**
本研究利用in-cell XL-MS技术，在天然细胞环境中绘制了IAV-宿主蛋白质接触位点图谱，获得空间解析的相互作用网络。与AP–MS和酵母双杂交不同，该方法保留了生理性相互作用并捕获了晚期感染特异性接触。研究发现HA通过ER-高尔基体途径中多个伴侣和酶（如LMAN2、B4GALT1、TM9SF2）进行位点特异性糖基化成熟，并揭示了IAV广泛破坏paraspeckles的保守机制。讨论部分指出，paraspeckle解体不仅释放促病毒RNA结合蛋白（如SFPQ、hnRNPK等），还可能抑制抗病毒免疫应答。研究结论（翻译原文结论部分）：总之，我们的工作提供了一个独特的天然IAV-宿主PPI资源，以及一个蓝图，展示了如何通过整合in-cell XL-MS、功能分析和结构建模来解析病毒-宿主界面的天然空间和结构组织，并揭示病毒颠覆和宿主细胞扰动机制。