非伤寒沙门氏菌利用含有钼辅因子（molybdenum cofactor, MOCO）的MopB或二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）还原酶家族成员，在感染期间呼吸多种化学底物，包括甲酸盐、硝酸盐和甲硫氨酸亚砜（methionine sulfoxide）。DmsABC酶复合物编码一种这样的DMSO还原酶，以促进氧化应激抵抗。沙门氏菌基因组编码多个基因旁系同源物，但它们在毒力中的作用尚不清楚。在此，研究人员表征了三种沙门氏菌MopB家族胞外硫酸盐还原酶，称为Xsr1A、Xsr2A和Xsr3A。在小鼠和巨噬细胞中的感染实验表明，这些硫酸盐还原酶支持沙门氏菌在肠道和全身感染期间的生长和毒力，对抗宿主呼吸爆发活性的氧化效应。进一步实验表明，它们是不依赖钼辅因子的酶，而是依赖附近的氧化还原活性[4Fe–4S]辅基进行催化活性。这些硫酸盐还原酶的同源物在远缘进化分支中被发现，表明[4Fe–4S]依赖的催化可能发生在普遍存在的MopB超家族中。研究人员的发现为广泛分布的MopB超家族中氧化还原中心的模块化进化提供了见解。
**研究背景与问题**
非伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）在宿主肠道和巨噬细胞中面临氧气（O₂）匮乏的环境，需利用热力学上不利的末端电子受体（如硝酸盐、四硫酸盐、甲硫氨酸亚砜）维持呼吸。这些还原酶属于古老的二甲基亚砜（DMSO）还原酶超家族（MopB），其成员在宿主内不仅参与能量代谢，还通过还原甲硫氨酸亚砜等底物帮助沙门氏菌抵抗吞噬细胞NADPH氧化酶产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）。沙门氏菌基因组编码四个dmsA旁系同源物（STM14_1809、STM14_1811、STM14_3103、STM14_5178），其功能此前未知。研究人员旨在阐明这些旁系同源物在沙门氏菌毒力中的作用及其催化机制。该研究发表于《Nature Microbiology》。
**主要技术方法**
研究采用λ-Red同源重组构建沙门氏菌基因缺失突变株（包括Δ4、Δ5等），通过口服和腹腔注射感染C57BL/6小鼠（含链霉素预处理或未处理）及Cybb
−/−小鼠（缺乏吞噬细胞NADPH氧化酶gp91
phox亚基）评估毒力；利用腹腔巨噬细胞杀伤实验分析氧化应激抗性；生化方法包括膜分离、苄基紫精（benzyl viologen）氧化监测酶活性、电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance, EPR）波谱分析[4Fe–4S]簇；系统发育分析采用最大似然法（LG+F+R6模型）和RelTime-ML分子钟定年。
**研究结果**
**DmsA旁系同源物促进肠道和内脏定植**
通过竞争性感染实验，Δ4菌株（缺失全部四个dmsA旁系同源物）在口服或腹腔注射后在小鼠肠道和深部组织中的定植能力显著减弱，表明这些基因产物增强沙门氏菌在肠道和全身感染中的适应性。单突变体分析显示，STM14_1809和STM14_5178对全身组织毒力的贡献大于STM14_1811和STM14_3103。在Cybb
−/−小鼠或巨噬细胞中，ΔSTM14_1809和ΔSTM14_5178菌株恢复毒力，提示这些基因产物在吞噬细胞NADPH氧化酶产生的氧化环境中提供选择性优势。Δ4菌株对H₂O₂的敏感性高于任何单突变体，且过表达单个旁系同源物能恢复H₂O₂抗性，表明这些酶协同抵抗氧化应激。
**DmsA旁系同源物促进胞外硫酸盐利用**
与野生型相比，缺失STM14_1809、STM14_3103或STM14_5178的菌株在MOPS-葡萄糖（GLC）培养基（硫酸盐为唯一硫源）中生长不良，而补充硫代硫酸盐或硫化氢（H₂S）可恢复生长。Δ4菌株胞内亚硫酸盐浓度低于野生型，表明这些酶参与硫酸盐利用。
**DmsA旁系同源物是胞外硫酸盐还原酶**
膜酶活性测定显示，Δ4菌株膜组分缺乏硫酸盐还原活性，而表达单个旁系同源物（STM14_1809、STM14_3103、STM14_5178）可恢复部分活性；STM14_1811则无此功能。胞质提取物中硫酸盐还原酶活性正常，表明这些酶定位于膜外（周质）。TAT分泌系统（twin-arginine translocation）突变（ΔtatABC）或缺失分子伴侣DmsD均导致膜硫酸盐还原酶活性丧失，证实这些酶经TAT分泌至周质。此外，这些酶可利用泛醌或甲萘醌作为电子供体，且不依赖ATP，与胞质CysIJ途径不同。因此，研究人员将STM14_3103、STM14_5178和STM14_1809编码的复合物分别命名为xsr1ABC、xsr2ABC和xsr3ABC（胞外硫酸盐还原酶）。
**Xsr3A依赖[Fe–S]而非MOCO辅因子**
尽管Xsr3A保留与DmsA相似的Mo-配位丝氨酸残基（Ser199），但该残基突变（S199G）不影响硫酸盐还原活性；缺失MOCO合成所需moaABCDE操纵子同样不影响Xsr活性。EPR分析显示，硫酸盐可氧化Xsr3A的[4Fe–4S]簇（而非DmsA的簇），且缺失Asn66或桥连Arg105（参与[4Fe–4S]配位）会完全消除Xsr3A的硫酸盐还原活性和EPR信号，表明该[4Fe–4S]簇是硫酸盐还原的催化位点。
**Xsr硫酸盐还原酶促进硫同化**
Δ4菌株在H₂O₂胁迫下生长受抑更严重，补充亚硫酸盐可完全恢复生长。Xsr酶缺失导致H₂S生成减少，而补充亚硫酸盐可恢复H₂S水平。H₂S通过促进半胱氨酸合成间接支持[4Fe–4S]簇生物发生，Δ4菌株中NADH脱氢酶I（NDH-I）和谷氨酸合酶（GOGAT）活性降低，表明Xsr介导的硫酸盐同化有助于维持氧化还原平衡和铁硫簇功能。
**DmsA旁系同源物在MopB谱系中广泛存在**
系统发育分析（基于3,324个MopB催化亚基）显示，DmsA_EC（DmsA-like extracytoplasmic catalytic subunits）同源物分布于多种细菌和古菌门，包括放线菌门、厚壁菌门和γ-变形菌纲。Xsr1A、Xsr2A、Xsr3A和DmsA分属不同进化支，其中Xsr3A与肠杆菌科-红蝽菌目（Coriobacteriia）类群形成姐妹支。分子钟定年提示DmsA_EC辐射始于早元古代，而沙门氏菌Xsr3A在晚古生代-中生代分化。[4Fe–4S]配位基序分析显示，不同催化机制（MOCO依赖与不依赖）可共享相同半胱氨酸间隔类型，表明功能分化不必然伴随辅因子配位几何改变。
**讨论与结论**
讨论部分指出，胞外硫酸盐还原酶通过同化硫酸盐产生H₂S，帮助沙门氏菌拮抗吞噬细胞NADPH氧化酶的氧化产物，并抑制肠道菌群。与胞质CysIJ途径不同，非伤寒沙门氏菌因引发中性粒细胞和巨噬细胞氧化应激，对硫酸盐同化需求更高，而伤寒沙门氏菌因荚膜和长O抗原限制NADPH氧化酶组装，其xsr基因已发生假基因化。研究人员发现，MopB超家族中[4Fe–4S]依赖的催化机制并非沙门氏菌特有，而是广泛存在于DmsA_EC进化支中，反映了氧化还原中心在进化中的模块化可塑性。研究结论翻译为：“研究人员的发现为广泛分布的MopB超家族中氧化还原中心的模块化进化提供了见解。”
