编辑推荐：
真核DNA复制机制的研究进展
张艳丽， 杨克恭， 陈松森
(中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院，北京 100005)
关键词：SV40;DNA聚全酶；复制
中图分类号：Q591.3 文献标识码：A
人们对原核细胞DNA复制机制早已有较深入的了解，但对真核细胞DNA复制机制的认识，直到90年代中期才比较清楚。
SV40 DNA复制系统是研究真核染色体DNA复制的理想体系。在SV40 DNA复制系统中由病毒编码的唯一的复制因子是T抗原，其余的复制因子全依赖于宿主细胞。利用纯化的蛋白质或人细胞抽提物在体外重新构建SV40 DNA复制体系，可以细致、深入地研究真核DNA复制的起始、延伸和滞后链的成熟。
1. 在DNA复制的起始至延伸阶段发生DNA聚酶α/δ转换
哺乳动物细胞有5种DNA聚合酶(α、β、γ、δ、ε)。由于DNA聚合酶α在真核细胞中含量最多，并且它的一个亚基具有引发酶活性，人们曾有较长一段时期认为它是真核细胞唯一的DNA复制酶[1]
。后来，增殖细胞核抗原(PCNA)作为复制因子被分离并鉴定为DNA聚合酶δ的所依赖的进行性因子，DNA聚合酶δ的功能才引起了人们的重视。深入研究复制因子RFC和PCNA的特性，发现DNA聚合酶α和δ都参与DNA复制[2]
。直到90年代初，人们普遍接受的是假说认为，DNA聚合酶α和δ都参加了真核细胞DNA复制，两者的分工是：DNA聚合酶α负责合成滞后链的全部和前导链的RNA引物及其5'端有取胜的一小段DNA(即initiator
DNA或iDNA,起始DNA)，而DNA聚合酶δ负责合成前导链的绝大部分，仅在前导链的合成起始阶段发生DNA聚合酶α向δ
的转换[3、4] 。
然而，从90年代初开始，人们就对上述假说产生了怀疑，有证据显示，完成滞后链合成的是DNA聚合酶δ而非DNA聚合酶α，即在冈崎片段的合成中也发生DNA聚合酶α/δ转换，主要的实验依据有：
(1) 1991年Bullock等发现，如果在体外SV40 DNA复制起始反应中加入抗PCNA血清，冈崎片段((200nt)就不会出现。这一结果强烈提示，滞后链上iDNA的延伸需要依赖PCNA的DNA聚合酶δ(或ε)[5]。
(2) 1998-1991年，Roberts研究了SV40 DNA复制忠实性，发现前导链和滞后链复制的准确性相似，提示这两条链主要由具有校正功能的DNA聚合酶合成。然而，DNA聚合酶α无3´→5´核酸外切酶活性，如果仅仅由它催化合成滞后链，则碱基错配频率将至少增加30倍[6、7]。
(3) 1994年，Waga和Stillman利用纯化的蛋白质构建含SV40 DNA复制起点的质粒DNA复制系统，对该系统的研究直接显示DNA聚合酶δ参加滞后链的合成。当DNA聚合酶δ（或PCNA，或RFC）从复制系统中消失时，冈崎片段的平均长度显著减小，且闭环DNA产物不再产生。
为了研究DNA聚合酶α和δ如何共同合成冈崎片段，Waga和Stillman设计了一个实验，于体外模仿滞后链合成。结果显示，RFC、PCNA和DNA聚合酶δ可在复制蛋白（RPA）的存在下延伸冈崎片段，但当加入RFC和PCNA时，DNA聚合酶α就被取代，不能再继续合成DNA，提示在滞后链的每个冈崎片段合成中，都有DNA聚合酶α/δ的转换[8、9]。
有充分的证据显示，冈崎片段与前导链的合成起始制明显相似，均由DNA聚合酶α合在DNA引物及iDNA,形成RNA-DNA引物，然后DNA聚合酶α转换为DNA聚合酶δ，再由DNA聚合酶δ负责延伸冈崎片段及前导链。DNA聚合酶δ无合成引物功能，只能有效地延伸DNA引物，对RNA引物延伸功能很弱。
SV40 DNA复制过程大致如下：首先由T抗原结合于特有的复制起点，其解旋酶活性使DNA双螺旋解链，复制蛋白RPA随后结合上去。如图1所示，DNA聚合酶α在布满RPA的DNA模板单链区开始合成RNA-DNA引物，一旦RNA-DNA引物合成，RFC就取代DNA聚合酶α并结合到iDNA的3‘端。RFC是一种依赖DNA的ATP酶，其ATP酶活性由PCNA激活，它之所以能取代DNA聚合酶α，很有可能是因为RFC对引物-模板链紧密结合及DNA聚合酶α不具备持续合成能力。RFC的主要功能是将PCNA结合到引物-模板链的DNA或双链DNA分子的缺口上。PCNA本身无结合DNA活性，它一旦被RFC以消耗ATP方式结合于DNA，就将DNA聚合酶δ结合到引物-模板链上，由DNA聚合酶δ继续合成DNA链[10、11]。
PCNA在DNA代谢中起十分重要的作用，已成为临床检测增殖细胞的重要标记。PCNA为同源三聚体复合物，其环形结构和功能都非常类似于E.coli
DNA聚合酶III的β亚基，它可以像夹子一样和DNA双螺旋紧密结合，并沿DNA自由滑动，使DNA聚合酶δ获得持续合成能力。
图1 DNA聚合酶的转换和滞后链的成熟[8]
2.冈崎片段的引物切除和连接
SV40的前导链至少能连续合成5-10kb，而新的冈崎片段合成在遇到前一个冈崎片段时停止，后者的RNA引物被切除，由DNA连接酶I将两个片段连接起来。
Waga和Stillman认为，在滞后链的成熟过程中，冈崎片段RNA引物的切除机制有两种可能（图2），一是利用RNase
H I/FEN1,二是利用Dna2解旋酶/FENI[11]。
图2 切除RNA引物的两种机制
(1)
RNase H I/FEN1
体外实验证实，RNase H I以内切酶活性切除冈崎片段5‘端的RNA引物，而引物的最后一个核糖核苷由FEN1的5´→3´核酸外切酶行使功能予以切除。
RNase H I确切的分子量和亚基结构尚不清楚，尽管如此，其生化特性已显示出独特的底物特异：切割连结在DNA链5´端的RNA，但在DNA链的5´端残留一个核糖核苷酸。
FNE1(falp endonuclease)具5´→3´核酸外切酶和内切酶活性。如果DNA双螺旋分子的一端发生解旋，使一条链的5´端部分序列游离，即形成盖子(flap)结构时，FEN1表现内切酶活性，可有效地切割盖子结构的分支点，释放未配对的片段；但如果DNA的5´端序列完全配对，没有盖子结构，FEN1仅表现5´→3´外切酶活性。有意思的是，如果细胞缺失FEN1活性，将产生一种新型突变，其特征是若干长度为5-108bp的DNA序列（两端有3-12bp的正向重复）高频复制。这种独特的突变产生的原因可能是：滞后链DNA合成缺陷，诱发双链缺口修复，进而使得组频率增加。
（2）Dna2 解旋酶/FEN1
Dna2解旋酶具有依赖DNA的ATP酶活性和3´→5´解旋酶活性。Dna2利用3´→5´解旋酶活性，使DNA聚合酶δ合成的冈崎片段从模板DNA上置换下前一个冈崎片段的引物，形成盖子结构，再由FEN1的内切酶功能切除引物。尽管依赖Dna2/FEN1的引物切除要现在沿未证实，但近来研究发现Dna2解旋酶与FEN1之间有生化及遗传上的相互作用，强烈地支持这一模型。Waga和Stillman进而推测，不仅冈崎片段5´端的RNA引物被切除，由DNA聚合酶α合成的iDNA也可能在Dna2的解旋作用下被新生的冈崎片段所置换，然后被FEN1切除，形成的空隙由DNA聚合酶δ（或ε）负责填补，这两种酶的3´→5´核酸外切酶活性将使复制的准确性增强，有利于保持细胞基因组的完整性；而DNA聚合酶α没有校正功能，无法校正iDNA中的错误。滞后链的这一成熟机制也可以防止基因组中重复片段的不适宜复制（常见于人肿瘤细胞），例如小卫星重复序列的复制[11]。
目前，关于真核DNA复制的研究主要集中在三个相关领域：（1）确定染色体复制起点、对复制子功能很重要的DNA序列特点；（2）参与真核复制起始调控的蛋白质，这些蛋白质和研究细胞周期、发育生物学，基因表达调控、染色体结构和功能的联系密切，是目前最活跃的领域；（3）继续深入研究DNA复制叉处发生的事件，鉴定是否有其它蛋白质与已知的复制叉蛋白协同作用来保证准确、高效的DNA复制，确立形成DNA复制叉的起始蛋白质与在起始后参与复制DNA的蛋白质之间的关系。复制叉处的蛋白因子可能通过与染色质组装蛋白相互作用，对染色体结构的遗传发挥重要作用。
参考文献
[1] Fry LA et al.Animal Cell DNA Ploymerase, 1986, (CRC, Boca raton, FL)
[2] Tsurimoto T et al. Mol Cell Biol, 1989, 9:609-619
[3] Lodish H et al.Molecular Cell Biology.3rd ed.New York, 1995, 378-380
[4] Tsurimoto T et al.Nature, 1990,346:534-539
[5] Bullock PA et al. Mol Cell Biol, 1991, 11:2350
[6] Roberts JD et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:3465-3469
[7] Roberts JD et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85:7064-7068
[8] Waga S et al.Nature, 1994,369:207-212
[9] Herendeen D et al. SV40 DNA Replication. In:Blow J(ed).Eucaryotic DNA Replication, 1996, pp29-65
[10] Peter MJ Burgers. Chromosoma, 1998,107:218-227
[11] Waga S et al. Annu Rev Biochem, 1998, 67:721-751
生物通微信公众号
生物通 版权所有
