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双荧光素酶报告基因（DLR）检测系统是目前应用最为广泛的化学发光分析技术。本文将展示Varioskan Flash多功能读数仪在DLR检测方面的应用，内容包括其进行DLR检测的性能、DLR的化学光谱，以及DLR的动力学特性等，从各个方面展现VF的特点与优势。
原文来自Application Note: AP-MIB-VARIO11-0807 赛默飞世尔供稿
DLR（Dual-Luciferase Reporter, Promega）双荧光素酶报告基因检测系统是目前应用最为广泛的化学发光分析技术。本文将展示Varioskan Flash（ab. VF）多功能读数仪在DLR检测方面的应用，内容包括VF进行DLR检测的性能、DLR的化学光谱，以及DLR的动力学特性等，从各个方面展现VF的特点与优势。
引言
化学发光报告基因系统是研究基因表达和调控的常用工具。报告基因可用于研究目标蛋白的表达、转录因子、信号通路、以及蛋白质折叠等。而双报告系统，可以同时表达和测量两种不同的报告基因所编码的蛋白，一个作为内参，而使另一个报告基因的测量结果归一化。通过这种方法，可以将影响实验结果准确性的一些影响因素消除，如细胞活力、转染效率、裂解效率，甚至是移液器的加样误差等。
Promega公司的DLR是目前使用的最为广泛的双报告系统。系统使用两种不同生物来源的荧光素酶基因，一种是源自北美萤火虫（Photinus pyralis）的荧光素酶基因Luc（Firefly luciferase），另一种是源自海肾（Renilla reniformis）的荧光素酶基因RLuc（Renilla luciferase）。在测量过程中，两种荧光素酶的活力依次测定。首先通过加入萤火虫荧光素酶检测试剂LAR II测量Luc的活力，然后加入Stop&Glow试剂，在淬灭Luc信号的同时激活Rluc的活性进行测量。两种荧光素酶的化学发光信号都十分稳定，检测灵敏度都达到了amol级（10-18），而且在超过6个数量级的动态范围内保持线性关系。
材料与方法
Varioskan Flash多功能读数仪（Thermo Scientific），包括LumiSens化学发光模块，2个自动进样器，SkanIt软件；Microlite 1+ 96孔白板（Thermo Scientific）；DLR双荧光素酶检测系统（Promega）；重组萤火虫荧光素酶（Promega）；重组海肾荧光素酶（LUX Biotechnology）。
实验方法
试剂准备
按试剂盒说明准备萤火虫荧光素酶检测试剂（LAR II），Stop&Glo试剂和1X 被动裂解液（PLB）。1mg重组的萤火虫荧光素酶溶解在添加了0.1%明胶的3.28ml的1X PLB缓冲液中，终浓度为5x10-9mol/ml。0.1mg海肾荧光素酶溶解在添加了0.1%明胶的5.56ml的1X PLB缓冲液中，终浓度为5x10-10mol/ml。将两种荧光素酶溶液分装后，保存在-70℃冰箱内。实验所需的荧光素酶标准品溶液（0.01-100,000amol/孔）都通过1X PLB缓冲液稀释得到。
仪器准备
DLR实验将使用2个自动分液器。分液器1用于LAR II试剂的分液，预洗后待用。分液器2用于Stop&Glo试剂的分液，预洗后待用。仪器温度设定在环境温度（22C）。
化学发光光谱扫描
Varioskan Flash是唯一可用于化学发光光谱扫描的微孔板读数仪。我们将使用VF进行Luc和Rluc的化学发光光谱扫描。将20ul终浓度为10,000amol/孔的两种荧光素酶溶液加入Microlite 1+ 96孔白板中，并设置如下SkanIt程序：
步骤 1：选择”Well loop”，执行方式”by well”，孔数”1”。选择以孔为单位执行下面的程序，程序将运行完所有“Well loop”下的动作后，再移动到下一孔。
步骤 2：选择分液器1，分液体积100ul，分液速度”High”，分液位置”L1”，预洗”No”。将100ul的LAR II试剂通过自动进样器加入对应的孔中。“High”的分液速度定义为以分液器最快速度的40%进行分液，此速度相当于400ul/s。
步骤 3：Luc化学发光光谱扫描，扫描范围450-700nm，1nm步进，动态范围”Auto Range”，测量时间”500ms”，延迟时间”2s”。以1nm波长步进测量Luc发光光谱。在测量前，需设置2s的信号延迟时间（只在第一次测量时延时）。
步骤 4：选择分液器2，分液体积100ul，分液速度”High”，分液位置”L2”，预洗”No”。将100ul的Stop&Glo试剂通过自动进样器加入对应的孔中。
步骤 5：Rluc化学发光光谱扫描，扫描范围400-600nm，1nm步进，动态范围”Auto Range”，测量时间”500ms”，延迟时间”2s”。以1nm波长步进测量Rluc发光光谱。在测量前，需设置2s的信号延迟时间。
具体流程如图1所示。扫描结果通过SkanIt软件的数据导出工具”Export”导出，注意修改导出格式为”Organized export”。输出数据在Excel软件中作图分析。
图1.化学光谱扫描的程序设置
萤火虫荧光素酶信号的淬灭效率
DLR实验中的关键一步是，在加入Stop&Glo试剂激活海肾荧光素酶化学发光信号的同时，确保萤火虫荧光素酶化学发光信号的有效淬灭。淬灭效率可通过在反应体系中不加入海肾荧光素酶的方法进行测量，实验以动力学的方式进行，使用高浓度的萤火虫荧光素酶（100,000amol//孔）进行试验，以确保即使在高浓度的范围内也能淬灭完全。将20ul的萤火虫荧光素酶样品加入到Microlite 1+ 96孔白板中，16个重复。并设置如下SkanIt程序：
步骤 1：选择”Well loop”，执行方式”by well”，孔数”1”。
步骤 2：选择”Kinetic loop”动力学循环，读数次数”60”，间隔”0s”。间隔”0s”表示将以最快的速度进行动力学测量。
步骤 3：选择分液器1进行LAR II试剂的分液，分液体积100ul，分液速度”High”，分液位置”L1”，预洗”No”，分液时间”1”。分液时间”1”表示将在动力学测量的第一次进行分液。
步骤 4：选择”Normal”进行Luc化学发光强度测量，动态范围”Auto Range”，测量时间”200ms”。程序设定的测量速度是5个点/秒，60个动力学点的测量耗时约12秒。
步骤 5：选择”Kinetic loop”动力学循环，读数次数”60”，间隔”0s”。
步骤 6：选择分液器2进行Stop&Glo试剂的分液，分液体积100ul，分液速度”High”，分液位置”L2”，预洗”No”，分液时间”1”。
步骤 7：选择”Normal”进行淬灭后Luc化学发光强度测量，动态范围”Auto Range”，测量时间”200ms”。
具体流程如图2所示。所得的动力学测量结果依照前述的方法导出至Execl，并在Excel中绘制带有误差线的动力学曲线。为了方便计算淬灭效率，以淬灭前2s至12s的信号累积作为淬灭前的信号水平，而将淬灭后14s至24s的信号累计作为淬灭后的信号水平，进行淬灭效率的计算。此外，将淬灭前后的测量数据进行Z’因子分析。
图2. 动力学方式测量萤火虫荧光素酶的淬灭过程
测量结果的一致性
结果的一致性对于DLR实验而言也是十分重要的。通过将萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶以不同浓度混合的方式进行一致性测试。一种是含有高浓度1,000amol/20ul的萤火虫荧光素酶和低浓度10amol/20ul海肾荧光素酶混合物，另一种恰好相反，是含有低浓度10amol/20ul萤火虫荧光素酶和高浓度1,000amol/20ul海肾荧光素酶混合物。取20ul的这两种混合物，分别加入到微孔板中，16个重复。并设置如下SkanIt程序：
步骤 1：选择”Well loop”，执行方式”by well”，孔数”1”。
步骤 2：选择分液器1进行LAR II试剂的分液，分液体积100ul，分液速度”High”，分液位置”L1”，预洗”No”。
步骤 3：选择”Normal”进行Luc测量，动态范围”Auto Range”，测量时间”10,000ms”，延迟时间”2s”。
步骤 4：选择分液器2进行Stop&Glo试剂的分液，分液体积100ul，分液速度”High”，分液位置”L2”，预洗”No”。
步骤 5：选择”Normal”进行Rluc测量，动态范围”Auto Range”，测量时间”10,000ms”，延迟时间”2s”。
具体流程如图3所示。所得的数据进行基本的统计量分析，包括平均值、标准差和变异系数，并计算高/低浓度荧光素酶信号水平的比值。
图3. 一致性测量的程序流程
DLR检测灵敏度和动态范围
当上述预实验完成后，将对在Varioskan Flash上进行DLR试验的性能——检测灵敏度和动态范围进行测试。为此，对荧光素酶样品进行梯度稀释（0.01-100,000amol/10ul），每个样品8个重复，空白（PLB被动裂解液）16个重复，所得的微孔板布局如表1所示。程序设置与一致性测试的程序相同。测量完成后，进行标准曲线的线性拟合。理论灵敏度采用标准的IUPAC 3*SD方法计算。动态范围以从理论灵敏度到所能检测的最大浓度计算。此外，采用Z’因子分析法进行实验的稳定性和可靠性分析。
表1. 用于DLR检测灵敏度和动态范围测试的板布局
结果与讨论
化学发光光谱
化学发光的光谱对环境条件的改变异常的敏感，因此反应条件的变化会影响化学发光光谱的峰形和峰值。图4是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶化学发光光谱的扫描结果，具体的光谱数据（峰值与半带宽）如表2所示。萤火虫荧光素酶的最佳发射光在562nm处，而海肾荧光素酶的最佳发射光在486nm处，两者的半带宽分别为77nm和80nm。
图4. 萤火虫和海肾荧光素酶的化学发光光谱
表2. 荧光素酶的光谱特性
萤火虫荧光素酶信号淬灭效率
淬灭前后的萤火虫荧光素酶的化学发光信号强度（RLU，相对化学发光强度）以动力学方式进行测量，所得的动力学曲线如图5所示。每个样品在淬灭前后的信号强度与计算所得的淬灭效率如表3所示。
由图5可知，当加入Luc底物后，在不到1s的时间内，Luc的化学发光信号强度就达到了最大，因此需要使用快速、高效的自动分液器完成底物的加入。在实验中，我们测试了自动分液器的不同加液速度，更快的速度对信号的产生并无改善作用，而且易发生泼溅，而慢的速度会导致信号延时（数据未显示）。因此，优化的分液速度应该是足够快速有效，而且不易泼溅。当化学发光信号达到最大时，在随后的10s内十分稳定，而只有当加入淬灭试剂Stop&Glow后，Luc的信号才迅速的下降。这一结果也是通过使用Varioskan Flash的快速分液功能来得到的。在加入淬灭试剂后不到0.5s的时间内，Luc的化学发光强度就下降了10,000倍，而且在随后的时间里，Luc的信号强度继续下降。计算所得的Luc的平均淬灭效率超过34,000倍。通过Z’因子分析也很好的证实了淬灭前后信号之间的显著差异。
图5 萤火虫荧光素酶的淬灭动力学
表3 萤火虫荧光素酶的淬灭效率
测量结果的一致性
一致性是通过萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的混合物来完成的，一组使用高浓度的Luc和低浓度的Rluc，另一组是低浓度的Luc和高浓度的Rluc组合，浓度高低各相差100倍，测量所到的结果如表4所示。由表中数据可知，高低浓度的荧光素酶检测结果的标准差和变异系数都在可接受的范围内。
表4 DLR试验的一致性
DLR的检测灵敏度与动态范围
DLR的检测灵敏度和动态范围依据DLR实验的标准流程进行测定。萤火虫和海肾荧光素酶的梯度稀释样品混合后加入微孔板中，所得的标准曲线如图6所示。两种荧光素酶的标准曲线在从0.01到100,000aml/孔的浓度范围内，都表现出非常好的线性关系（R2=0.999）。理论灵敏度依照公认的IUPAC 3*SD方法进行计算。该方法采用空白（本底）平均值加上3倍的本底标准差与标准曲线的延长线相交，将该交点值作为检测的理论灵敏度，即可以与背景信号相区别的最小浓度。动态测量范围是指检测的最大浓度与理论灵敏度之间的范围。所得的检测灵敏度与动态范围的具体数据如表5所示。
图6 DLR的标准曲线
表5 DLR检测灵敏度和动态范围
由表5数据可知，使用Varioskan Flash进行DLR实验，对于萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶都可以轻松的检测到亚amol级的浓度水平，而且二者的动态范围都非常宽（>6.0个数量级）。特别的，标准曲线在宽的动态范围内都保持线性关系，在高浓度范围内也没有饱和。因此，真实的检测动态范围会更宽，因为仪器和反应化学都没有达到检测上限。
DLR实验的可靠性和稳定性可以通过Z’因子来计算。不同浓度下Luc和Rluc的Z’因子如图7所示。Z’因子分析从另一侧面证实了通过标准曲线计算得到的理论灵敏度的结果，最低浓度的Luc（0.01amol/孔）的Z’因子是负值，不在检测范围之内，而浓度为0.1amol/孔标准品的Z’因子（Luc和Rluc分别为0.54和0.69）在可信赖的Z’因子区间内。更高浓度的样品具有更高的Z’因子（>0.85），这进一步证明了Varioskan Flash可靠性和稳定性。
图7 不同浓度下DLR实验的Z’因子分析
结论
赛默飞世尔科技的荣誉产品——Varioskan Flash在DLR的应用上，具有简单灵活的优势，而且所得的测量结果稳定、重复性好。高效率的快速自动分液可以确保萤火虫荧光素酶信号的快速淬灭，而化学发光光谱扫描功能，灵活的动力学追踪能力等，给予了研究人员无限的可能用于优化实验方案和进行质量控制。高灵敏度的LumiSens化学发光模块和自动进样器结合Varioskan Flash主机，是进行DLR实验的最佳选择。
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