综述：糖基化RNA，一种新型RNA修饰

本综述系统探讨了新型RNA修饰——糖基化RNA（glycoRNA）的发现机制与功能。文章详细阐述了其细胞表面定位特征、N-糖链结构特性及其与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）的相互作用，揭示了糖基化RNA在肿瘤免疫调控中的潜在功能。重点介绍了rPAL、drFRET和ARPLA等前沿检测技术，并讨论了内质网-高尔基体通路中寡糖转移酶（OST）复合物的调控机制，为癌症精准治疗提供了新的生物标志物研究方向。

1 Introduction

细胞表面作为细胞与外部环境相互作用的核心界面，是生物调控的关键枢纽。传统上，糖基化修饰被认为仅发生在蛋白质或脂质上，但近年研究发现RNA亦可作为糖基化的第三类靶分子，形成糖基化RNA（glycoRNA）。这一发现打破了RNA生物学与糖生物学长期分离的研究格局——前者主要局限于细胞核与细胞质，而后者定位于内质网-高尔基体系统。

糖基化RNA主要是一类位于细胞质中的小型非编码RNA，包括核小RNA（snRNAs）、核仁小RNA（snoRNAs）、微RNA（miRNAs）、小干扰RNA（siRNAs）、Piwi相互作用RNA（piRNAs）以及小时序RNA（stRNAs）等。其独特之处在于携带富含唾液酸和岩藻糖组分的N-糖链结构。值得注意的是，这些糖基化RNA被证实存在于细胞表面，提示其可能参与细胞间通讯与免疫识别过程。

糖基化RNA可与两类唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）结合，被认为是Siglec家族的潜在配体。研究显示，核糖核酸通过与内皮细胞上的P-选择素（P-selectin）相互作用，增强中性粒细胞向炎症部位的募集，且该功能依赖于Sidt基因的表达。糖基化RNA在多种人类细胞系中均被检测到，且与疾病相关的小RNA具有同源性，这一重要发现可能为揭示肿瘤与糖基化RNA的关联机制开辟新的研究方向。

1.1 Discovery of extracellular membrane-associated RNA and glycorna

尽管核酸研究长期以来聚焦于细胞内活动，但RNA在细胞外空间的作用早在数十年前就有记载。真核细胞被半透性脂双层膜包裹，大多数分子需依赖主动运输机制实现跨膜转运。随着高灵敏度技术的发展，细胞外RNA（exRNA）的研究范围不断扩大。exRNA广义指所有存在于细胞膜外的RNA，主要为小RNA，推测其可影响从免疫细胞激活到癌症进展的多种过程。

Flynn团队首次发现定位于细胞膜上的糖基化RNA分子，揭示了唾液酸化和岩藻糖基化聚糖可与非编码RNA结合形成糖基化RNA。研究证明唾液酸化的糖基化RNA可与Siglec受体结合，该受体家族包含14个成员，参与免疫检查点调节和肿瘤免疫逃逸。Huang等人利用专有表面测序技术在EL4细胞系中发现了与转移密切相关的长链非编码RNA MALAT1的膜定位，并将这些膜相关细胞外RNA命名为maxRNA。研究还发现，通过反义寡核苷酸敲低单核细胞膜定位的FNDC3B和CTSS RNA片段可显著降低细胞对内皮细胞的黏附能力。

近年来，RNA生物学领域呈现爆发式增长。随着技术进步，越来越多的可逆RNA修饰被发现，这些发现从根本上改变了我们对细胞膜的理解：原本被视为由脂质、胆固醇、蛋白质和碳水化合物（后扩展至糖脂和糖蛋白）组成的镶嵌结构，现在必须将糖基化RNA作为一种新组分纳入其中。

尽管该领域预计将持续推进，当前发现仍引出了许多新问题。糖基化RNA与质膜外叶关联的精确分子机制尚不明确，可能涉及RNA-膜直接接触或蛋白质介导的锚定。阐明这些细胞表面RNA配体的膜附着机制将为了解其生物物理特性与调控功能提供关键见解。

1.2 Detection methods

迫切需要开发先进技术以检测和分析糖基化RNA。Ren等人开发了一种称为双识别荧光共振能量转移（drFRET）的成像技术，可实现多种癌细胞系和临床血清样本来源的小细胞外囊泡（sEVs）中代表性糖基化RNA的可视化。利用drFRET，他们进一步阐明了糖基化RNA与Siglec-10、Siglec-11和P-选择素之间的相互作用。

Xie等人报道了RNA特异性高碘酸盐氧化和醛标记（rPAL）技术，这是一种更灵敏的糖基化RNA富集、分离和表征方法。该技术利用唾液酸中1,2-二醇的独特反应性，通过高碘酸盐氧化生成醛基，与氨基氧功能化固相支持物形成稳定肟键，从而实现糖基化RNA的特异性标记。结合高灵敏度质谱分析，研究提出3-（3-氨基-3-羧丙基）尿苷（acp³U）作为聚糖附着的关键核苷酸锚定位点。

Ma等人开发了一种称为唾液酸适体和RNA原位杂交介导的邻近连接 assay（ARPLA）的方法，可在单细胞水平实现糖基化RNA的高灵敏度、高选择性可视化。该技术利用糖链和RNA的双重识别触发原位连接反应，通过互补DNA的滚环扩增和荧光标记寡核苷酸进行信号输出。利用ARPLA，他们发现糖基化RNA通过SNARE蛋白介导的分泌性胞吐作用进行细胞内运输。这些检测方法的进步为揭示糖基化RNA的生物学功能及其在疾病机制中的潜在意义提供了强大工具。

1.3 RNA-binding proteins

糖基化RNA生物学的一个新兴特征是这些表面相互作用需要与细胞表面RNA结合蛋白（csRBPs）协同作用。早在糖基化RNA被发现之前，研究就已证明细胞外空间中存在RNA-RBP相互作用。细胞外囊泡（EVs）（包括外泌体和微囊泡）中存在多个充分记录的案例。与细胞内RNA-RBP相互作用类似，细胞外RNA-RBP关联也依赖于特定的序列环境。

许多在细胞表面检测到的RBPs（如核仁素、烯醇化酶、La蛋白、U5 SNRNP200、DDX21、hnRNPU和NPM1）缺乏已知的跨膜结构域。Perr等人的研究证明，这些细胞表面RBPs（csRBPs）可精确组装成明确定义的纳米簇，富集多种RBPs和糖基化RNA，且这些簇状结构可通过添加细胞外RNase解离。在不同细胞类型中，csRBPs被观察到在细胞外表面形成特殊功能域。它们与糖基化RNA的聚类可能进一步增强与免疫调控受体的相互作用，为精确免疫识别与反应提供必要的空间组织。这些糖基化RNA-csRBP复合物在细胞表面的排列不仅对免疫调节至关重要，还可能广泛影响膜结构与功能。目前，破译这些相互作用的调控机制及其在癌症等疾病中的意义仍是研究重点。

1.4 Regulation of glycosylated RNA modifications

糖基化RNA（glycoRNA）的生物合成途径仍知之甚少。Flynn等人首次证明小RNA分子上的N-糖链是通过内质网-高尔基体途径合成的，该过程依赖于寡糖转移酶（OST）复合物。这一发现直接将糖基化RNA与N-连接糖基化机制联系起来，区别于由O-GlcNAc转移酶（OGT）催化的O-GlcNAc修饰。

值得注意的是，RNA N-糖基化现象挑战了传统认知，表明存在未知机制使聚糖能够结合非蛋白质底物。虽然早期对蛋白质糖基化的研究描述了高尔基体中由GALNTs或唾液酸转移酶介导的O-糖链起始，但这些酶在RNA糖基化中的作用尚未经过实验验证。

2 Discussion

随着生物技术的进步，对RNA的理解已从“蛋白质合成中的效应分子”扩展到此前未知的功能，包括核酶的催化活性、非编码RNA的基因调控以及外泌体中细胞外RNA介导的细胞间通讯。RNA修饰作为响应代谢和细胞应激的关键调控因子，影响应激相关蛋白的翻译，从而赋予细胞生存优势。

糖基化RNA是一类被糖链修饰的RNA分子，可在多种细胞类型中检测到。RNA上糖修饰的发现引起了广泛关注，标志着糖基化从蛋白质和脂质延伸至新的分子领域。在癌症中，糖基化RNA可能参与肿瘤发生和进展的多个阶段。最近研究利用唾液酸适体和RNA原位杂交介导的邻近连接 assay（ARPLA）显示，乳腺癌细胞系表面糖基化RNA的水平与肿瘤恶性程度和转移潜力呈负相关。具体而言，与非致瘤性乳腺细胞相比，恶性和转移性乳腺癌细胞表现出糖基化RNA信号的逐渐减少，表明糖基化RNA表达下调可能与肿瘤侵袭性增加相关。

Krishnan团队扩展了Flynn的观点，提出糖基化RNA的细胞外分泌在癌症中发挥作用。Ren等人使用drFRET成像技术证实了五种代表性糖基化RNA与Siglec-10、Siglec-11和P-选择素之间的特异性相互作用。他们发现N-连接聚糖、Neu5Ac或糖基化RNA的缺失显著损害sEV的内化，表明糖基化RNA可能通过细胞表面聚糖受体调节sEV的摄取。Sharma等人利用代谢标记技术发现糖基化RNA主要作为外泌体囊泡的内腔 cargo存在。此外，作者发现外泌体糖基化RNA可转移至未经处理的受体细胞，揭示了其在细胞间RNA通讯中的作用。抑制外泌体生物发生导致糖基化RNA在细胞内积累，而阻断蛋白质糖基化转移则减少糖基化RNA向外泌体的分选。

尽管关于细胞外RNA（exRNAs）的功能存在多种假设，其精确生物学作用仍知之甚少。在探索exRNAs功能时，必须考虑几个引人深思的问题：它们如何系统且精确地退出细胞（RNA如何穿越细胞膜？）；它们如何在细胞外保持足够稳定性以发挥功能（为何exRNAs不会被快速降解？）；以及它们如何寻找分子伙伴以实现其作用（RNA必须具备哪些功能基团才能在细胞外生物学中发挥主动作用？）。此外，表型观察的定位也带来挑战——exRNAs的释放可能对供体细胞的影响大于受体细胞。

值得注意的是，糖基化RNA表现出与通过内质网-高尔基体途径合成的糖蛋白相似的糖基化模式，这引出了新问题：糖基化RNA是否与糖脂和糖蛋白共享相同的糖基化途径？如前所述，Flynn等人发现OST参与糖基化RNA相关聚糖的生物合成，而非由常规O-GlcNAc转移酶催化。这些复杂性，加上exRNA研究固有的技术挑战，使得快速确定其功能变得困难。然而，在现有研究中仍可找到exRNAs展示可重复生物学功能的清晰案例。

若干关键问题尚待解答。如果糖基化和非糖基化RNA共存于细胞表面，非糖基化RNA可能与糖基化RNA不同的受体相互作用。或者，非糖基化RNA可能更易降解，从而改变细胞间相互作用模式。精确阐明聚糖修饰在RNA细胞表面呈现中的分子要求将是一个极具价值的研究方向。鉴于糖基化RNA在多种生物过程中的潜在重要性，未来研究应探索其在不同组织和器官中的发育轨迹。