生物通首页 > 今日动态 > 正文

综述：提高鱼类细胞系培养成功率的关键细节

编辑推荐：

这篇综述聚焦鱼类细胞系，详细探讨了其分离、培养、维持及在毒理学应用中的技术要点。涵盖组织解离、细胞选择、培养基选择等多方面内容，旨在为相关研究提供实用指导，助力优化鱼类细胞系研究流程（invitromatics）。

引言

细胞分离、原代培养和细胞系维持的技术考量

1. 组织解离用于细胞系起始：鱼类细胞系起始的组织解离方法主要有机械破碎、化学消化和酶消化，可单独或组合使用。机械破碎时，用锋利无菌的剪刀或手术刀切碎组织，如处理骨骼肌、鳃等纤维或致密组织；对于脾脏、大脑等软组织，使用细胞筛更合适。酶消化常用的酶有胶原酶、胰蛋白酶等，其效果受多种因素影响，如孵育时间、组织块大小和类型等。此外，酶消化还可与化学方法结合，如胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）联合使用。在进行组织解离后，需小心处理培养物，避免细胞脱落。
2. 细胞选择：与哺乳动物细胞培养相比，鱼类细胞培养中特定细胞类型的选择研究较少。目前多数鱼类细胞系通过组织块生长或组织完全消化后的单细胞培养建立，通常会得到异质细胞混合体。可通过调整培养条件、有限稀释法或细胞分选技术进行细胞选择，但由于缺乏鱼类特异性抗体，荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS）在鱼类细胞培养中的应用受限。不过，FACS 已成功用于分离斑马鱼的特定细胞。
3. 培养基选择和补充：培养基配方对原代培养和常规维持中细胞的生长和存活至关重要。鱼类细胞通常在室温、非 CO₂培养箱中培养，常用的培养基有 Leibovitz’s L - 15、Medium 199 和 Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）等。其中，Leibovitz’s L - 15 通过添加半乳糖和高浓度碱性氨基酸维持 pH 稳定。培养基中血清的类型和浓度也很关键，胎牛血清（FBS）是最常用的补充剂，但不同细胞系对 FBS 浓度的需求不同。此外，还可添加抗生素 / 抗真菌剂防止微生物污染，使用细胞分泌组 / 条件培养基或重组蛋白补充生长因子。
4. 塑料制品：鱼类细胞对塑料制品的表面性质有选择性，不同公司的塑料表面处理不同，会影响细胞的粘附和生长。常见的塑料制品有聚苯乙烯，其疏水性强，需进行化学修饰或涂层处理。目前有多种商业细胞培养塑料可供选择，如 Corning CellBIND（带负电荷）和 Corning Primaria（带正电荷）等。此外，用细胞外基质成分（如胶原蛋白、纤连蛋白等）包被培养板可帮助细胞附着。
5. 培养环境和温度：鱼类细胞常培养在非湿润环境中，使用如 L - 15 等能在无 CO₂平衡环境中支持细胞生长的培养基。但这种情况下，培养基易蒸发，导致渗透压升高，影响细胞生长。使用非透气培养瓶可有效减缓蒸发。鱼类细胞一般耐低氧，在低氧条件下生长良好。多数鱼类细胞系能在室温（20 - 22°C）下增殖，但选择合适的温度对细胞系维持和实验很重要。温度控制培养箱可提供更稳定的温度，不同鱼类细胞系的最适增殖温度不同，如彩虹鳟鱼细胞在 18°C 的培养箱中能稳定生长。
6. 传代培养 - 原代培养容器的特定考虑因素：原代培养初期需密切观察是否有微生物污染和细胞恶化。若培养基变黄、浑浊或出现表面膜，表明存在严重微生物污染，需高压灭菌后丢弃；若显微镜下观察有可疑特征，可采取更换培养基等措施。同时，需通过相差显微镜监测鱼类细胞的健康状况，细胞附着和铺展是良好的迹象。当原代培养细胞达到 80 - 100% 汇合度时，可进行传代培养，部分研究人员会选择性分离特定细胞类型以建立更均一的培养物。
7. 所有培养容器的考虑因素：除少数细胞系外，鱼类细胞系通常贴壁生长。传代或实验时，需将细胞从培养容器表面分离，常用酶解法，如使用胰蛋白酶或 TrypLE。不同细胞系对胰蛋白酶的反应不同，如 RTG - 2 细胞使用猪胰蛋白酶会形成细胞聚集体，而使用牛胰蛋白酶或 TrypLE 则可解决该问题。此外，传代时的机械搅拌程度、酶处理时间、离心条件和细胞重悬等步骤都可能影响细胞分离效果，需根据具体细胞系进行调整。细胞接种密度和分裂比例应根据培养目的和细胞系特性选择，低分裂比例（1:2 或 1:3）适合建立细胞储备，高分裂比例（如 1:10）适合缓慢维持细胞系。
8. 优化培养条件：细胞从原代容器传代后，可进一步优化培养条件，如调整基础培养基配方、血清浓度、塑料制品和温度等。在优化过程中，需密切监测细胞形态变化，避免细胞分化或出现应激反应。这些实验通常在多孔板中进行，改变培养基时需考虑其对细胞粘附和复制的影响。
9. 鱼类细胞系自发永生化的条件：将鱼类细胞系与哺乳动物细胞系的衰老 / 危机和永生化概念相联系具有挑战性，但能提供有价值的见解。哺乳动物细胞通常在传代 20 - 60 次后会面临衰老障碍，部分细胞系可在危机期自发永生化，或通过特定因子诱导永生化。鱼类细胞很少出现衰老，常通过培养自发永生化，但确定鱼类细胞永生化的传代次数较为随意。在鲑鱼细胞系研究中，通常认为细胞在 1:2 或 1:3 分裂比例下传代 20 - 30 次并成功冻存后为永生化。鱼类细胞系自发永生化的过程可分为六种情况，包括克隆形成、拥挤培养、衰老或危机、类器官样生长、长期原代培养和非解离组织 / 流体培养等。

鱼类细胞系应用的技术考量（侧重于毒理学研究）

1. 实验细胞准备 - 细胞接种：为确保实验一致性，每次实验时细胞接种密度应相同，需准确计数细胞。根据多孔板的格式确定所需细胞密度（cells/cm²），制备细胞悬液。典型的多孔板接种密度为 132,000 cells/cm²，但不同细胞系会有所差异。接种时，应随机将细胞悬液加入各孔，并定期混匀，避免细胞沉淀。对于 6 - 48 孔板，需轻轻线性摇晃，96 孔板则无需摇晃。此外，鱼类细胞在非通风条件下生长更好，可通过密封培养板或放入塑料袋实现。
2. 边缘效应：多 孔板边缘孔的细胞因湿度和温度差异，生长情况与内部孔不同，产生 “边缘效应”，影响实验结果。可通过填充外孔（如用 PBS）、避免堆叠培养板、选择合适的接种密度、缩短暴露时间、预热培养基、让细胞先附着再孵育以及注意培养箱风扇等方式减少边缘效应。实验前，可通过预实验检测边缘效应，选择合适的培养条件，如使用 48 孔板和 500 µL / 孔的细胞培养基可有效减少边缘效应。
3. 暴露 - 暴露化合物
   • 浓度：实验浓度的选择至关重要，应评估其与环境相关性。一些有毒物质（如微塑料）可能需要较高浓度才能引发可检测的细胞反应，因为环境相关浓度下每孔可能只有不到一个颗粒。典型的暴露时间为 24 小时，但具体时长需根据实验情况调整，同时需密切监测长时间暴露对细胞活力的影响，避免因时间因素导致误差。实验过程中一般不建议更换培养基，以免影响有毒物质浓度。
   • 生物转化：部分鱼类细胞系具有生物转化有毒物质的能力，如肝脏细胞系 RTL - W1、肠道细胞系 RTGutGC 和鳃细胞系 ASG - 10 等。这些细胞系中的生物转化酶可代谢有毒物质，产生的代谢产物毒性可能改变。可通过 EROD 测定（检测 CYP1A 活性）或高分辨率质谱法研究生物转化能力，确定代谢产物。
   • 生物利用度：暴露培养基的选择对实验结果影响显著。常用的培养基有含或不含血清（通常为 FBS）的生长培养基（如 Leibovitz’s L - 15）和等渗溶液（如 L - 15/ex）。L - 15/ex 缺乏抗氧化剂和维生素，可能增加细胞对某些有毒物质的敏感性，调整其盐浓度或渗透压可改变污染物的生物利用度。了解有毒物质的化学性质（如亲脂性 / 亲水性）对理解其生物利用度至关重要。亲脂性化合物可能需要特定量的血清和 / 或溶剂（如二甲基亚砜（DMSO）、甲醇（MeOH）或乙醇（EtOH））才能溶解和被细胞摄取，血清还可减少有毒物质在塑料表面的吸附。此外，细胞中的外排泵 / 转运蛋白会影响有毒物质的生物利用度，可使用外排泵抑制剂克服这一影响，但需注意其可能产生的非特异性效应。
   • 自发荧光：有毒物质（尤其是含有共轭双键或芳香环的有机化合物）容易自发荧光，可能导致生物测定出现假阳性结果。细胞在暴露于有毒物质后也可能发生变化或分化，产生自发荧光。为避免这种情况，实验中应设置仅含测试有毒物质的对照组（无染色），以确定是否存在自发荧光。此外，FBS 和酚红等常见培养基补充剂会增加荧光测量的背景水平，使用底部读数仪可减少培养基的自发荧光，若有毒物质有自发荧光，可选择发射远红光的荧光团或其他检测方法（如发光）。
4. 选择合适的溶剂载体：亲水性化合物常用的溶剂有水、PBS 或细胞培养基，只要不影响离子平衡或过度稀释细胞培养基，对细胞影响较小。甲醇（MeOH）和乙醇（EtOH）适用于亲脂性化合物，但它们易挥发，难以精确吸取，建议使用正位移移液器。这两种溶剂会增加细胞膜的流动性，乙醇的亲脂性更强，对细胞膜的危害更大，一般认为 1 - 2% 的最终浓度可被大多数细胞耐受。乙腈也是常用溶剂，但其代谢产物氰化物可能有毒，0.3% 的最终浓度通常被认为对普通细胞培养系统是安全的。DMSO 是体外实验常用的溶剂，能促进物质跨膜摄取，但需注意其浓度。低浓度（≤1%，<0.1% 更佳）的 DMSO 可降低活性氧（ROS）水平，提高细胞活力和抗氧化剂水平；高浓度（≥1%）则会促进氧化应激，增强细胞凋亡和细胞毒性，建议使用 0.1 - 0.5% 的 DMSO。
5. 检测对照：实验中应设置正确的对照，包括阴性对照（细胞不暴露于任何测试化合物，应表现出正常细胞行为）、阳性对照（用于评估检测性能）和溶剂对照（细胞仅暴露于载体溶剂，用于了解溶剂对细胞的影响）。比较阴性对照和溶剂对照，可发现溶剂单独作用对细胞增殖、形态或死亡的影响。实验中需保持溶剂浓度恒定，同时注意测试化合物与溶剂可能的协同效应。此外，还应考虑自发荧光和染色特异性的额外对照。
6. 给药方法：将测试化合物添加到细胞培养物中的方法主要有直接给药和间接给药。直接给药是将测试化合物直接加入含有细胞和暴露培养基的孔中，适用于 48 孔及以下的培养板，且最终暴露培养基体积 > 500 µL；但对于 96 孔及以上的培养板，直接给药可能因添加的储备溶液体积过小而具有挑战性，且给药后培养板的搅拌方式可能影响结果。间接给药是先将测试化合物在暴露培养基中稀释，再加入孔中，更便于精确操作，适用于 96 孔和 384 孔培养板。对于亲脂性化合物，为避免其吸附在塑料容器上，建议使用玻璃管制备暴露溶液。此外，为减少 96 孔板中的差异，可随机进行暴露处理，并在板中设置多个对照。
7. 常见检测方法
   • 显微镜观察：建议在生物测定过程中多次使用显微镜观察细胞。在细胞接种前，观察细胞是否健康；接种后立即观察，确保接种过程的一致性；在暴露于有毒物质前后观察，记录细胞形态变化；在暴露结束后，添加细胞活力荧光团前观察，确定是否有可观察到的毒性效应。
   • 活力测定：OECD Test No. 249 推荐使用 Alamar Blue、CFDA - AM 和 Neutral Red 三种活力测定方法。Alamar Blue 用于测量细胞代谢活性，其原理是代谢活跃的细胞将蓝色、弱荧光的刃天青（resazurin）还原为粉红色、强荧光的试卤灵（resorufin），但细胞过多或孵育时间过长，试卤灵可能进一步还原为无色、无荧光的二氢试卤灵。鱼类细胞在 L - 15/ex 培养基中代谢更活跃，与 Alamar Blue 孵育 1 小时即可获得敏感读数，而在普通 L - 15 培养基中需 3 - 4 小时。此外，Alamar Blue 对细胞无毒，实验后细胞可用于其他应用，且不受外排泵底物 / 抑制剂的干扰，相比 MTT 测定更具优势。CFDA - AM 用于测量细胞膜完整性，其为非极性、非荧光染料，可迅速扩散进入细胞，若细胞膜完整，会被非特异性酯酶转化为极性、荧光的 5 - 羧基荧光素（CF），CF 扩散出细胞较慢。该染料可与 Alamar Blue 结合使用，其激发和发射波长不重叠。读取结果时，由于细胞在孔中的分布可能不均匀，建议在每个孔中读取多个单点（“孔扫描”），也可通过荧光显微镜观察，但需先使用板读数仪读取，以免显微镜观察导致荧光漂白。Neutral Red 用于测量溶酶体活性，活细胞可将其积累到溶酶体中，细胞死亡时摄取能力下降。该染料可在有毒物质暴露前或后添加，若在暴露前添加，测量终点为染料释放；若在暴露后添加，测量终点为染料摄取。由于该测定需要固定细胞，实验后细胞无法用于其他应用。Neutral Red 摄取可通过吸光度和荧光测量，荧光测量更敏感，但在固定步骤中，部分细胞系可能会从孔表面脱落，需通过显微镜检查确保读数准确。
8. 复杂模型系统：目前，现代体外鱼类模型的开发有限。这些模型有助于更好地理解鱼类基本生理学，预测化学物质在鱼类中的摄取和生物积累，对风险评估至关重要。复杂的体外模型系统通常涉及三维（3D）细胞培养（如球体）、两种或多种细胞类型的共培养以及多细胞、类器官结构的形成。微流控流动系统（器官芯片系统）可模拟血液、水或肠液的循环，产生剪切应力，影响细胞过程和物质运输。器官芯片系统可进行同一器官不同细胞类型的共培养，研究器官典型的细胞间通讯和生物物理、生化功能，还可连接多个培养室，研究器官间的相互作用（如鳃 - 肝和肠 - 肝）。例如，彩虹鳟鱼非分化成纤维细胞（RTG - 2 细胞系）培养成的类器官在研究水霉感染方面比传统二维细胞培养更接近体内情况；彩虹鳟鱼肝脏细胞系 RTL - W1 和原代肝细胞成功制备了肝脏球体，其微环境与体内组织相似，代谢能力增强，适合研究生物转化途径；“鱼肠芯片” 微流控模型基于彩虹鳟鱼细胞系 RTgutGC（肠上皮细胞）和 RTgutF（肠成纤维细胞）共培养建立，可研究肠道屏障功能，预测化学物质摄取和生物积累。但在使用复杂体外系统时，需与简单系统进行比较，确保结果真实可靠。同时，要注意微流控系统的密封和流速优化，避免细胞脱落或与静态系统无差异。若暴露试剂为亲脂性化合物，还需注意其在塑料上的吸附问题。

总结

生物通 版权所有