### 研究背景
宰前过程对肉牛而言是一段充满压力的时期，运输、温度、饲养密度、处理方式以及饲料禁食等因素，都会引发牛的应激反应。这些应激因素会使牛体内循环的激素（如皮质醇、糖蛋白、结合珠蛋白和嗜铬粒蛋白 A）水平升高，消耗肌肉糖原储备，进而对肉的嫩度和颜色产生负面影响。同时，胃肠道（GIT）微生物组也会受到这些因素的影响，尤其是饲料禁食。
饲料禁食通常在宰前过程中实施，目的是减少屠宰时胃肠道的内容物。然而，它却带来了诸多不良后果，比如酸中毒、粪便病原体排放增加以及炎症反应。在禁食期间，有益细菌数量减少，而产酸细菌（如链球菌）和病原体（如非伤寒沙门氏菌）则趁机生长。这不仅对肉牛产业构成重大挑战，因为酸中毒可能导致粪便病原体在动物间传播，还会破坏肠道屏障功能，加剧应激和炎症反应。
近年来，虽然对饲料禁食影响的研究有所开展，但针对整个胃肠道微生物组以及荷斯坦 × 安格斯杂交牛的研究却相对较少。荷斯坦 × 安格斯杂交牛在美国的养殖数量日益增加，它们为奶农带来了显著的经济效益，且在肉质大理石花纹和消费者满意度方面优于纯种荷斯坦牛。然而，这类杂交牛比纯种肉牛更容易患酸中毒和肝脓肿，这表明它们的瘤胃和下胃肠道结构及微生物群落可能对高谷物饮食、饲料禁食及其他宰前因素更为敏感。因此，深入了解宰前过程对荷斯坦 × 安格斯杂交牛胃肠道微生物组的影响，对于改善肉质和保障食品安全具有重要意义。
材料与方法
- 样本采集：选取 9 头约 20 月龄的荷斯坦 × 安格斯杂交牛，从威斯康星州哥伦比亚县的一个养殖场运往威斯康星大学麦迪逊分校的美国农业部加工设施。在运输前，牛被禁食约 10 小时，随后装车运输 1 小时到达加工设施，并在那里停留 1 - 3 小时后进行屠宰。屠宰时间分别为 4 月 6 日、4 月 25 日、6 月 8 日和 8 月 10 日，不同日期的牛平均育肥体重有所差异。在屠宰后，从胃肠道的 7 个位置（瘤胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和大肠）采集消化物样本，瘤胃样本还进一步分离为固体和液体部分，所有样本在提取 DNA 前均保存在 - 20°C。
- 16S rRNA 基因测序：样本解冻后，取 325mg 放入 2mL 微量离心管中，使用 Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit 提取 DNA，并进行 10 分钟的珠磨步骤。用 Nanodrop 1000 分光光度计对 DNA 浓度进行定量，浓度高于 15ng/µL 的样本稀释至 10ng/µL，低于 15ng/µL 的样本则不稀释。接着，使用高保真聚合酶和双索引引物扩增 16S rRNA 基因的 V4 区域，PCR 产物经凝胶电泳确认后，用 SequalPrep Normalization kit 进行标准化处理，构建最终文库。文库 DNA 浓度经特定试剂盒和 Qubit 4 荧光计测定后，稀释至 6pM，与 PhiX v3 对照混合，加载到 MiSeq v2（500 循环）试剂 cartridges 中进行测序。测序完成后，序列从 Illumina BaseSpace 下载，输入 QIIME2 - amplicon - 2023.9 进行分析，包括分类学注释、序列修剪等，最终将相关文件上传到 R Studio 进行统计分析。
- 统计分析：运用多个 R 语言包（如 Phyloseq、qiime2R、DEseq2、vegan、microbiomeutilities 和 SpiecEasi）进行统计分析和可视化。通过线性回归模型分析和可视化 α 多样性指标，包括 Pielou 均匀度、观测特征数、Simpson 指数、Chao 指数和 Shannon 多样性指数，并对模型进行正态性检验，根据 Akaike 信息准则（AIC）选择最佳模型。使用方差分析（ANOVA）检验组间差异和相互作用，用 Tukey 的诚实显著差异检验进行 α 多样性的成对比较。通过 Bray - Curtis 相异指数和加权 Unifrac 距离矩阵评估 β 多样性，并使用相似性分析（ANOSIM）函数考虑变异和种群分散情况。采用核心微生物组分析（设定检测阈值为 0.01 的相对丰度和 20% 的流行率）确定核心微生物成员，用 DESeq2 包进行差异丰度分析，通过特定方法构建和可视化共现网络。由于样本量较小，在差异丰度分析和共现网络分析中，将同一胃肠道隔室内的不同位置样本合并为瘤胃（瘤胃固体和液体）、小肠（十二指肠、空肠和回肠）和后肠（盲肠和大肠）三个位置进行分析。
结果
- 微生物多样性在胃肠道和不同屠宰日期间存在差异：胃肠道位置是影响微生物多样性和群落差异的最重要因素，盲肠的丰富度和均匀度最高，空肠的丰富度最低。育肥体重对微生物多样性和群落结构也有显著影响。屠宰日期同样显著影响样本的丰富度、均匀度和群落组成，4 月 25 日屠宰的牛微生物多样性最高，8 月 10 日屠宰的牛多样性最低。此外，胃肠道位置和屠宰日期之间存在交互作用，影响群落组成、样本丰富度和均匀度。由于同一胃肠道隔室内不同位置的群落结构差异不显著，因此在后续分析中将其合并。
- 胃肠道不同部位的群落组成存在差异：整个胃肠道的群落结构发生变化，相邻位置有许多共享的分类群。瘤胃液体和固体部分的主要分类群和核心成员相似，Prevotellaceae YAB2003、Prevotella、Succinivibrionaceae UCG - 001、Treponema、Muribaculaceae 和 Rikenellaceae RC9 肠道群是瘤胃中最丰富的分类群，也是共享的核心成员，瘤胃中甲烷菌的代表较少。瘤胃的主要分类群和核心成员在皱胃中也几乎相同。下胃肠道有许多高度丰富和核心的分类群，十二指肠、空肠和回肠共享许多核心分类群，盲肠和大肠也有许多共同的主要分类群，但大肠与盲肠相比，有一些分类群不同，且后肠中甲烷菌的种类比瘤胃更多。
- 低丰度分类群对每个胃肠道隔室的群落结构至关重要：构建了瘤胃、小肠和后肠的共现网络，通过计算中心度、接近中心度和中介中心度确定节点的枢纽分数，枢纽分数为 1 表示是生态系统中的关键成员。瘤胃和小肠中得分最高的 25 个枢纽的分数大多高于 0.7，而后肠中 19 个得分最高的枢纽分数低于 0.7。在瘤胃中，Moryella 虽然丰度相对较低，但却是得分最高的枢纽；在小肠中，Muribaculaceae 得分最高；在后肠中，Acinetobacter 是得分最高的枢纽，尽管它不在盲肠和大肠的前 40 个最丰富分类群中，也未在核心微生物组分析中出现。
- 微生物组多样性最高和最低的屠宰日期存在许多差异丰富的分类群：比较微生物组多样性最高的 4 月 25 日和最低的 8 月 10 日，发现瘤胃中 8 月 10 日有几种 Prevotella 扩增子序列变异（ASVs）、Methanobrevibacter、Fibrobacter 和 Bacteroidota 富集；小肠中有 93 种差异丰富的分类群，包括许多 Prevotellaceae、Lachnospiraceae 和 Rikenellaceae 家族的分类群，4 月 25 日小肠中有三种产甲烷 ASVs 富集；后肠中 4 月 25 日除了产甲烷 ASVs 外，还有 Eubacterium coprostanoligenes 组、Clostridia UCG - 014 和 Desulfovibrio 等富集。
讨论
胃肠道微生物组在肉牛生产和食品安全中起着关键作用。正常情况下，瘤胃微生物组可防止有害细菌的快速生长和主导，小肠和后肠的微生物群落能促进黏液分泌，阻止病原体定植。然而，在应激条件下，如饲料禁食，有益细菌减少，机会性病原体增殖，可能导致酸中毒、炎症和病原体迁移，影响肉质和食品安全。
本研究中，不同屠宰日期的牛胃肠道微生物组存在显著差异，可能是由于饲料禁食时间的不确定性、温度差异以及育肥体重等因素导致。此外，研究还发现胃肠道微生物组网络和组成中存在与炎症相关的分类群，如瘤胃中的 Megasphaera 和 Streptococcus 可能导致酸中毒，小肠中的 Streptococcus 和 Muribaculaceae 以及后肠中的 Muribaculaceae 和 Parabacteroides 与炎症有关，这些都会影响肉质。
研究还在胃肠道中鉴定出了几种潜在的致病和腐败细菌，如瘤胃中的 Moryella 与乳腺炎和大肠杆菌 O157:H7 粪便排放有关，小肠中的 Clostridium senso stricto 1 与小牛腹泻有关，回肠中的 Pseudomonas 是潜在的机会性病原体和腐败生物，后肠中的 Acinetobacter 具有抗菌耐药性。这些细菌的存在增加了宿主感染的风险，凸显了了解胃肠道微生物群落对保障食品安全和肉质的重要性。
荷斯坦 × 安格斯杂交牛的数量不断增加，但它们患肝脓肿的概率较高，这与胃肠道微生物组有关。本研究中，Bacteriodes 和 Acinetobacter 等在肝脓肿微生物组中也有发现，虽然饲料添加剂泰乐菌素（tylosin phosphate）可减少肝脓肿，但会导致细菌产生耐药性，带来食品安全风险。因此，调节微生物组成为控制反刍动物胃肠道微生物病原体的更理想方法，未来需要进一步研究将屠宰时的胃肠道微生物组与肝脓肿和抗生素使用联系起来，以确定减轻经济损失和改善食品安全的方法。
本研究为未来利用胃肠道微生物组减轻宰前过程对福利、肉质和食品安全的影响提供了研究方向。例如，保护或调节瘤胃微生物组可降低饲料禁食期间肝脓肿或炎症的风险；减少小肠中促炎分类群的丰度可减轻全身炎症；进一步评估饲料禁食的利弊，以平衡加工便利性和食品安全。本研究为全面了解屠宰时牛的胃肠道微生物组状态提供了重要依据。
生物通微信公众号
