综述：揭示神经退行性疾病中的外泌体生物标志物：基于液相色谱 - 质谱（LC-MS）的分析

本文聚焦神经退行性疾病（NDs），详细阐述外泌体在其中的作用，介绍基于液相色谱 - 质谱（LC-MS）的外泌体分析技术，包括其工作流程、优势及面临的挑战，为 NDs 的诊断、治疗及研究提供了全面且有价值的信息。

1. 引言

神经退行性疾病（NDs）是一类以神经元进行性丧失、突触功能障碍和神经系统结构退化为特征的疾病，像阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等，它们有着蛋白质聚集、线粒体功能障碍和氧化应激等共同病理特征。这些疾病的病因复杂，由遗传、环境和生活方式等多种因素相互作用导致。早期准确诊断 NDs 至关重要，不仅有助于及时治疗，改善患者生活质量，还能推动研究和新疗法的开发。外泌体生物标志物在生物流体中可检测，为 NDs 的早期诊断、疾病监测和个性化治疗带来了希望，而液相色谱 - 质谱（LC-MS）技术对发现外泌体生物标志物起着关键作用。

2. 外泌体结构、组成和生物发生

2.1 外泌体：结构和组成

外泌体是小型细胞外囊泡（EVs），具有与细胞膜相似的脂质双层结构，包含磷脂酰丝氨酸、胆固醇等多种脂质，为其内容物提供保护。外泌体含有大量蛋白质，包括跨膜蛋白（如四跨膜蛋白 CD9、CD63、CD81 等）、胞质蛋白（如热休克蛋白 Hsp70、Hsp90）和参与外泌体形成的蛋白。核酸也是外泌体的重要成分，尤其是 RNA，如信使 RNA（mRNAs）、微小 RNA（miRNAs）等，可调节受体细胞的基因表达。此外，外泌体还可能携带 DNA 和代谢物，其具体成分因来源细胞的类型、生理或病理状态以及分离和表征方法而异。

2.2 外泌体生物发生和释放

外泌体的形成始于多泡体（MVBs）内的腔内囊泡（ILVs）发育。这一过程从细胞膜内吞形成早期内体开始，早期内体成熟时，膜内陷形成 ILVs。货物分选进入 ILVs 的过程复杂且受多种机制调控，包括内体分选转运复合体（ESCRT）途径和 ESCRT 非依赖途径。ESCRT 途径由四个复合体（ESCRT - 0、-I、-II 和 - III）组成，可确保蛋白质和脂质的选择性分选。ESCRT 非依赖途径则常依赖脂质介导的过程，如神经酰胺积累可诱导膜弯曲促进 ILV 形成。MVBs 形成后，可与溶酶体融合降解或与细胞膜融合释放 ILVs 成为外泌体，这一决策受细胞信号和代谢状态影响，小 GTP 酶 RAB35 在其中起关键调节作用。外泌体分泌到细胞外后，通过与受体细胞结合、融合或被内吞等方式参与细胞间通讯，在神经退行性疾病中，可传播致病蛋白促进疾病进展。

3. 神经退行性疾病中致病蛋白的传播：外泌体的作用

NDs 的一个重要特征是错误折叠蛋白以朊病毒样方式在细胞间传播，外泌体作为纳米级细胞外囊泡，可促进这一传播过程。

3.1 外泌体在淀粉样蛋白和 tau 蛋白传播中的作用及治疗意义

在 AD 中，外泌体是 Aβ 和 tau 蛋白传播的关键介质。Aβ 肽由淀粉样前体蛋白（APP）衍生，通过外泌体分泌并在淀粉样斑块中积累，其传播涉及外泌体被邻近细胞摄取，引发进一步的错误折叠和聚集。磷酸化 tau 蛋白也通过外泌体传播，在早期 AD 患者的脑脊液中可检测到外泌体 tau。此外，外泌体还通过运输促炎细胞因子和信号分子加剧神经炎症，导致血脑屏障（BBB）破坏和神经元变性。基于外泌体在 AD 病理中的作用，抑制外泌体生物发生和释放、阻止外泌体在受体细胞的摄取或利用工程化外泌体递送治疗分子等策略具有潜在治疗意义。

3.2 α- 突触核蛋白和外泌体在帕金森病中的传递

在 PD 中，致病蛋白 α- 突触核蛋白（α-syn）以寡聚体和单体形式通过外泌体分泌。外泌体相关的 α-syn 可诱导受体神经元毒性，加速聚集和病理进程。PD 患者的外泌体可促进靶细胞中 α-syn 的寡聚化，外泌体膜上丰富的神经节苷脂（如 GM1 和 GM3）为 α-syn 聚集提供了成核环境。

3.3 外泌体在朊病毒疾病传播中的作用

朊病毒疾病体现了神经退行性疾病的传染性，错误折叠的朊病毒蛋白（PrP^sc）可将正常朊病毒蛋白（PrP^c）转化为致病形式。PrP^c和 PrP^sc都通过外泌体分泌，促进细胞间朊病毒传播，外泌体相关的 PrP^sc保留了其感染性，表明外泌体在朊病毒疾病进展中起重要作用。

3.4 神经炎症和外泌体介导的传播

小胶质细胞介导的神经炎症是 NDs 的标志之一，外泌体相关的致病蛋白会加剧这一过程。在 AD 中，外泌体 Aβ 和 tau 寡聚体破坏小胶质细胞代谢，加重炎症。此外，外泌体携带的错误折叠蛋白，如 α-syn、tau 和 Aβ，有助于神经退行性病理的传播，这种外泌体与免疫细胞的复杂相互作用凸显了神经退行性变的复杂性和治疗干预的机会。

3.5 外泌体作为神经退行性疾病的治疗工具

外泌体因其能够穿越血脑屏障、携带生物活性分子和实现靶向药物递送，成为治疗 NDs 的有前景的工具。外泌体的天然生物相容性和表面工程潜力使其能够精确靶向受影响的脑区。基于外泌体的药物递送系统在治疗 AD 和 PD 等神经系统疾病中显示出疗效，但在临床应用中，外泌体的分离、纯化和规模化仍面临挑战，目前正在研究工程化外泌体以实现细胞特异性递送和封装治疗分子。同时，外泌体也有望作为 NDs 早期诊断和监测的生物标志物。

4. 外泌体的分离、纯化和表征：蛋白质组学和代谢组学分析的基础

4.1 外泌体的分离和纯化

可靠的外泌体分离和纯化方法对研究其在神经退行性疾病中的作用至关重要。常用技术包括超速离心、尺寸排阻色谱（SEC）和免疫亲和捕获，各有优缺点。超速离心是分离外泌体的金标准方法，基于大小和密度通过高离心力分离，但可能共分离污染物，常需额外纯化步骤。SEC 通过多孔基质按大小分离颗粒，能保留外泌体的结构完整性和生物活性，适合下游分析，但对相似大小颗粒的分辨率有限。免疫亲和捕获利用抗体靶向表面标记分离特定外泌体亚群，特异性和纯度高，但抗体成本高，需要优化且可能存在亚型偏向。

4.2 外泌体的表征

准确表征外泌体对于理解其功能和识别潜在生物标志物至关重要。常用的分析技术包括透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和流式细胞术。TEM 可提供外泌体内部结构的详细信息，SEM 专注于表面形态和三维结构，两者都有助于确认外泌体的形态和纯度，但耗时且需要专业设备。NTA 通过跟踪布朗运动测量外泌体的大小分布和浓度，对 50 - 150nm 范围内的颗粒分析有效，但对较小颗粒分辨率有限。流式细胞术利用荧光标记抗体对外泌体进行表型分析，高分辨率技术的进步提高了对小囊泡的检测能力，有助于识别外泌体亚型。

5. LC-MS 工作流程：从蛋白质到代谢物

使用 LC-MS 分析外泌体货物是一个综合过程，整合了蛋白质组学和代谢组学以精确识别和量化蛋白质和代谢物。首先通过超速离心、尺寸排阻色谱或沉淀等技术从生物流体或细胞培养基中分离外泌体，然后用变性缓冲液（如 RIPA 或尿素缓冲液）裂解外泌体，溶解其内容物。在蛋白质组学分析中，先进行蛋白质定量（如使用二喹啉甲酸（BCA）测定法），接着用二硫苏糖醇（DTT）还原蛋白质中的二硫键，用碘乙酰胺烷基化防止二硫键重新形成，再用胰蛋白酶将蛋白质酶解为肽段，通过固相萃取（SPE）纯化和浓缩肽段，利用高效液相色谱（HPLC）根据疏水性等理化性质分离肽段，最后用高分辨率质谱仪（如 Orbitrap 或 Q-TOF）进行分析，通过肽段的质荷比和二级质谱（MS/MS）的碎片模式实现蛋白质的准确识别和量化。在代谢组学分析中，前处理步骤与蛋白质组学类似，裂解后通过液相色谱分离代谢物，根据目标代谢物选择反相液相色谱（RPLC）或亲水相互作用色谱（HILIC）等技术，再用质谱进行分析，实现对多种化合物的详细识别和量化，全面捕捉与病理条件相关的生化变化。

6. 定量蛋白质组学：技术和影响

定量蛋白质组学使用 LC-MS 是比较不同实验条件下蛋白质丰度的有力工具，有助于发现生物标志物和理解疾病机制。主要技术包括无标记定量（LFQ）、细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）和串联质量标签（TMT）标记。LFQ 直接测量肽段强度或计数 MS/MS 光谱来估计蛋白质丰度，具有简单、适用于大规模研究的优点，但易受样本制备、LC-MS 性能和电离效率等因素影响，不过归一化算法的进步提高了其准确性和可靠性，已用于识别与神经退行性疾病相关的外泌体蛋白。SILAC 是一种代谢标记方法，通过在含有同位素标记氨基酸的培养基中培养细胞，使蛋白质在合成过程中掺入标记，从而根据同位素比率精确量化蛋白质丰度，具有高重复性和准确性，适用于体外研究，但体内代谢标记对大多数生物体不实用。TMT 标记是一种等压化学标记方法，可在一次 LC-MS 运行中同时分析多达 16 个样本，通过标记试剂在 MS/MS 分析中释放不同质量的报告离子来提供蛋白质水平的定量信息，高效且适用于复杂生物样本，在神经退行性疾病研究中已用于识别与炎症、突触活动和线粒体功能相关的外泌体蛋白变化。此外，还有自上而下、中自上而下和自下而上的蛋白质组学方法，自上而下的方法分析完整蛋白质，保留其结构完整性和翻译后修饰（PTMs）；中自上而下的方法通过部分消化蛋白质为较大片段来研究结构复杂的蛋白质；自下而上的方法是最常用的，将蛋白质酶解为小肽段进行高通量蛋白质识别和量化，这些方法相互补充，为分析外泌体提供了全面的框架。

7. 利用 LC-MS/MS 进行神经退行性疾病中外泌体的分析

LC-MS/MS 在研究神经退行性疾病（如 AD、PD 和 ALS）中的外泌体方面发挥了重要作用，能够深入分析外泌体的分子货物，有助于识别诊断生物标志物、表征疾病机制和发现治疗靶点，推动了神经退行性疾病研究的发展。

7.1 LC-MS/MS 在 AD 研究中的应用

LC-MS/MS 为 AD 研究提供了精确分析外泌体分子货物的手段，在诊断、疾病监测和治疗开发方面取得了显著进展。

• 蛋白质组学见解：揭示疾病机制：AD 的特征是 Aβ 沉积和 tau 聚集，早期诊断困难。LC-MS/MS 有助于识别与 AD 病理相关的外泌体衍生蛋白，如脑脊液和血浆中富含的 Aβ 肽和磷酸化 tau（p-tau），这些蛋白与疾病严重程度和认知能力下降相关，可作为早期诊断和监测的生物标志物。此外，蛋白质组学研究还发现了与突触功能障碍和神经炎症相关的外泌体蛋白，强调了外泌体在传播病理信号和反映疾病机制中的双重作用。
• 脂质组学贡献：洞察膜动力学：脂质组学分析揭示了 AD 患者外泌体脂质组成的显著改变，包括鞘磷脂、神经酰胺和胆固醇等脂质物种的失调，这些变化与淀粉样生成途径和神经元凋亡有关，表明脂质组学在揭示疾病机制和识别诊断及治疗靶点方面的潜力。
• 代谢组学分析：系统了解 AD：代谢组学研究发现 AD 患者外泌体中与能量代谢、氧化应激和神经递质合成相关的代谢物发生改变，这些变化可作为潜在的早期诊断生物标志物。例如，用硫胺素前药苯磷硫胺（BFT）治疗可显著改变某些代谢物和脂质物种，逆转与 AD 进展相关的变化。
• 外泌体生物标志物在非侵入性诊断中的应用：尿液和血浆中外泌体生物标志物的识别为神经退行性疾病的非侵入性诊断提供了有前景的方法。尿液外泌体具有采集方便、稳定性高和污染少等优点，研究发现其含有与 AD 病理相关的蛋白质和 miRNA。血浆外泌体反映了全身和中枢神经系统相关的分子变化，也具有诊断价值。进一步比较脑脊液、血浆和尿液中外泌体生物标志物的特异性、稳定性和诊断性能，对于优化非侵入性诊断策略至关重要。
• 新蛋白质发现和荟萃分析：先进的蛋白质组学研究鉴定出数千种与 AD 病理相关的蛋白质，荟萃分析验证了如 p-tau 和神经元来源外泌体（NDEs）等生物标志物的诊断价值，表明其在不同研究中的高诊断准确性。

7.2 利用 LC-MS/MS 解析帕金森病病理

PD 是全球第二常见的神经退行性疾病，目前的早期诊断和治疗方法有限。外泌体在揭示 PD 发病机制方面具有重要作用，LC-MS/MS 有助于识别外泌体相关的生物标志物和治疗靶点。

• 基于外泌体的 PD 生物标志物：LC-MS/MS 检测到脑脊液和血浆中外泌体 α-syn 聚集物，其可作为早期 PD 检测的潜在非侵入性生物标志物，脑脊液中外泌体磷酸化 α-syn 对区分 PD 患者和健康对照尤其有前景。此外，还发现了与自噬和线粒体质量控制相关的蛋白质（如 DJ-1 和 LRRK2）以及脂质物种（如神经酰胺和鞘脂）的变化。外泌体 miRNA 也是重要的 PD 生物标志物，如 miR-7-1-5p 和 miR-223-3p 与疾病进展和治疗反应相关，miR-137 和 miR-100-5p 等在调节氧化应激和保护多巴胺能神经元方面发挥作用。
• LC-MS/MS 对 PD 病理生理学的见解：LC-MS/MS 揭示了外泌体 α-syn 在 PD 中传播神经元毒性和病理的作用，以及外泌体中与线粒体功能障碍、氧化应激和炎症相关的蛋白质失调，突出了外泌体在疾病进展中的关键作用。此外，对 PD 患者唾液的蛋白质组学分析表明唾液可作为非侵入性诊断介质，血浆和红细胞外泌体中 α-syn 水平的变化以及血清代谢组学分析发现的独特代谢特征，都为 PD 的诊断和治疗提供了新的方向。
• 外泌体在 PD 治疗中的应用：LC-MS/MS 有助于分析外泌体内容物，优化其治疗设计。例如，富含 miR-100-5p 的滋养层间充质干细胞来源的外泌体（T-MSCs-Exo）可减少氧化应激、保护多巴胺能神经元并改善 PD 模型中的运动功能。抑制外泌体 miR-137 可减轻氧化应激、增强神经元活力和改善运动功能。血小板来源的细胞外囊泡（PEVs）富含神经保护因子，可恢复多巴胺能功能并减少炎症，LC-MS/MS 分析其蛋白质组和脂质组有助于揭示其治疗潜力。

7.3 LC-MS/MS 揭示的 ALS 外泌体生物标志物

ALS 是一种严重的神经退行性疾病，需要更好的诊断工具和治疗方法。LC-MS/MS 在研究 ALS 病理生理学、识别外泌体生物标志物和治疗靶点方面发挥了重要作用。

• 蛋白质组学对 ALS 的见解：LC-MS/MS 蛋白质组学研究发现 ALS 患者脑脊液和血浆中的外泌体携带与疾病进展相关的关键蛋白，如 TDP-43、FUS 和 SOD1。血浆外泌体 TDP-43 和神经丝轻链（NFL）是可靠的预后生物标志物。此外，研究还揭示了外泌体在传播致病蛋白中的作用，如外泌体 TDP-43 可诱导受体细胞聚集和毒性，C9orf72 二肽重复蛋白（DPRs）通过外泌体传播促进 ALS 病理。
• LC-MS/MS 研究的关键发现：蛋白质组学分析发现 ALS 患者与健康对照的脑脊液外泌体中蛋白质表达存在显著差异，涉及应激反应、RNA 代谢和线粒体功能障碍等相关蛋白。基于特定蛋白质的分类器可有效区分 ALS 与非 ALS 样本，如 CXCL12 被确定为早期散发性 ALS（sALS）患者脑脊液中的关键生物标志物，其可能参与炎症、神经胶质信号传导和神经元保护