引言
膀胱癌（BLCA）是全球第十大常见恶性肿瘤，每年新增约57.3万病例，死亡约21.3万例。根据肿瘤浸润深度，膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）。NMIBC肿瘤局限于黏膜或黏膜下层，而MIBC肿瘤已侵犯肌层或更深。尽管诊断和治疗手段不断进步，MIBC的预后仍然较差，5年生存率仅为60%–70%。膀胱癌具有显著的组织学异质性，其中尿路上皮癌占90%以上，其余为鳞状细胞癌、腺癌、神经内分泌肿瘤等罕见亚型。膀胱癌的高复发率和进展风险凸显了建立稳健的分子分层系统以指导临床决策的迫切性。
肿瘤微环境（TME）是癌症进展和治疗反应的关键决定因素。在TME组分中，癌症相关成纤维细胞（CAF）是最丰富的基质细胞类型，通过细胞外基质（ECM）重塑、生长因子和细胞因子分泌以及免疫应答调节，在肿瘤进展中发挥关键作用。近期单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究揭示了CAF群体的显著异质性，识别出不同的功能亚型，包括炎症性CAF（iCAF）、肌成纤维细胞性CAF（myCAF）和抗原呈递CAF（apCAF）。在膀胱癌中，CAF相关的TGF-β活性与T细胞排斥和抗PD-L1原发性耐药机制相关。单细胞研究已发现与MIBC不良预后相关的iCAF，突出了CAF异质性作为临床结局的决定因素。尽管取得了这些进展，但专门针对膀胱癌进展的基于CAF的预后模型仍然有限。大多数现有的预后特征侧重于肿瘤细胞内在特征或免疫浸润模式，忽视了CAF异质性对疾病进展的关键贡献。此外，特定的CAF相关基因影响膀胱癌进展的分子机制需要进一步阐明。
环指蛋白11（RNF11）是一个由154个氨基酸组成的蛋白质，最初在乳腺癌中被发现过表达。后续研究表明RNF11在胰腺和结肠肿瘤中也过表达。RNF11是一种RING指蛋白，是A20泛素编辑复合物下调NF-κB信号所必需的。功能上，RNF11促进A20介导的去泛素化以抑制TNF诱导的NF-κB活化，该调控机制已在神经元和神经母细胞瘤细胞系中得到验证。此外，RNF11调节表皮生长因子受体（EGFR），影响细胞对生长信号的应答。虽然RNF11失调与多种癌症有关，但其在膀胱癌进展中的具体作用及其与CAF介导的肿瘤进展的关系尚未探索。
单细胞聚类分析与CAF特征基因鉴定
为了在单细胞分辨率下描绘膀胱癌肿瘤微环境的细胞异质性，研究分析了一个已发表的scRNA-seq数据集（GSE267718），该数据集包含8例膀胱癌患者的样本（4例MIBC，4例NMIBC）。经过严格的质量控制，保留了30,428个高质量单细胞用于后续分析。通过无偏聚类分析，识别出六个不同的细胞群体：髓系细胞（LYZ）、T细胞（CD3E）、上皮细胞（KRT19）、内皮细胞（PLVAP）、CAF（COL1A1）和B细胞（CD79A）。细胞特异性标记基因的表达模式通过点图进行可视化。值得注意的是，髓系细胞高表达TYROBP、FCER1G、LYZ和CD68，而CD3E和IL32主要在T细胞中表达。成纤维细胞的特征是COL1A1、COL1A2和TPM2的高表达。对膀胱癌肿瘤样本的进一步分析显示，T细胞、B细胞、髓系细胞、上皮细胞、CAF和内皮细胞在MIBC和NMIBC中均存在。值得注意的是，CAF仅在样本4、5和6中缺失，而B细胞的分布更为受限，在样本1、2、3、6和7中未检测到。此外，B细胞、CAF、上皮细胞、T细胞和髓系细胞主要来源于MIBC样本，而内皮细胞主要来源于NMIBC样本。
为了探索膀胱癌进展过程中CAF的功能重塑，研究比较了来源于MIBC和NMIBC样本的CAF的转录组。差异表达分析鉴定了557个差异表达基因（DEG）（|log2FC| > 1，FDR <0.05），其中233个基因在MIBC相关CAF中上调，324个基因下调。基因本体（GO）功能富集分析显示，这些上调基因显著富集于蛋白质折叠、ATP代谢过程、嘌呤核糖核苷/核苷三磷酸代谢过程等生物过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，这些上调基因显著富集于内质网中的蛋白质加工以及糖酵解/糖异生。此外，下调基因的GO分析表明其富集于细胞-底物粘附、细胞外基质/结构组织以及细胞对转化生长因子β刺激的应答。KEGG分析显示，下调基因主要富集于PI3K-AKT信号通路、cGMP-PKG信号通路和ECM-受体相互作用。
基于CAF相关基因特征的膀胱癌亚型分型与预后评估
从TCGA数据库获取了359例膀胱癌样本的批量RNA-seq数据。使用557个CAF相关进展基因的表达谱进行进一步分析。单变量Cox回归分析确定了85个与预后显著相关的基因（P < 0.05）。利用非负矩阵分解（NMF）聚类，将样本分为两个分子亚型——簇1（C1）和簇2（C2）。生存分析显示，与C1相比，C2表现出更好的总生存期（OS）和疾病特异性生存期（DSS）。临床数据一致显示C2具有更有利的总生存状态（OSS）和无病生存期（DFS）。C2还具有更低的组织学分级和更早的临床分期，这与其优越的预后一致。根据免疫相关基因表达特征定义的六种免疫亚型分析显示，C1和C2均由1型（伤口愈合）、2型（IFN-γ主导）、3型（炎症）、4型（淋巴细胞耗竭）和6型（TGF-β主导）表型组成。具体而言，6型在C2中的比例更高。
C1表现出高于C2的基质、免疫和ESTIMATE评分
研究计算了两个簇的StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore。这三项评分在C1中均显著高于C2。进一步的CIBERSORT反卷积分析揭示了特定免疫细胞群体在两个簇之间的不同浸润模式。在分析的22种免疫细胞类型中，观察到C1在多种细胞类型中表现出显著更高的浸润评分，包括CD4+记忆活化T细胞、M0、M1、M2巨噬细胞，而记忆B细胞、浆细胞和单核细胞的评分在C1中较低。此外，采用MCPcounter评分来表征免疫浸润景观。在评估的10个细胞群体中，C1簇在CD8+T细胞、细胞毒性淋巴细胞、NK细胞和单核细胞谱系等方面的评分显著高于C2。最后，整合了所有三种算法的结果，并使用复合热图进行可视化，全面展示了簇间不同的免疫景观。
C1中趋化作用相关通路富集
为了描绘C1和C2之间的生物学特征，研究使用limma进行了差异表达分析。鉴定出相对于C2，C1中有1,681个基因显著上调，765个基因下调（|log2FC| > 1；FDR <0.05）。火山图突出显示了几个显著失调的基因，包括上调基因中的PTRF、TGFBI和ARSI，以及下调基因中的FOXA1、WDR52和MSI1。这2,446个DEG的热图可视化清晰地显示了两簇之间不同的表达模式。对C1中上调基因的GO和KEGG分析揭示了与细胞趋化性、白细胞迁移、细胞外基质和结构组织、PI3K-Akt信号通路等相关通路的显著富集。C1中免疫相关通路的富集与其较高的ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore一致。对于C1中的下调基因，GO分析确定了其在脂肪酸代谢过程、激素代谢过程和各种其他代谢过程中的富集。KEGG分析揭示了在化学致癌-DNA加合物、视黄醇代谢和类固醇激素生物合成通路中的富集。
TPFR预后风险模型的构建与验证
为了构建一个与肿瘤进展相关的预后模型，研究首先进行了单变量Cox回归，确定了569个与预后相关的基因（P < 0.05），这些基因随后用于LASSO-Cox回归。随着λ增加，基因系数向零收缩；通过λ值的交叉验证确定λ = 0.03183554为最优值，产生了一个包含47个基因的模型用于后续Cox建模。为了优先选择具有临床价值的特征，应用了基于Akaike信息准则（AIC）的选择，最终得到四个基因：FOXA1、TBX3、LRIG1和RNF11。RNF11和LRIG1与预后负相关（高表达对应更差的生存），而FOXA1和TBX3与预后正相关。
基于这四基因特征（FOXA1、TBX3、LRIG1、RNF11），构建了TPFR预后模型。每位患者的TPFR评分使用训练队列的Cox回归系数计算。在TCGA-BLCA训练队列（n = 359）中，根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。风险评分分布、生存状态和表达热图清晰地揭示了两组之间的不同模式。时间依赖性受试者工作特征（ROC）分析显示了稳健的预测性能，1年、3年和5年的曲线下面积（AUC）分别为0.614、0.611和0.610。Kaplan-Meier生存分析显示，高风险组的总生存期显著差于低风险组。该模型的性能在独立的E-MTAB-4321队列（n = 476）中得到验证。与训练队列一致，风险评分分布和基因表达模式显示出清晰的分层。模型保持了预测准确性，1年、3年和5年的AUC分别为0.699、0.708和0.744。同样，高风险组显示出显著更差的生存结局。总体而言，这些结果表明TPFR模型在独立队列中为膀胱癌患者提供了稳健且可重复的预后预测。
高TPFR评分与肿瘤相关通路相关
研究使用GSVA R包进行单样本基因集富集分析（ssGSEA），计算每位患者的通路活性评分。系统评估了TPFR与TCGA-BLCA队列中KEGG通路富集评分之间的相关性，结果显示TPFR评分与多个癌症相关通路存在显著关联。通路富集分析揭示了与TPFR评分相关的不同模式。涉及细胞结构和通讯的通路，包括肌动蛋白细胞骨架调节、粘着斑、ECM-受体相互作用和间隙连接，与TPFR评分呈正相关。这些通路调节从细胞迁移到组织结构维持等多种细胞功能。此外，几种肿瘤类型特异性通路（黑色素瘤、神经胶质瘤和胰腺癌）也与较高的风险评分呈正相关。代谢通路，特别是那些涉及外源物代谢和脂质代谢的通路，与TPFR评分呈负相关。随后计算了StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore，基于线性回归和Pearson相关分析，这三项评分均与TPFR评分呈正相关。
TPFR模型在>60岁膀胱癌患者中显示出更优的预测性能
为了评估TPFR模型在不同肿瘤分期、性别和年龄分层的患者亚组中的普适性，研究在指定组中进一步验证了该模型。结果显示，TPFR评分与低分期膀胱癌患者的预后呈负相关，而随着肿瘤分期增加，相关性不再显著。此外，较高的TPFR评分与男性患者的预后呈负相关，而在女性患者中未观察到与预后的显著相关性。在>60岁的患者中，TPFR评分与预后呈显著负相关，而在≤60岁的患者中未观察到显著的预后相关性。这些结果表明，在临床应用中，TPFR模型更适用于低分期、老年（>60岁）和男性膀胱癌患者。对不同肿瘤分期的TPFR评分分析显示，其随着肿瘤分期进展而增加。>60岁的患者比≤60岁的患者具有更高的TPFR评分，这与临床上老年膀胱癌患者预后较差的观察一致。在性别方面，女性表现出更高的TPFR评分，这与临床上观察到的女性膀胱癌患者预后较差一致。在多变量Cox回归分析中，TPFR评分、年龄和高分期被确定为膀胱癌的独立风险因素。
RNF11促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭
为了功能验证上述发现，通过shRNA介导的慢病毒感染（shRNF11）在T24和5637细胞中敲低了RNF11。qPCR分析确认了成功的敲低效率。使用CCK-8的细胞增殖实验显示，RNF11敲低显著抑制了两种细胞系的细胞生长。在T24细胞中，shRNF11-1和shRNF11-2在5天培养期间均显示出增殖减少。类似地，RNF11敲低显著抑制了5637细胞的生长。伤口愈合实验显示，RNF11敲低显著损害了细胞迁移能力。在T24细胞中，12小时的迁移率从对照细胞的55%降低到shRNF11-1和shRNF11-2组的约25%。在24小时，对照细胞实现了近70%的伤口闭合，而RNF11敲低细胞仅显示35%–40%的闭合。在5637细胞中观察到类似的抑制效果，RNF11敲低使迁移率在12小时和24小时分别比对照降低了约40%和50%。Transwell侵袭实验进一步证实了RNF11在促进侵袭能力中的作用。在T24细胞中，RNF11敲低使每个视野的侵袭细胞数从对照组的约650个减少到shRNF11组的250-300个。在5637细胞中，侵袭同样被抑制，侵袭细胞数从对照组的约1,050个减少到RNF11缺失组的300-250个。这些功能研究共同表明，RNF11在促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥关键作用，支持其作为膀胱癌潜在治疗靶点的可能性。
RNF11敲低重编程膀胱癌细胞的发育和炎症通路
为了阐明RNF11如何调控膀胱癌细胞的增殖，研究对对照和shRNF11的5637细胞进行了批量RNA测序。差异表达分析揭示了RNF11敲低后显著的转录改变。使用|log2FC| > 0.6和FDR <0.05的标准，鉴定出1,820个显著上调基因和2,483个下调基因。火山图可视化揭示了RNF11敲低后几个显著改变的基因。其中最显著上调的基因包括FABP4、SERPINB2、VIM、NDRG1、OAF、BMP2、GJA1和COL17A1。此外，最显著下调的基因包括RNF11、C15orf48、SCEL、KRT80、IGFBP3、PADI2、S100A9和EMP1。DEG的热图分析揭示了对照和shRNF11样本之间不同的表达模式，证实了RNF11诱导的转录组改变。上调基因的GO富集分析揭示了在发育和形态发生过程中的显著富集。最显著富集的生物过程包括骨化、模式规范过程、细胞质翻译、区域化、表皮发育、皮肤发育、肾脏系统发育和肾脏发育。上调基因的KEGG通路分析确定了在多个疾病和信号通路中的富集，包括肌肉细胞中的细胞骨架、癌症中的蛋白聚糖、角质化包膜形成、HIF-1信号通路和TNF信号通路。对于下调基因，GO富集分析揭示了细胞迁移和炎症反应的显著改变。顶级富集的生物过程包括趋化性、趋向性、伤口愈合和急性炎症反应。下调基因的KEGG通路分析显示在MAPK信号通路、角质化包膜形成、中性粒细胞胞外陷阱形成、细胞粘附分子、溶酶体和白细胞跨内皮迁移中的富集。
基因集富集分析（GSEA）用于检测RNF11敲低细胞中特定KEGG通路的富集情况。TNF信号通路显示负富集（NES = -0.947497，P = 0.5497159），富集图显示运行富集分数呈下降趋势。伴随的热图揭示了TNF信号通路内复杂的转录改变。REL、IL1B、NFKBIA和BCL2A1在shRNF11样本中表达增加，而VCAM1、NFKB2、MAPK3、BIRC3和IL6与对照相比表达降低。类似地，MAPK信号通路在RNF11敲低后表现出负富集（NES = -0.9182553，P = 0.6370757）。表达热图揭示了MAPK通路组分的差异调节，shRNF11细胞中MAP3K4、JUN、MYC和MAPK10上调，而MAP3K3、DUSP4和几个MAPK家族成员表达下降。
讨论
本研究为基于CAF相关转录特征的膀胱癌风险分层提供了一个全面的框架，解决了当前预后方法的一个关键空白。通过整合单细胞转录组学与批量RNA测序数据，开发了TPFR模型，该模型在独立队列中展示了稳健的预后性能。对RNF11的功能验证为膀胱癌进展提供了机制性见解。
单细胞分析揭示了MIBC与NMIBC患者CAF中不同的转录程序，MIBC相关CAF富集于蛋白质折叠、ATP代谢和糖酵解/糖异生，这与活化CAF所描述的代谢重编程一致。还观察到MIBC相关CAF中与ECM组织和TGF-β反应相关的基因发生改变。这与胰腺癌中描述的iCAF（低α-SMA，炎症分泌组）比例较高一致。因此，将这些数据解释为提示随着疾病进展为MIBC，CAF表型向更具代谢活性和免疫调节性的方向转变，同时承认需要空间分辨和功能实验来在膀胱癌中证实这一点。基于NMF的聚类识别出两个不同的CAF相关分子簇，具有显著的生存差异。值得注意的是，与较差预后相关的C1显示出更高的基质和免疫评分，以及免疫抑制通路的富集。鉴于基质细胞已确立的促肿瘤作用，C1中基质的富集与其较差的预后一致。然而，C1中较高的免疫评分和较差的预后与预期的免疫反应抗肿瘤效果形成对比。这一观察结果可能归因于膀胱癌中“免疫排斥”表型的概念，即由于CAF介导的屏障，丰富的免疫浸润未能转化为有效的抗肿瘤免疫。此外，免疫系统是一个复杂且整合的实体，包括抗肿瘤成分（如效应CD8+T细胞）和促肿瘤成分（包括调节性T细胞（Treg）和M2巨噬细胞）。在亚组C1中观察到的较高免疫评分可能归因于免疫抑制细胞群的主导地位，这与后续观察到的较高M2巨噬细胞浸润评分和免疫抑制通路的富集一致。
TPFR模型在训练和验证队列中显示出一致的预后性能，尤其在老年患者（>60岁）和早期疾病中具有强大的区分能力。在早期疾病中的优越性能表明其有潜力用于识别高进展风险的患者，这些患者可能受益于更积极的监测或辅助治疗。
在4个TPFR基因中，RNF11基于经验和机制理由值得优先考虑。它从膀胱癌的scRNA-seq进展基因中提名，并在训练队列中与不良结局相关。作为一种E3泛素连接酶，RNF11在酶活性或底物结合水平上提供了可干预的靶点，而其他小组成员是转录或负调控因子，在当前临床框架中成药性有限。RNF11在多种恶性肿瘤中失调的独立报道进一步支持其疾病相关性和转化潜力。功能数据支持RNF11在膀胱癌中的促肿瘤作用，因为其敲低降低了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。RNF11敲低后的转录组分析揭示了膀胱癌细胞中发育和分化程序的改变。
值得注意的是，虽然RNF11表达在训练队列中与风险评分呈正相关，但在验证队列中观察到相反的关系。几个原因可能解释这种差异。队列组成可能是一个因素，因为E-MTAB-4321包含比TCGA-BLCA（≥T2）更大比例的NMIBC（Ta/Tis/T1），这些不同的分期组成可能导致RNF11的不同表达模式。此外，作为一种E3泛素连接酶，RNF11主要通过翻译后修饰（PTM）发挥作用，mRNA表达可能不完全捕捉其功能状态。这种明显的悖论可能反映了不同患者群体中影响RNF11功能的不同调控机制或翻译后修饰，值得对RNF11的调控和活性而非单纯表达进行进一步研究。
TPFR模型显示出中等的预测准确性，在TCGA-BLCA训练队列中AUC值范围为0.610–0.614，在E-MTAB-4321验证队列中为0.699–0.744。虽然这些值表明区分能力一般，但值得注意的是该模型在两个独立队列中显示出一致的预后分层，Kaplan-Meier分析中高风险组和低风险组存在统计学显著分离。在验证队列中改进的性能（5年AUC高达0.744）表明模型性能可能因队列组成和疾病分期分布而异。
