作者：Isaac Monroy、José Pérez-Navarro、Tania Paniagua-Martínez、Isidoro Olmeda、Sergio Gómez-Alonso、Sergi Ferrer、Isabel Pardo
机构：瓦伦西亚大学生物技术与生物医学研究所（BIOTECMED），地址：西班牙布尔哈索特市Dr. Moliner街50号，邮编46100
摘要
赭曲霉毒素A是一种源自微生物的代谢物，对人体健康具有负面影响。本研究旨在评估四种重组细菌乳糖酶（分别来自Lactobacillus paracasei（同义词Lacticaseibacillus paracasei）ENOLAB 4314、Lactococcus lactis ENOLAB 5298、Pediococcus parvulus ENOLAB 3909和Companilactobacillus bobalius ENOLAB 4382）在葡萄酒中降解赭曲霉毒素A（OTA）的能力。实验前在醋酸钠缓冲液中考察了多种因素，包括氧化还原介质和铜的存在与否，以及葡萄酒多酚提取物的使用情况。通过高效液相色谱-质谱联用技术分析了赭曲霉毒素A及其氧化产物。结果表明，不同来源的乳糖酶对OTA的降解效果存在差异，其中含有(-)-表儿茶素的醋酸钠缓冲液和铜的组合在降解OTA方面表现更优。在天然红葡萄酒和白葡萄酒实验中，L. paracasei来源的乳糖酶具有最高的OTA降解效率，而C. bobalius来源的乳糖酶在白葡萄酒中效果最佳。
研究表明，氧化还原介质和铜的存在对OTA的氧化反应起着关键作用。据我们所知，这是首次报道乳酸菌乳糖酶能够降解OTA，并探讨了不同介质和铜的影响。这些发现有助于进一步了解葡萄酒中这种有害霉菌毒素的生物去除机制。
引言
食品安全对于保护消费者健康至关重要。葡萄酒的安全性取决于良好的生产流程、原材料质量以及发酵和后发酵过程（Russo等人，2016年）。许多丝状真菌和细菌会自然生长在葡萄上，并在酿酒过程中产生（Fugelsang & Edwards，2007年）。因此，葡萄酒的质量和安全主要受到多种对人体有害化合物的影响，其中包括霉菌毒素赭曲霉毒素A。
赭曲霉毒素A由多种丝状真菌（如Penicillium和Aspergillus属）产生，这些真菌会感染葡萄串并污染谷物、坚果和香料（Li等人，2021年）。它主要存在于酒精饮料中，尤其是在红葡萄酒中（Battilani等人，2006年；Bellver Soto等人，2014年），其浓度范围为0.007至2.79 μg/L（Bellver Sto等人，2014年）。赭曲霉毒素A会在人体多种组织中积累（Russo等人，2016年），抑制蛋白质合成（Dirheimer & Creppy，1991年），并导致间接的DNA氧化损伤和表观遗传变化（Pfohl-Leszkowicz & Manderville，2012年；Vettorazzi等人，2013年）。国际癌症研究机构（IARC，1993年）将其归类为可能的人类致癌物（2B组），世界卫生组织（WHO）也将其列为主要的食品污染物之一（Petruzzi等人，2014年）。
欧洲食品安全局（EFSA）制定的食品链污染物可容忍每周摄入量（TWI）为120 ng/kg体重（EFSA，2006年）。欧盟委员会将葡萄酒和葡萄汁中的赭曲霉毒素A最高限量设定为2 μg/L（Piotrowska等人，2013年），国际葡萄酒组织（OIV）则将其限定为2 μg/kg（OIV，2005年；Wang等人，2022a）。
酿酒师深知必须避免葡萄酒中存在赭曲霉毒素A。控制霉菌毒素污染的最有效方法是预防真菌感染及其产生的毒素（Wang等人，2022b）。乳酸菌（LAB）作为发酵食品和益生菌中的重要成分，在去除微生物和化学来源的毒素方面具有显著作用（Petrova等人，2022年）。多项研究探讨了乳酸菌通过降解、代谢或吸附等方式清除这些毒素的机制（Abrunhosa等人，2014年；Callejón等人，2014年；Luz等人，2018年）。
然而，在预防措施不可行或无法实施的情况下，需要采取补救措施，例如化学、物理和生物方法来降低食品中的赭曲霉毒素含量（Amézqueta等人，2012年；Chen等人，2018年；Mateo等人，2011年）。物理方法包括辐射处理、吸附和清洗或热处理，但这些方法能耗较高，需要大型设施，并可能影响产品质量（Yang等人，2022年）。化学方法（如使用合成杀菌剂）则存在技术、环境和健康问题，因为会留下有毒化学残留物（Jiménez-Martínez等人，2018年）。
相比之下，利用拮抗微生物及其酶来对抗霉菌毒素（包括赭曲霉毒素A）已取得满意效果（Chen等人，2018年；Petruzzi等人，2014年；Wang等人，2022b；Yang等人，2022年；Zhang等人，2016年）。例如，来自丝状或可食用真菌的乳糖酶已被用于稳定葡萄酒和啤酒，并防止不希望产生的2,4,6-三氯茴香酚（TCA）的形成（Baldrian，2006年；Pezzella等人，2015年）。
已有研究证实某些细菌乳糖酶具有降解赭曲霉毒素A的能力（例如来自Weizmannia coagulans的乳糖酶，Jia等人，2024年；来自Bacillus subtilis的乳糖酶，Wang等人，2019年）。然而，据我们所知，目前尚无关于乳酸菌乳糖酶降解赭曲霉毒素A的系统性研究，尽管已有针对生物胺的研究（Callejón等人，2014年、2016年、2017年；Monroy等人，2024年；Olmeda等人，2021年）。
Callejón等人（2014年）报道了某些乳酸菌能够降解生物胺，并通过异源表达在E. coli中鉴定出负责这一降解的乳糖酶。随后，其他研究报道了11种乳酸菌乳糖酶对多种底物（如ABTS、2,6-DMP和生物胺）的活性（Callejón等人，2016年；Olmeda等人，2021年；Monroy等人，2023年；Olmeda等人，2024年；Gascó等人，2026年），其中三种乳糖酶在本研究中也被使用。
与真菌乳糖酶相比，使用乳酸菌乳糖酶降解葡萄酒中的赭曲霉毒素A具有较低的颜色褐变风险，因为它们的氧化还原潜力较低。此外，乳酸菌乳糖酶的异源生产和特性改进也具有优势：细菌基因（包括乳糖酶基因）的异源表达和基因改造比真菌基因更容易实现（Gunne等人，2014年）。由于乳酸菌参与葡萄酒中的苹果酸-乳酸发酵，其乳糖酶的应用更易被酿酒师接受。
乳糖酶是一类广泛存在的多铜氧化酶（EC 1.10.3.2），其结构包含四个富含组氨酸的铜结合域，这些域可以结合不同类型的铜原子（1型、2型和3型），这些铜原子具有不同的磁性和光谱特性。乳糖酶在氧气存在下催化取代酚类和非酚类化合物的氧化，生成水。由于乳糖酶具有较高的非特异性氧化能力，因此被广泛应用于染料脱色、纸浆漂白、聚合物合成、生物修复和有机合成等领域（Kudanga等人，2017年；Sirim等人，2011年；Zheng等人，2013年）。
研究表明，这些酶对非酚类或复杂酚类底物的氧化需要媒介化合物的辅助，这些化合物通常是低分子量的小分子，起到乳糖酶与氧化产物之间的电子传递作用（Bourbonnais & Paice，1990年；Giardina等人，2010年）。2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）是乳糖酶的典型底物（Bourbonnais & Paice，1990年）。天然媒介物质因其成本效益高且环保而受到关注，例如儿茶酸、没食子酸和(-)-表儿茶素（Giménez等人，2022年）。
本研究评估了四种重组乳酸菌乳糖酶在不同反应体系（醋酸钠缓冲液、多酚提取物和葡萄酒）中降解赭曲霉毒素A的能力，其中三种乳糖酶之前已由Monroy等人（2024年）报道，包括Lactobacillus paracasei（同义词Lacticaseibacillus paracasei，根据Zheng等人，2020年）、Lactococcus lactis和Pediococcus parvulus；此外，还研究了不同氧化还原介质（ABTS和表儿茶素）及铜的存在与否，以及红葡萄酒和白葡萄酒多酚提取物的影响。这是首次研究乳酸菌乳糖酶降解赭曲霉毒素A的效果，也是首次在多种底物和反应体系中进行此类研究。
菌株、乳糖酶基因克隆及表达
Companilactobacillus bobalius ENOLAB 4382菌株是从Bobal品种葡萄酒中分离得到的（Mañes-Lázaro等人，2008年），并在pH=6.5、28°C的MRS固体培养基中培养（Scharlau S.L.，巴塞罗那，西班牙）。为了扩增其乳糖酶基因，设计了特异性引物（F: 5’-GATGCTAGCATGGGGATATTGAAGAAGAAAAC-3’；R: 5’-CCGGGATCCCTATTCCACCTTAACCTGCCCC-3’）。用于克隆该基因的限制酶为NheI和BamHI，它们的识别位点已在文献中标明。
乳糖酶在ABTS溶液中的蛋白浓度和特异性活性
之前已从L. paracasei ENOLAB 4314、L. lactis ENOLAB 5298和P. parvulus ENOLAB 3909菌株中获得了乳糖酶，并由Monroy等人（2024年）进行了表征，结果总结在表1中。对于本研究中的第四种乳糖酶，发现C. bobalius含有两种乳糖酶：一种多铜氧化酶（Cb4382-1）和一种胆红素氧化酶（Cb4382-2），但本研究仅关注多铜氧化酶的性能。
结论
据我们所知，这是首次成功利用乳酸菌乳糖酶去除红葡萄酒和白葡萄酒中赭曲霉毒素A的研究。不同来源的乳糖酶对OTA的降解效果存在差异，C. bobalius和L. paracasee乳糖酶在白葡萄酒和红葡萄酒中的降解效果最佳。大多数乳糖酶更偏好使用天然媒介物质表儿茶素而非人工媒介物质ABTS来氧化OTA。
作者贡献声明
Isaac Monroy：撰写原文、方法设计、实验实施、数据分析。
José Pérez-Navarro：撰写、审稿与编辑、方法设计、实验实施。
Isidoro Olmeda：方法设计、实验实施、数据分析。
Tania Paniagua-Martínez：方法设计、实验实施、数据分析。
Sergi Ferrer：资源提供、方法设计、实验实施、资金获取、概念构思。
Sergio Gómez-Alonso：项目监督、资源提供、方法设计、实验实施、资金获取。
Isabel Pardo：
未引用参考文献
Bertin等人，2017年；José，2020年。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了欧盟“地平线2020”研究与创新计划（Marie Skłodowska-Curie资助协议编号[101022293）的支持。作者还感谢卡斯蒂利亚-拉曼查大学及其2022年研究计划提供的资金支持，该项目部分由欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助（项目编号：2022-GRIN-34333），以及西班牙MINECO的资助（AGL2015-71227-R）。
