喹啉羧酸衍生物作为NPPs抑制剂：合成、计算机模拟及体外评价

本研究合成了10个喹啉羧酸衍生物，评估其抑制人NPP1和NPP3活性。其中4f对h-ENPP1抑制最强（IC50=0.10±0.009 µM），4j对h-ENPP3抑制显著（IC50=0.39±0.02 µM）。分子对接和动力学模拟显示4j与h-ENPP3结合稳定，DFT计算表明4c的HOMO-LUMO能隙最大，4b最小。

Nayab Syed|Aqsa Ishaq|Tajamul Hussain|Salman Alrokayan|Julie Pelletier|Jean Sévigny|Qing Huang|Jamshed Iqbal

巴基斯坦阿伯塔巴德COMSATS大学先进药物研究中心，阿伯塔巴德校区，邮编22060

摘要

核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（NPPs）是一类与膜结合的外酶，在细胞外核苷酸代谢中起着关键作用，并作为潜在的癌症治疗靶点受到了越来越多的关注。在本研究中，设计并合成了一系列喹啉羧酸衍生物（4a–4j），并通过FT-IR以及多核1H和13C NMR光谱技术确认了这些化合物的结构。这些衍生物被评估其对人类NPP异构体h-ENPP1和h-ENPP3的抑制活性。在测试的化合物中，有四种衍生物对h-ENPP1表现出显著的抑制作用，而五种衍生物对h-ENPP3表现出明显的抑制活性。化合物4f被认为是最有效的h-ENPP1抑制剂，其IC50值为0.10 ± 0.009 µM；而化合物4j对h-ENPP3的抑制活性也非常显著（IC50 = 0.39 ± 0.02 µM）。一些衍生物对h-ENPP1或h-ENPP3具有选择性。酶动力学研究表明，化合物4f通过竞争机制抑制h-ENPP1。选定的化合物还进一步评估了它们对HeLa和MCF-7癌细胞的细胞毒性。分子对接和100纳秒分子动力学模拟证实了化合物4j在h-ENPP3活性位点的稳定结合，表现为蛋白质和配体的最小波动以及天然二级结构的保持。此外，B3LYP/6-31G水平的密度泛函理论（DFT）计算表明，化合物4c具有最大的HOMO–LUMO能量差，而化合物4b在所评估的衍生物中显示出最小的能量差。

引言

癌症仍然是一个重大的全球健康挑战，即使在使用靶向疗法和基于免疫疗法的治疗方面取得了显著进展，每年新病例的数量仍在持续增加。最近的研究表明，细胞外核苷酸代谢的改变在肿瘤发展和促进免疫逃逸中起着重要作用。这一过程主要由与膜结合的外核苷酸酶控制，这些酶调节肿瘤微环境中的嘌呤能信号传导[1,2]。

外核苷酸酶是一类与膜结合的酶，参与调节肿瘤微环境中的细胞外ATP和腺苷浓度[3]。外核苷酸酶大致分为四个主要家族：外核仁三磷酸二磷酸水解酶（ENTPDases）、核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（E-NPPs）、外-5′-核苷酸酶（CD73）和碱性磷酸酶[4,5]。通过催化细胞外ATP和ADP的逐步分解，这些酶生成腺苷，从而调节炎症、免疫抑制和癌细胞存活[6]。NPP1属于核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP）家族，该家族包含七个密切相关的成员（ENPP1–7）。在NPP家族中，NPP1被认为是研究最广泛且功能最重要的异构体。核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1型（NPP1，也称为PC-1；EC 3.1.4.1）是一种与膜结合的糖蛋白，在细胞外核苷酸的水解中起关键作用[6,7]。其主要底物是ATP，ATP被转化为AMP和无机二磷酸盐。NPP1对细胞外核苷酸的调节突显了其作为脑癌和免疫肿瘤学治疗靶点的潜力[8]。ENPP家族的成员可以是与膜结合的糖蛋白（如NPP1和NPP3），也可以是可溶性蛋白质（如NPP2[9]）。与膜结合的ENPPs的活性位点朝向细胞外空间，能够有效地水解核苷酸底物末端的磷酸基团[10]。NPP1和NPP3都表现出广泛的底物特异性，能够水解三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、磷酸腺苷酸硫酸盐、核苷糖（例如UDP-葡萄糖苷）和二核苷多磷酸盐（例如Ap₃A和Ap₄A），生成相应的核苷单磷酸盐（NMPs）[11]。这些NMPs进一步被碱性磷酸酶和外-5′-核苷酸酶处理，最终释放出核苷作为最终产物[12]。通过这种连续的酶级联反应，NPPs作为嘌呤能信号传导的中心调节因子，影响炎症、免疫调节、神经传递和组织矿化等过程[10]。

NPP1的过表达与多种疾病相关，包括软骨钙质沉着症[13]、骨关节炎、2型糖尿病和多种癌症[14,15]。同样，NPP3的过表达通过提高腺苷水平，有助于建立免疫抑制的肿瘤微环境，从而促进肿瘤生长、血管生成和转移[16,17]。这些发现表明NPP酶是很有前景的治疗靶点，尤其是在癌症免疫疗法和代谢性疾病中[11]。

近年来，包括分子对接和计算机药代动力学分析在内的计算技术已成为阐明配体-酶相互作用和指导NPP抑制剂合理设计的重要工具[5],[18],[19],[20]。由于它们的生物学相关性，大量的研究工作致力于寻找小分子NPP抑制剂，已经鉴定出几种具有潜在抑制活性的化学骨架，包括吡唑[21]、噁二唑[22]、哌啶[13,23]、磺酰胺/磺酸盐[14]和金刚烷基衍生物[24]。然而，实现对个别NPP异构体的选择性和效力仍然是一个主要挑战。因此，探索具有调节NPP活性潜力的新型化学框架仍然是研究的热点。图1展示了NPP1和NPP3抑制剂的代表性例子。

根据上述讨论，由于外核苷酸酶在癌症相关嘌呤能信号传导中的核心作用，它们受到了广泛关注。在许多病理生理疾病中，尤其是癌症中，这些外核苷酸酶类型的作用非常显著，使它们成为重要的药物靶点。因此，已经提出了不同的治疗方法来治疗癌症[25,26]。开发能够有效阻断这些酶的杂环化合物已成为当前科学研究的重要目标。阻止这些酶的催化作用可能通过减少支持肿瘤的腺苷的形成来降低癌症风险，这一观点得到了杂环化合物（无论是合成的还是天然来源的）在药理学中的广泛应用的支持[27,28]。由于杂环化合物中存在一个或多个杂原子，这些化合物被认为具有广泛的生物活性特性。将杂环结构纳入酶抑制剂的设计中，为管理复杂的疾病状态提供了灵活的方法[29]。

由于NPPs在癌症进展中的重要作用，寻找针对这些酶的小分子抑制剂已成为药物研究的主要优先事项之一。在研究的各种杂环骨架中，喹啉因其结构多样性和广泛的药理活性（包括抗疟疾、抗菌、抗炎和抗癌作用）而受到关注[30,31]。它能够与生物大分子形成稳定的相互作用，使其成为药物开发中的有价值的核心结构[32]。

同样，硫代半卡巴嗪这种多功能药效团也被发现具有广泛的生物活性，这主要归功于其金属螯合能力和形成生物活性杂环结构的能力。这些化合物显示出抗菌、抗癌、抗病毒和抗炎作用，反映了它们的结构适应性和靶点结合的潜力。鉴于NPPs在癌症进展中的关键作用，发现针对这些酶的小分子抑制剂已成为药物研究的重要目标[33]。最近的研究表明，在单一分子框架内结合喹啉和硫代半卡巴嗪基团可以产生具有增强生物活性的化合物。这些喹啉-硫代半卡巴嗪杂化物已被证明对NPP异构体具有显著的抑制作用，表明它们作为治疗与异常外核苷酸信号传导相关的疾病的候选药物的潜力[34,35]。

最近的研究表明，喹啉-硫代半卡巴嗪杂化物是具有显著治疗前景的化学多样性分子。将喹啉核心与硫代半卡巴嗪功能结合在一个结构中，可以通过与分子靶点产生更强和更选择性的相互作用来提高生物性能[34]。这样的杂化框架已被证明可以抑制NPP异构体，表明它们在治疗与异常外核苷酸信号传导相关的疾病中的潜在用途[35]。

在这项研究中，我们介绍了新型喹啉-硫代半卡巴嗪衍生物的设计、合成和生物学评估，作为潜在的NPP酶抑制剂。通过结合两种药理活性骨架，这项工作旨在通过调节嘌呤能信号传导来推进新的抗癌治疗剂的发展。

部分摘要

通用化学方法

所有分析级别的溶剂均按收到时的状态使用，无需额外纯化。购买的化学品直接用于合成过程。熔点使用Gallenkamp熔点仪测定。反应进度通过硅胶60 F254板（Merck）上的薄层色谱（TLC）进行常规监测，并在254 nm紫外光下观察斑点。合成化合物的结构特征通过...

合成

根据方案1中所示的通用合成方案制备了喹啉-6-羧酸衍生物。在第一步中，喹啉-6-羧酸（1a）与干甲醇（30 mL）在几滴浓H₂SO₄的存在下回流，得到甲基喹啉-6-羧酸盐（2a），并通过溶剂萃取分离。反应在80 °C下进行8到10小时。在第二步中，化合物（2a）在回流条件下与肼水合物反应...

结论

总之，合成了一系列十种喹啉羧酸衍生物，并评估了它们对人类NPP异构体的抑制活性。化合物4d、4f、4h和4i对h-ENPP1表现出显著的抑制作用，而4c、4f、4h、4i和4j对h-ENPP3表现出明显的抑制作用。酶动力学研究表明，化合物4f表现出竞争性抑制模式。选定的化合物4h、4d和4c的细胞毒性谱显示相对较高...

作者贡献声明

Nayab Syed：合成、方法学、生物活性。Aqsa Ishaq：对接和DFT研究、HPLC分析、撰写原始草稿、审阅与编辑、数据管理。Tajamul Hussain：生物测定：编辑、资金获取。Salman Alrokayan：生物测定、编辑、资金获取。Julie Pelletier：重组酶的制备。Qing Huang：实验工作编辑和审阅。Jean Sévigny：提供重组酶、审阅与编辑。Jamshed Iqbal：监督、资源（合成）...

作者贡献声明

Nayab Syed：撰写——原始草稿、方法学、研究。Aqsa Ishaq：软件、数据分析、数据管理。Tajamul Hussain：软件、资源、数据分析。Salman Alrokayan：资源、方法学、资金获取。Julie Pelletier：撰写——审阅与编辑、方法学。Jean Sévigny：撰写——审阅与编辑、资源、研究、资金获取。Qing Huang：研究、数据分析。Jamshed Iqbal：可视化、监督、项目管理...

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者感谢沙特阿拉伯利雅得King Saud大学的Ongoing Research Funding计划（ORF-RC-2025-1405）的支持。JI获得了中国巴基斯坦经济走廊合作研究基金（P2-345）的支持。J.S.获得了加拿大自然科学与工程研究委员会（RGPIN-2023-05498）的支持，以及魁北克研究基金（参考编号：30641）的机构支持。