基于构象调控的dBET1分支酯类衍生物立体异构体膜渗透性差异研究

本文探讨了通过酰胺-酯替换与 linker 区域甲基化相结合的双重策略，改善 BRD4 降解剂 PROTAC 分子 dBET1 的细胞膜渗透性。研究发现，酯化衍生物不仅提高了被动渗透性（PAMPA）与降解活性（DC50），还通过引入手性中心产生两个立体异构体（2a 与 2b），其在非极性环境中表现出不同的三维极性表面积（3D-PSA）与折叠构象，展现出显著的“分子变色龙”特性。该研究为 beyond Rule of 5（bRo5）类 PROTAC 的合理设计提供了构象依赖性的新思路。

分子设计与合成

本研究以 BRD4 降解剂 dBET1 为模型，探索通过酰胺-酯替换及 linker 区域引入甲基以调控构象，从而提升其膜渗透性。设计合成了三个酯类衍生物：未分支的酯类似物 1，以及通过引入甲基产生的两个非对映异构体 2a 与 2b。合成路线涉及关键中间体 6 的 Boc 脱保护、与酸 8 或外消旋 9 的缩合，最终经分离纯化得到目标化合物。

降解活性与药代动力学评价

所有酯类 PROTAC 均表现出优于 dBET1 的 BRD4 降解活性，其中 2a 和 1 的 DC₅₀分别为 16 nM 和 19 nM，约为 dBET1（84 nM）的 4–5 倍。PAMPA 渗透性实验显示，2b 的渗透性最高（P_app= 1.20 × 10^–6cm/s），约为 2a 的 3.4 倍，且达到中等渗透性药物水平。尽管 2b 渗透性最佳，其降解活性（DC₅₀= 43 nM）却略低于 2a，提示除被动渗透外，细胞内稳定性、主动转运等因素亦影响降解效能。

非对映异构体膜渗透性差异的机制探索

为阐释 2b 相较于 2a 显著提升的膜渗透性，研究采用 steered molecular dynamics（SMD）模拟结合增强构象采样，分析二者在水和甲苯中的构象分布。结果显示，2b 在非极性环境中更易形成折叠构象，其溶剂可及三维极性表面积（SA 3D-PSA）显著低于 2a，且存在大量分子内氢键（IMHB）及 π-π 堆积等相互作用，有效屏蔽极性基团，增强疏环境适应性。此外，2D NMR 与氢键酸度参数（A_NMR）分析进一步验证 2b 在非极性溶剂中形成更强 IMHB。

构象一致性与渗透性关系

通过 iMTD-GC 与 LowModeMD 构象搜索，发现 2b 在水与甲苯中存在低能“一致构象”，其在两种环境中结构高度相似（RMSD ≈ 0.1 Å），显著降低跨膜过程的构象转换能垒。而 2a 则缺乏此类一致性构象。SMD 轨迹分析亦表明，2b 构象集合中存在可在水/脂质双环境中访问的重叠构象子集，进一步支持其优异渗透性源于构象灵活性及低能障转换。

稳定性与代谢特征

在含 10% FBS 培养基中，所有酯类 PROTAC 均表现出优于 dBET1 的稳定性。尤其在 NADPH（–）条件下，2a 与 2b 的残留率高于 90%，提示其对抗非细胞色素 P450 代谢的能力较强。细胞内浓度测定显示，2a 在 6 小时仍能维持较高浓度，可能与其较低的外排转运有关。

结论与展望

本研究通过酰胺-酯替换与立体化学调控，成功提升 PROTAC 类分子的膜渗透性与降解效能，揭示构象依赖性渗透机制在 bRo5 类分子设计中的关键作用。非对映异构体 2b 所展现的“分子变色龙”特性与构象一致性，为后续开发高渗透性、高稳定性蛋白降解剂提供了新策略。