抗体-药物偶联物（ADCs）被誉为癌症靶向治疗的“魔法子弹”，通过抗体特异性识别肿瘤表面抗原，精准递送高效细胞毒性药物。然而，传统ADCs面临两大瓶颈：一是抗体生产依赖哺乳动物细胞表达系统，成本高昂；二是药物偶联过程存在位点随机性，导致产物异质性强，影响药效与安全性。此外，单一靶点策略易引发耐药性，例如EGFR靶向疗法可能导致HER2代偿性上调。
为突破这些局限，四川大学研究人员在《Biomedicine》发表研究，提出一种仿生双特异性ADC新策略。该设计巧妙融合白蛋白结合域（ABD）与骆驼源纳米抗体（VHH），利用ABD与血清白蛋白高亲和力结合的特性延长半衰期，同时通过双靶向EGFR/HER2增强肿瘤特异性并克服耐药。研究以A549非小细胞肺癌为模型，系统评估了偶联物的理化性质、靶向能力及体内外抗肿瘤效果。
关键技术方法概述
研究采用原核表达系统在大肠杆菌中高效表达ABD-VHH融合蛋白；通过疏水相互作用色谱（HIC）和镍柱亲和层析纯化蛋白；利用半胱氨酸-马来酰亚胺化学实现MMAE的定点偶联；通过尺寸排阻色谱、ELISA、流式细胞术和激光共聚焦显微镜验证蛋白与抗原（EGFR/HER2）及人血清白蛋白（HSA）的结合能力；使用CCK-8法检测体外细胞毒性；基于A549移植瘤模型开展小动物活体成像、药代动力学和药效学评价。
研究结果
3.1 蛋白表达与偶联物制备
成功构建五种融合蛋白（VHHEGFR-ABD-VHHHER2、VHHEGFR-Cys-ABD-VHHHER2等），纯度均高于95%。MALDI-TOF MS证实偶联物分子量与理论值一致，圆二色谱和荧光光谱显示MMAE偶联未破坏蛋白高级结构。HIC-HPLC分析表明定点偶联可实现均一载药（DAR=1或2）。
3.3 白蛋白结合功能
尺寸排阻色谱显示所有融合蛋白及偶联物均能与HSA形成复合物，且结合能力随HSA浓度增加而增强，提示其在体内可通过ABD-HSA相互作用延长半衰期。
3.4 抗原结合特异性
ELISA和流式细胞术证实双特异性偶联物可同时结合EGFR与HER2，其半数有效浓度（EC50）为纳米级（EGFR: 0.55–1.43 nM；HER2: 1.00–2.69 nM）。偶联MMAE后结合力略有下降，但双靶向组仍优于单靶向组。
3.5 细胞内化与定位
Cy5标记的偶联物在A549细胞中呈现时间依赖性内化，双特异性组（如VHHEGFR-ABD-VHHHER2-2Cy5）的细胞荧光强度（MFI）显著高于单靶向组。共聚焦显微镜显示偶联物主要富集于细胞质。
3.6 体外杀伤效应
CCK-8实验表明所有蛋白-MMAE偶联物对A549细胞的半数抑制浓度（IC50）与游离MMAE相当（约0.3–1.0 nM），且对不表达EGFR/HER2的HEK293T细胞毒性较低，证实靶向选择性。
3.7 体内靶向与分布
小动物活体成像显示双特异性偶联物在肿瘤部位富集强度高于单靶向组，荧光信号可持续至给药后98小时。
3.8 药代动力学特征
SD大鼠体内实验表明，双特异性偶联物（如VHHEGFR-ABD-Cys-VHHHER2-MMAE）的消除半衰期（t1/2β）长达69.3小时，显著优于单靶向组（27.5–28.8小时）和游离MMAE（8.2小时）。
3.9 抗肿瘤药效
在A549移植瘤模型中，高剂量（0.1 μmol/kg）双特异性偶联物（如VHHEGFR-ABD-VHHHER2-2MMAE）的肿瘤抑制率（TGI）达90.4%，显著优于游离MMAE。低剂量（0.02 μmol/kg）下双靶向组仍保持显著抑瘤效果，且未引起体重下降或器官损伤。
结论与意义
本研究创新性地将ABD与双特异性纳米抗体融合，构建了兼具长循环、高靶向、低成本的仿生ADC平台。双靶向策略通过协同作用增强肿瘤蓄积并抑制耐药，而原核表达与定点偶联技术大幅降低生产成本与产物异质性。该策略为开发新一代ADC提供了普适性技术路径，尤其适用于资源有限地区的癌症治疗。
