引言
完全切除肿瘤是大多数实体瘤的主要治疗手段，对患者的生存率和生活质量至关重要。然而，高达30%的患者会经历局部复发，这通常是由于切除边缘存在残留肿瘤所致。这一挑战反映了术中界定边界的困难，并影响患者预后。实现完全切除对于最小化复发和保留健康组织都至关重要。当前术中引导技术，如冰冻切片组织学、术中超声、CT和MRI，提供间歇性或延迟性反馈，并可能中断临床工作流程。相比之下，荧光成像利用非电离光学信号，能够实现对组织结构的实时可视化，为肿瘤边缘界定提供了一个实用平台。
然而，临床批准的染料如亚甲蓝（MB）、吲哚菁绿（ICG）和荧光素（FL）表现出有限的荧光敏感性、较差的特异性和快速清除率，降低了它们在手术引导中的效用。尽管ICG在近红外窗口操作并受益于改善的组织穿透性，但其使用需要专门的激发和检测系统。游离染料也会从血液中快速清除，并且缺乏在肿瘤中的选择性积累，使得术中区分恶性组织和健康组织变得复杂。因此，仍然需要结合高荧光敏感性、肿瘤特异性和安全性的成像剂用于术中。
生物医学成像潜力Green 8
开发有效的成像剂对于推进诊断和手术引导至关重要。Green 8（G8），一种FDA批准的药物和化妆品着色剂，因其优异的光学特性而成为提高成像对比度的有希望的候选者。G8在404 nm和455 nm处有两个明显的激发峰。在非饱和、仪器特定的激发和发射滤光片设置下，G8表现出比已建立的临床染料更优的荧光强度，其辐射效率是荧光素的1.3倍，大约是MB和ICG的10倍。G8的斯托克斯位移高达109 nm，这对于生物医学成像应用特别有利，因为它可以最大化信噪比（SNR），从而提高检测和界定肿瘤边界的精度。此外，G8在碱性条件下荧光显著增强，并在生理相关溶剂如PBS（pH 7.4）中保持强荧光性能，确保了其在生理条件下用于体内成像的兼容性。
Green 8脂质体的制备与优化
将成像染料封装到纳米颗粒（如脂质体）中，比小染料分子具有显著优势。脂质体是可生物降解的，能够实现靶向递送，并改善成像剂在肿瘤部位的滞留。为了最大化其成像潜力，研究人员优化了尺寸、产率、染料封装效率和荧光稳定性。G8封装脂质体纳米颗粒的制备过程包括脂质膜形成、水合、挤出和纯化。通过400 nm、200 nm和100 nm聚碳酸酯膜过滤器顺序挤出，最终尺寸一致，约为150 nm。使用超速离心和PD-10脱盐柱去除未封装的游离染料，PD-10柱在回收更高产量的纯化脂质体方面明显更有效。透射电子显微镜（TEM）图像显示了脂质体批次单分散性和均匀尺寸。动态光散射（DLS）证实了脂质体尺寸分布狭窄，PDI为0.289。
研究还优化了染料负载。将重水浓度从2.25 mg mL–1增加到225 mg mL–1会导致每个纳米颗粒（NP）的染料负载量增加，但在最高负载浓度（225 mg mL–1）下，完整的颗粒表现出信号下降49.9%，表明密集堆积的荧光团抑制了发射。相比之下，中等和低负载（22.5 mg mL–1和2.25 mg mL–1）显示出相对于游离染料的荧光增强，这意味着当荧光团间距足够时，脂质体微环境可以放大亮度。这些数据表明，中等染料负载在有效负载和荧光性能之间取得了平衡，在保持所需纳米尺寸和单分散性的同时保持了强发射。因此，22.5 mg mL–1的重水浓度代表了后续体内研究的最佳荧光配方。
Green 8脂质体的稳定性研究
长期稳定性是决定纳米颗粒制剂用于生物医学成像性能潜力的关键因素。一项为期6个月的荧光稳定性研究监测了三种G8脂质体制剂的染料保留和荧光性能。G8封装在三个进料浓度下进行了优化，实现了4.19 ag/NP、42.8 ag/NP和287.3 ag/NP的负载水平，分别对应于每个150 nm脂质体约4,300、44,500和298,000个分子。最佳的荧光配方（22.5 mg mL–1进料）达到了42.84 ag/NP，平衡了高负载和最小自猝灭效应。
结果表明，较高的初始封装染料浓度与较快的染料损失相关，表明初始荧光强度与长期封装稳定性之间存在权衡。225 mg mL–1重水批次，起始染料/NP比率最高，表现出染料封装减少28%，反映了封装染料和荧光效率的最大下降。相比之下，22.5 mg mL–1重水批次在研究期间仅表现出染料封装减少18%，在三个月期间保持了最高的荧光。2.25 mg mL–1重水批次，虽然起始荧光最低，但相对于封装显示出最高的荧光损失百分比（14%），可能是由于脂质体结构内较低的染料保留。总体而言，较高的初始染料浓度会加速泄漏，这对随时间的荧光信号稳定性产生负面影响。优化初始染料重水浓度对于维持G8脂质体的荧光和封装稳定性至关重要。
Green 8二氧化硅纳米颗粒的制备与优化
二氧化硅纳米颗粒也被探索作为G8的载体，因为它们具有生物可降解性、高稳定性和表面功能性。使用改良的Stöber工艺，将原硅酸四乙酯（TEOS）和合成的G8-硅烷进行水解和缩合，形成包含G8染料的二氧化硅基质。通过改变G8-硅烷与TEOS的摩尔比，系统地调整荧光性能和纳米颗粒均匀性。较低的G8-硅烷:TEOS摩尔比（例如1:300）产生较小的纳米颗粒，荧光减弱，而较高的比率（例如1:66）产生更亮的纳米颗粒，但牺牲了单分散性。中间比率1:80提供了荧光强度和单分散性之间的最佳平衡。扫描电子显微镜（SEM）证实，以该比率合成的纳米颗粒表现出一致的球形形态。最佳的摩尔比（1:80）产生了最高的荧光效率，实现了亮度和一致纳米颗粒形成之间的平衡。
Green 8纳米颗粒的荧光稳定性和效率比较
荧光纳米颗粒必须保持长期信号稳定性才能用于成像应用。研究人员比较了G8-脂质体、G8-二氧化硅纳米颗粒和商业荧光素-二氧化硅纳米颗粒（FITC-SiO2NPs）之间的荧光稳定性。G8-SiO2NPs和G8-脂质体表现出最小的荧光损失，在6周期间保持一致的荧光。相比之下，商业获取的FITC-SiO2NPs在第一次洗涤内损失了约95%的荧光。绝对荧光比较显示，G8-脂质体表现出比G8-SiO2NPs和FITC-SiO2NPs高一个数量级的强度，这可能是由于脂质双层中量子产率增强和猝灭减少。脂质体结构也可能允许更好的染料分散，潜在地最小化在刚性二氧化硅基质中高染料浓度下观察到的自猝灭。G8-脂质体提供了最高的荧光输出，使它们成为需要高信号强度和长期稳定性的实时成像应用的有希望的候选者。
Green 8脂质体的体内研究
在优化了G8脂质体的尺寸、封装效率和稳定性后，发现G8脂质体表现出比G8二氧化硅纳米颗粒更亮的荧光能力。这一发现促使评估其在肿瘤模型中的体内性能，重点关注其在异种移植模型中的分布、肿瘤靶向和滞留，以评估其用于手术成像应用的潜力。在SCC-15和SCC-25肿瘤模型中分析了G8脂质体的分布和滞留，在注射后4小时观察。实验设置涉及将SCC-15和SCC-25细胞皮下接种到每只小鼠的相对侧腹，以便进行受试者内荧光分布比较。
harvested组织标本的荧光热图显示，G8脂质体在SCC-15和SCC-25肿瘤内显著积累，而在邻近正常组织和对照肿瘤中荧光最小。这种选择性积累突出了G8脂质体的肿瘤靶向能力。定量分析进一步支持了这些观察结果，SCC-15和SCC-25肿瘤中的平均辐射效率显著高于对照肿瘤和邻近正常组织。尽管在该光谱范围内存在固有的自发荧光，但G8产生了几倍亮的信号；由此产生的肿瘤荧光证实了G8脂质体的有效滞留，并突出了其在肿瘤微环境中增强的定位和持久性。器官水平的生物分布使用 harvested的心脏、肾脏、肝脏、肺和脾脏的特定感兴趣区域（ROIs）进行量化。器官成像显示，相对于未接受任何G8脂质体注射的对照组，肝脏中纳米颗粒积累显著，这对于这种尺寸的纳米颗粒是预期的。
为了进一步评估G8脂质体的滞留特性，在注射后24小时进行了一项与游离染料的比较研究。结果显示，与游离G8染料相比，注射G8脂质体的小鼠在SCC-15和SCC-25肿瘤内的荧光滞留显著增加。接受G8脂质体的小鼠在肿瘤中表现出比接受游离染料的小鼠显著更高的荧光强度。这一结果证明了脂质体制剂在延长时间点优于游离染料的滞留能力，这对于随时间增强肿瘤成像对比度至关重要。游离染料观察到的荧光减少表明从肿瘤部位清除更快，突出了纳米颗粒封装对于延长滞留的优势。
结论
本研究展示了G8负载脂质体纳米颗粒作为一种明亮、稳定和可生物降解的荧光成像平台的表征和优化。将G8封装在可生物降解的纳米颗粒中增强了荧光敏感性并证明了长期稳定性。该制剂还实现了选择性肿瘤滞留和延长的成像对比度，解决了传统临床游离染料的局限性。虽然研究了脂质体和二氧化硅基纳米颗粒，但G8-二氧化硅纳米颗粒提供了结构稳定性，但最终表现出比G8脂质体更低的荧光强度。G8脂质体提供了更优的亮度，随后被用于评估体内成像潜力。体内结果表明，G8脂质体在OSCC异种移植模型中有效被动积累，并在24小时后保持强荧光，允许清晰区分癌组织和健康组织。这种对比度水平对于边缘界定至关重要的手术环境尤其相关。G8脂质体在肿瘤中相对于游离染料的延长滞留突出了纳米颗粒封装对于延长成像的优势，支持了它们在实时图像引导和监测中的潜力。G8的可见光荧光读数使得在暴露或浅表手术野中能够直接可视化，并在缺乏专用近红外设备的环境中提供更广泛的可及性。虽然OSCC因其可及性和高复发率被选为模型，但本研究中G8脂质体的性能表明其可更广泛地应用于其他切除边缘至关重要的实体瘤。通过进一步优化，包括替代的靶向递送策略，G8脂质体可能有助于满足对高灵敏度可生物降解成像剂的需求。本研究强调了G8脂质体作为一种新颖且多功能的术中成像方法，它结合了强荧光与脂质体纳米颗粒的生物相容性和稳定性，为支持改进的荧光引导手术策略的开发提供了一个有希望的平台。
实验部分
材料包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）、胆固醇、辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷（OBG）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、乙醇、原硅酸四乙酯（TEOS）、氯仿、氨水、3-异硫氰酸丙基三乙氧基硅烷（ITCPTS）、FITC-二氧化硅纳米颗粒、荧光染料G8、去离子水、荧光素、亚甲蓝、吲哚菁绿。细胞培养使用杜尔贝科改良 Eagle 培养基（DMEM），补充有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌溶液。
方法包括脂质体纳米颗粒的制备（脂质膜形成、水合、挤出、纯化）、G8-二氧化硅纳米颗粒的制备（改良Stöber工艺）、脂质体和二氧化硅纳米颗粒的表征与优化（使用Nanosight NS 300测量尺寸和浓度，使用AMI HTx荧光定量器和BioTek分光光度计评估荧光效率和发射光谱，使用TEM和SEM进行形貌表征）、脂质体纳米颗粒封装效率的测定、荧光定量和稳定性研究、细胞培养、异种移植注射和体内实验。
统计分析用于评估染料性能和整个纳米颗粒表征的差异。对于染料和纳米颗粒表征，使用非配对双尾t检验或配对双尾t检验。样本量为n = 3或n = 4。在体内成像研究中，使用独立的单尾t检验（假设方差相等）来比较注射G8脂质体纳米颗粒的小鼠与对照组小鼠的荧光信号强度。显著性阈值定义为p < 0.001和*p < 0.0001。荧光定量结果报告为平均值±平均标准误。
