抗菌肽PN3和PN5的理化性质
研究首先对两种抗菌肽PN3（序列VQAAQAGDTKPIEV）和PN5（序列VTDTSGKAGTTKISNV）进行了深入的理化性质分析。通过生物信息学工具预测，这两种肽均表现出良好的稳定性，其不稳定指数低于40，预示着它们在体内外环境中能够保持较长的半衰期。螺旋轮投影显示，PN3和PN5的疏水性和非疏水性氨基酸分布呈现不完美的两亲性结构，这种结构有利于其与细菌细胞膜的相互作用。利用PEP-FOLD服务器预测的三级结构表明，PN3主要由α螺旋构成，而PN5则呈现β折叠构象。PN3由14个氨基酸组成，预测分子量为1426.5道尔顿，等电点（pI）为5.07；PN5由16个氨基酸组成，预测分子量为1578.7道尔顿，等电点为5.69。这些基本的理化特性为其后续的生物活性研究奠定了基础。
PN3和PN5在体外展现出广谱抗沙门氏菌活性
研究团队此前在益生菌LGG和Bb12的混合培养上清液中鉴定出33种小肽，其中PN3和PN5显示出较强的抑菌潜力。本研究通过微量肉汤稀释法测定了它们对模型菌株鼠伤寒沙门氏菌（ST）的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。结果显示，PN3的MIC为18 mM，MBC为24 mM；而PN5的MIC为21 mM，MBC为30 mM。更重要的是，在MIC浓度下，PN3和PN5对另外9种常见于食源性疾病的沙门氏菌血清型（包括肠炎沙门氏菌、海德堡沙门氏菌等）均表现出显著的生长抑制作用，证明了其广谱抗菌特性。时间杀灭动力学实验进一步揭示了两种肽的杀菌模式：PN3作用迅速，在MBC浓度下30分钟内即可完全杀灭ST；而PN5的杀菌过程相对缓慢，在8小时 incubation 后实现完全清除。这种时间依赖性的杀菌效应为理解其作用机制提供了线索。
PN3和PN5有效清除生物膜内和细胞内的沙门氏菌
沙门氏菌形成生物膜的能力是其抵抗抗菌药物和引起慢性感染的重要因素。通过结晶紫染色和最小生物膜清除浓度（MBEC）测定，研究证实ST能够在peg上形成稳定的生物膜。令人振奋的是，在MIC浓度下，PN3和PN5能够完全清除生物膜内嵌入的ST，其效果与阳性对照卡那霉素（50 µg/mL）相当，而未处理组则检测到高达7.6 log CFU/mL的活菌。这表明这两种肽不仅能对付浮游菌，对处于保护性生物膜状态下的细菌同样有效。
作为兼性胞内寄生菌，沙门氏菌能够入侵宿主细胞并躲避宿主免疫系统和抗菌药物的攻击。研究采用庆大霉素保护法评估了PN3和PN5清除巨噬细胞系HD-11和肠上皮细胞系Caco-2内ST的能力。结果表明，两种肽均能以浓度依赖的方式有效清除细胞内的ST。在HD-11细胞中，PN3在27 mM、PN5在21 mM浓度下即可实现胞内菌的完全清除；而在Caco-2细胞中，达到完全清除所需的浓度较高（PN3: 45 mM, PN5: 52.5 mM）。这种差异可能与不同细胞类型对肽的摄取和胞内定位有关。该结果提示，PN3和PN5具有干预沙门氏菌入侵和系统性传播的潜力。
PN3和PN5具备良好的稳定性和低耐药性诱导风险
对于旨在应用于饲料添加剂的新型抗菌剂而言，热稳定性和蛋白酶稳定性至关重要。研究将肽溶液在不同高温下处理：80°C 1小时、100°C 30分钟以及121°C 20分钟（模拟饲料制粒过程）。结果显示，PN3和PN5在80°C和100°C处理后，其MIC未发生改变，活性保持完整。即使在121°C的高温高压处理后，PN3的活性依然稳定，而PN5的活性仅出现轻微下降（抑制率仍达89%）。此外，经蛋白酶K（PK）处理后，两种肽的抗菌活性也未受影响，证明了其对蛋白酶降解的稳定性。这些特性为其在家禽饲料中的实际应用提供了可能。
抗生素耐药性是全球公共卫生面临的严峻挑战。为了评估沙门氏菌对PN3和PN5产生耐药性的风险，研究进行了亚致死和致死浓度下的耐药性诱导实验。在亚致死耐药性实验中，ST在含有0.75倍MIC浓度肽的培养基中连续传代13次后，其对PN3和PN5的MIC和MBC均未发生显著变化。在致死耐药性实验中，用2倍MBC的肽处理ST 2天后，存活菌落对肽的敏感性也未改变。这些结果表明，在实验条件下，沙门氏菌不易对PN3和PN5产生耐药性，这是其相对于传统抗生素的一大优势。
PN3与PN5联合使用呈现拮抗效应
在联合用药日益普遍的背景下，研究也探讨了PN3和PN5联合使用的效果。通过计算联合指数（CI），发现当PN3和PN5在特定浓度（18 mM和21 mM）下联合使用时，其CI值为1.85（>1），表明两者之间存在拮抗作用。这与某些抗菌肽联合使用时因竞争结合位点而导致效能降低的报道一致。因此，不建议将PN3和PN5联合使用以增强抗菌效果。
体内实验证实PN3和PN5的安全性与有效性
研究利用大蜡螟幼虫模型评估了PN3和PN5的体内毒性和疗效。毒性实验表明，注射高于MIC浓度的PN3（21 mM）和PN5（24 mM）对幼虫的存活率没有产生统计学上的显著影响，且未引起明显的黑化或行为异常，证明其在无感染状态下具有较好的生物相容性。在疗效实验中，预先注射MIC浓度的PN3（18 mM）或PN5（21 mM）再感染ST，能显著提高感染幼虫的存活率（PN3组72小时存活率35%，PN5组40%），并显著降低幼虫体内的ST载量（分别降低2.35 log和2.45 log），而未处理感染组的死亡率高达95%。
为了更接近实际应用场景，研究进一步在鸡感染模型中验证了肽的效果。通过口服途径给予感染ST的鸡不同剂量（50 mg/kg和100 mg/kg）的PN3和PN5，每天两次，连续5天。结果显示，PN3在50 mg/kg和100 mg/kg剂量下，以及PN5在100 mg/kg剂量下，均能显著降低盲肠中的ST载量。同时，肽处理组鸡只脾脏ST阳性率较阳性对照组降低了30%，表明肽处理可能减少了细菌的系统性扩散。尽管各处理组鸡的体重在数值上高于阳性对照组，但差异未达到统计学显著性。肽处理对肝脏中的ST载量未见显著影响，研究者推测这可能与肝脏中较高的肽酶活性和代谢速率有关。
丙氨酸扫描鉴定出PN3和PN5的关键活性氨基酸残基
为了深入理解肽的结构与功能关系，研究通过丙氨酸扫描技术，系统地将其序列中的每个氨基酸（除甘氨酸和个别因溶解度问题无法测试的位点外）替换为丙氨酸，并测试了这些类似物的抗菌活性。对于PN3，发现V1、Q2、Q5、D8、I12和E13这六个位点的丙氨酸取代会显著削弱其抑菌活性。对于PN5，V1、D3、K7、T10、S14和N15六个位点的丙氨酸取代导致活性显著下降。有趣的是，PN5的三个类似物（T4A、S5A和T11A）在15 mM和18 mM浓度下，其抗菌活性反而显著优于原始PN5肽，显示出通过定点突变优化肽活性的可能性。这些关键氨基酸残基的鉴定为未来基于PN3和PN5骨架进行理性药物设计提供了重要依据。
增加净正电荷并未显著增强PN3和PN5的活性
鉴于抗菌肽的净正电荷通常与其通过静电作用与带负电的细菌膜结合的能力相关，研究尝试通过将PN3和PN5序列中的带负电氨基酸（天冬氨酸D和谷氨酸E）替换为带正电的精氨酸（R）来增加其净电荷。然而，活性评估结果显示，这些带正电荷的类似物对ST的抑制效果与原始肽相比并无显著改善，甚至双R取代的PN3类似物活性有所下降。这表明对于PN3和PN5而言，其抗菌活性并非简单地由净正电荷数量决定，可能还涉及其他更复杂的结构因素和相互作用机制。
讨论与展望
综上所述，本研究全面表征了从益生菌中分离的抗菌肽PN3和PN5作为替代抗生素控制沙门氏菌感染的巨大潜力。它们具有广谱、高效、稳定、不易诱导耐药性、能清除生物膜和细胞内细菌以及体内安全有效等多重优点。尽管存在一些局限性（如蜡螟模型中仍有部分死亡、鸡模型中肝脏清除效果不显著、最佳给药剂量和方案有待进一步优化等），但本研究结果为开发一种新型的、可用于家禽生产链的抗菌策略奠定了坚实的基础。未来的研究重点应集中于阐明其精确的分子作用机制，探索通过饮水给药的可行性，并评估其对肠道菌群和宿主免疫的潜在调节作用，以期最终实现其转化应用，为应对沙门氏菌感染和抗生素耐药性这一全球性挑战提供新的解决方案。
