Aijaz Ahmad Rather | Aman Munirpasha Halikar | Ritika Sachdeva | Shivanshu Kumar Tiwari | T.R. Santhoshkumar
癌症研究项目，BRIC-Rajiv Gandhi生物技术中心，Poojappura，Thycaud P.O.，Thiruvananthapuram，Kerala 695014，印度
摘要
在活细胞中通过区分不同的细胞死亡类型来精确和定量评估CAR-T细胞诱导的细胞毒性，仍然是免疫疗法开发中的一个关键未满足需求。在单细胞分辨率下区分CAR-T疗法引起的凋亡和坏死对于阐明细胞毒性机制和预测治疗结果至关重要。然而，大多数活细胞检测方法缺乏这种时空敏感性。在这里，我们介绍了一种基因编码的双生物传感器系统，它可以同时监测caspase-3/7的激活和线粒体完整性，从而实现凋亡和坏死的实时区分。该平台结合了基于FRET的caspase传感器（RealCas3）和靶向线粒体的DsRed报告基因（MitoDsRed），这两种成分都与显微镜成像和流式细胞术兼容。我们应用该平台对anti-EGFR CAR-T细胞进行了功能分析，发现其细胞毒性具有双相特征：首先是caspase-3/7诱导的凋亡，随后是延迟的坏死。值得注意的是，该系统能够实时检测到继发性坏死，这是一种在传统检测方法中经常被误分类的免疫原性死亡类型。所开发的平台为免疫效应反应的实时功能表型分析提供了一种稳健且可扩展的方法，填补了免疫疗法开发过程中评估细胞死亡机制的关键空白。通过实现肿瘤细胞死亡方式及其发生时间的定量分析，这种双传感器系统为评估和合理设计更安全、更有效的下一代免疫疗法建立了机制框架。
引言
嵌合抗原受体（CAR）T细胞被设计为表达针对特定肿瘤相关抗原的合成受体（June等人，2018年），彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗范式，在复发性或难治性淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤中取得了治愈性结果（Nastoupil等人，2018年）。然而，这一成功尚未有效应用于实体瘤，因为实体瘤中的临床疗效受到抗原异质性、免疫抑制性肿瘤微环境、T细胞浸润不足以及治疗相关毒性的限制（Joyce和Fearon，2015年；Martinez和Moon，2019年；Newick等人，2017年）。关键的是，抗癌免疫疗法的成功不仅取决于抗原特异性和细胞杀伤能力，还取决于肿瘤细胞的死亡方式，后者会显著影响免疫反应（Galluzzi等人，2017年；Hänggi和Ruffell，2023年）。在活细胞系统中实时区分细胞死亡类型仍然是生物传感器开发的一个关键瓶颈，特别是在CAR-T细胞疗法等新兴免疫疗法的背景下。凋亡通常通过caspase激活发生，一般被认为是非炎症性过程（Nagata，2018年）。相比之下，坏死和其他免疫原性形式的细胞死亡会释放诸如HMGB1、ATP和calreticulin等危险相关分子，这些分子已被证实可以激活炎症途径并调节先天免疫反应（Galluzzi等人，2018年；Krysko等人，2012年）。这种炎症信号与不良的免疫介导的毒性有关，包括细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞神经毒性综合征（ICANS）（Hay等人，2017年；Morris等人，2022年），尽管肿瘤细胞死亡方式对这些毒性的贡献尚未完全明确。值得注意的是，CAR-T细胞诱导的焦亡已被确定为通过caspase-1激活和gasdermin介导的膜破裂来触发CRS的强大机制（Liu等人，2020年），这强调了在治疗环境中区分凋亡和炎症性死亡方式的必要性。这突显了需要工具来解析肿瘤细胞死亡结果与免疫激活和治疗效果之间的关系。
表皮生长因子受体（EGFR）在多种上皮来源的实体瘤中过度表达，包括三阴性乳腺癌（TNBC）（Normanno等人，2006年），使其成为探索CAR-T细胞介导的细胞毒性和相关肿瘤细胞死亡方式的理想靶点（Maher和Davies，2023年；Yu等人，2017年）。尽管有充分的理由针对EGFR和其他肿瘤相关抗原，但在实体瘤中进行的CAR-T细胞疗法临床试验仍然有限（Hou等人，2019年；Patel等人，2021年；Sterner和Sterner，2024年）。这些限制主要源于CAR-T细胞的持久性不足、免疫抑制性的肿瘤微环境、肿瘤抗原逃逸以及严重的免疫毒性（Brudno和Kochenderfer，2016年；Majzner和Mackall，2018年；Martinez和Moon，2019年）。然而，肿瘤细胞死亡机制（如凋亡与坏死）在实体瘤CAR-T疗法中的影响程度仍不明确，部分原因是现有平台无法实时区分或量化不同的死亡途径。关键的是，肿瘤细胞的死亡方式决定了治疗结果：虽然坏死途径可以增强抗肿瘤免疫和炎症反应，但其他非免疫原性形式可能会支持免疫逃逸（Hänggi和Ruffell，2023b；Igney和Krammer，2002年）。尽管这一需求已经得到广泛认可，但标准的细胞毒性检测方法（如LDH释放、流式细胞术或铬-51释放）都是基于终点的，提供的时间和机制分辨率有限（Kiesgen等人，2021年）。虽然像IncuCyte（实时成像）和xCELLigence（基于阻抗的检测方法）这样的动态监测平台提供了更好的时间分辨率，但IncuCyte受到染料毒性的限制，这影响了细胞杀伤事件的解读。相比之下，xCELLigence通过阻抗变化推断细胞毒性，而不是直接测量细胞死亡方式（Cerignoli等人，2018年；Martinez-Serra等人，2014年）。虽然无标记成像和3D球形细胞平台提供了更好的空间背景和高通量，但它们在准确分类凋亡、原发性坏死和继发性坏死方面仍存在困难（Zurowski等人，2023年）。先进的平台如BEHAV3D和CRYSTAL主要研究T细胞动态和基于granzyme的细胞裂解，但并不直接解析肿瘤细胞的下游命运（Alieva等人，2024年；Bednar等人，2023年）。相比之下，基因编码的生物传感器能够进行非侵入性的、跨时间和空间的细胞内动态长期监测，非常适合实时解析肿瘤细胞死亡机制（Ms等人，2024年）。然而，目前仍缺乏一种与CAR-T兼容的活细胞生物传感器平台，能够区分凋亡和原发性及继发性坏死。继发性坏死是一种当凋亡细胞未被吞噬细胞有效清除时发生的延迟细胞死亡形式，它是细胞死亡谱系中一个被忽视的组成部分，具有独特的免疫效应（Sachet等人，2017年；Silva，2010年）。这里描述的双传感器系统与实时显微镜成像和流式细胞术工作流程兼容，允许同时研究单细胞动态和群体水平的死亡特征。这使得该平台成为解析CAR-T细胞相互作用期间肿瘤细胞命运决策的强大工具，并有助于更好地理解在特定实验条件下不同死亡途径的机制。
本研究开发并应用了一种基因编码的双传感器平台，该平台结合了基于FRET的caspase-3/7报告基因（RealCas3）和线粒体DsRed探针，以实现凋亡、原发性坏死和继发性坏死之间的实时区分。然而，在单细胞水平上精确量化和监测细胞死亡动态需要稳定的报告基因表达，因为传感器丰度的异质性会引入变异性，从而影响比率FRET的准确性和后续分析（包括阈值设定、门控和标准化），这是非克隆报告基因系统的已知限制（Goedhart等人，2011年；Verma等人，2023年）。为了克服这一挑战并确保可重复性和有意义的解释，我们生成并验证了具有稳定和均匀双传感器表达的单细胞克隆。我们生成了稳定的双传感器肿瘤细胞系，使用机制定义的凋亡和坏死刺激验证了它们的性能，然后将其应用于与anti-EGFR CAR-T细胞共培养的EGFR阳性（EGFR+）实体瘤模型。此外，我们还使用标准的凋亡和坏死检测方法进行了正交验证，以确认和定量对齐双传感器的读数与已建立的标准凋亡和坏死检测方法，从而确保方法学的严谨性和跨平台的准确性。这一实验框架能够高分辨率地量化不同效应细胞与靶标（E:T）比例和抗原密度下的CAR-T细胞细胞毒性，从而阐明凋亡和坏死细胞死亡结果之间的时间顺序、负担依赖性和机制差异。
章节片段
细胞系和细胞培养
人类乳腺癌细胞系MDAMB-231和MCF-7、SiHa以及HEK293T细胞是从BRIC-Rajiv Gandhi生物技术中心（BRIC-RGCB）的中心细胞库获得的，位于印度Thiruvananthapuram。细胞在复苏后10代内使用。所有细胞系均在添加了10%热灭活的胎牛血清（FBS；Gibco，#10270-106）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Thermo Fisher Scientific，#11965092）中培养。EGFR特异性CAR-T细胞和表达乳腺癌细胞系的凋亡生物传感器的开发和验证
为了实现单细胞分辨率下CAR-T细胞诱导的细胞毒性的定量实时分析，我们设计并验证了一种第三代anti-EGFR CAR构建体，该构建体共表达核定位的荧光报告基因。慢病毒载体被设计为双顺反子表达CAR和核定位的蓝色荧光蛋白（BFP2），两者由自切割的P2A肽分隔，从而可以从单个转录本中等摩尔但独立地翻译（图1A）。
讨论
尽管CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著的临床成功（June等人，2018年），但将其应用于实体瘤仍然具有挑战性，因为实体瘤中的临床益处有限且变化较大，这归因于抗原异质性、免疫抑制性肿瘤微环境、T细胞浸润受限以及治疗相关毒性（Martinez和Moon，2019年；Newick等人，2017年；Sterner和Sterner，2021年）。除了这些生物学障碍之外，还有一个重要因素
结论
实时区分不同的肿瘤细胞死亡方式提供了对实体瘤中免疫-效应细胞相互作用的更细致的理解。在这项研究中，我们介绍了一个双传感器平台，能够对anti-EGFR CAR-T诱导的细胞毒性进行机制性表型分析。caspase-3/7 FRET报告基因与线粒体DsRed的结合，使得在活细胞成像和流式细胞术中能够清晰地区分凋亡、原发性坏死和继发性坏死。
CRediT作者贡献声明
T.R. Santhoshkumar：写作 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。Aman Munirpasha Halikar：正式分析，数据管理。Aijaz Ahmad Rather：写作 – 审稿与编辑，初稿撰写，验证，方法学研究，调查，正式分析，概念构思。Shivanshu Kumar Tiwari：正式分析。Ritika Sachdeva：写作 – 审稿与编辑，正式分析未引用的参考文献
Hänggi和Ruffell，2023a；June等人，2018年。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响手稿中报告的工作。
数据可用性
支持本研究发现的所有数据均包含在主论文和补充信息中。补充图表、表格和细胞分选策略包含在补充文件中。图像堆栈、流式细胞术（FCS）文件、实时成像视频和未裁剪的Western印迹已存放在Mendeley Data中，并可公开访问（http://dx.doi.org/10.17632/x6bn3nb9dx.1）。本研究中使用的质粒构建也是公开可用的。
资助
本工作得到了印度政府科技部生物技术部的终身成像设施研究资助（DBT），项目编号为BT/INF/22/SP33090/2019。Aijaz Ahmad Rather获得了印度UGC-MANF政府的SRF资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响手稿中报告的工作。
