农药污染是一个全球性的问题，对食品、环境和人类都有不良影响，因此迫切需要有效的检测方法来监测和规范农药的使用（Wang, Sun等人，2025）。最近的研究强调了快速现场检测技术在确保农业食品安全方面的关键重要性（Umapathi等人，2022）。为此，人们探索了各种先进的传感策略。例如，电化学设备，特别是那些利用先进纳米材料（如MXenes）的设备，由于其多功能性和高灵敏度，在检测食品污染物方面显示出巨大潜力（Umapathi等人，2025；Umapathi, Ghoreishian, Rani, Cho, & Huh, 2022）。同样，光学传感技术的进步也为现场筛查农药残留物提供了强大的工具（Umapathi等人，2022）。在这些技术中，免疫层析法（ICA）是一种最先进的即时检测（POC）技术，其特点是处理速度快、操作简单、设计紧凑且成本低廉（Gao等人，2025），已在诊断筛查（Park等人，2025）、食品安全控制（Tian等人，2025；Zhang等人，2025）和环境监测（Wang等人，2025）等领域得到应用。值得注意的是，基于金纳米粒子（AuNPs）的ICA是商业ICA系统中的主要选择，因其经济性、大规模生产能力和操作简便性而在水果和蔬菜中的农药残留物筛查中占据主导地位（Li等人，2024）。然而，AuNPs-ICA平台仍存在两个关键限制，限制了其更广泛的采用：（1）过量的抗体消耗会降低结合效率，从而导致检测灵敏度降低；（2）基质干扰（如样品中的pH值、色素、糖类、淀粉、蛋白质、脂质和金属离子）会干扰目标提取和抗体-抗原相互作用，从而影响分析准确性（Li等人，2025）。在之前的研究中，我们通过计算机辅助的合理半抗原设计制备了能够广泛识别呋喃丹（CBF）和3-羟基呋喃丹（3-OH-CBF）的单克隆抗体（mAbs），随后改造了AuNPs-ICA来筛查26种水果和蔬菜。分析显示，包括菠菜、红龙果、蓝莓、柠檬、鳄梨、山药、香菇、香蕉和紫甘蓝在内的9种农产品样品在AuNPs-ICA中表现出显著的基质干扰，需要高稀释倍数，导致灵敏度较低（Wang等人，2025）。经过分类研究、文献研究和营养分析后，得出结论认为干扰蛋白是导致水果和蔬菜中ICA产生基质效应的关键因素（Tiwari等人，2010；Wang, Lin, Cao, Zhang, & Sui, 2016）。因此，设计能够克服这些限制的新ICA平台对于提高复杂食品基质中的灵敏度和准确性至关重要。
了解蛋白质干扰机制有助于有针对性地开发减轻基质干扰的策略。研究表明，某些水溶性干扰蛋白在鱼类基质提取物中可以非特异性地结合到抗体Fc域，破坏抗体-抗原相互作用，从而严重影响定量准确性（Wang, Lin, Cao, Zhang, & Sui, 2016；Wang, Lin, Sui, & Cao, 2013）。基于文献和先前的发现，我们推测水果和蔬菜基质提取物中含有能够非特异性地与免疫探针Fc区域结合的内源性蛋白，形成空间约束，阻碍探针与目标或测试线（T线）抗原的相互作用，最终导致检测干扰。这表明在mAb结合过程中保护Fc区域是一种有效的方法，可以防止免疫探针与干扰蛋白之间的非特异性相互作用。目前用于mAb在载体上定向结合的方法包括：（1）通过生物素-链霉亲和素（SA）系统，利用生物素化mAb与链霉亲和素修饰载体之间的高亲和力相互作用（Gao等人，2024）；（2）基于微生物蛋白亲和力的定向，例如链球菌蛋白G（SPG）或葡萄球菌蛋白A（SPA）通过与mAb Fc区域的保守序列（Asn-Gln-Phe-Asn-Lys-Glu）结合（Bu等人，2021）；（3）利用特定山羊抗小鼠免疫球蛋白（GAMI）的分子识别介导的方向性交联（Yin等人，2024）（表S1）。例如，Hyun-Kyung Oh等人开发了一种基于等离子体颜色保持（PLASCOP）AuNPs簇的ICA，用于高灵敏度检测SARS-CoV-2。这些簇利用生物素-链霉亲和素桥维持>15 nm的粒子间距，防止等离子体耦合效应，实现了0.038 ng/mL的检测限，比传统AuNPs-ICA灵敏度高23.8倍（Oh等人，2022）。此外，Xinyi Mao等人使用SPG将抗体Fc片段定向标记在LFAs上，作为探针，在谷物样品中筛查黄曲霉素B1时实现了降低抗体消耗和部分减轻基质干扰的双重效果（Mao, Yu, Li, Li, & Shi, 2022）。另外，Sijie Liu等人利用山羊抗小鼠免疫球蛋白（GAMI）作为分子桥构建了Au-MnOx-GAMI-mAb结构，提高了mAb的利用效率13.33倍。这种纳米杂化组装使得通过ICA检测克伦特罗醇成为可能，灵敏度比AuNPs-ICA高9.37倍（Liu等人，2024）。因此，对mAb进行定向标记以最大化Fab区域的暴露是一种可行的策略，可以在保持最佳抗原结合功能的同时，最小化探针中干扰蛋白的非特异性结合。然而，目前还没有系统比较这三种定向标记策略在提高抗体利用效率和减少水果和蔬菜中干扰蛋白方面的效果。
碳纳米粒子（CNPs）作为一种常用的标记材料，由于其优异的亮度、强稳定性和宽吸收范围，在ICA中得到了越来越多的应用（Dang等人，2023；Zhang等人，2020）。此外，时间分辨荧光微球（TRFMs）具有窄对称发射、较长的荧光寿命和较大的斯托克斯位移，可以减少非特异性荧光的干扰（Hu等人，2017）。因此，在这项研究中，我们通过整合三种代表性的纳米载体（AuNPs、CNPs和TRFMs）和三种不同的Fc靶向策略（SA、SPA和GAMI），进行了系统的3×3跨维度评估。与以往专注于单一载体优化的研究不同，本工作的目标是：（1）确定在最小化mAb消耗的同时最大化生物活性的最佳架构；（2）从机制上验证定向连接剂在减轻基质干扰方面的效果。通过构建和比较这九种定向探针，我们成功建立了一个高性能平台，用于在复杂的水果和蔬菜样品中超灵敏和准确地检测CBF/3-OH-CBF。在方案1A中，通过分别用SA、SPA和GMAI桥修饰AuNPs、CNPs和TRFMs的表面，制备了九种定向载体，并进一步建立了基于定向标记mAb的ICA（OLAb-ICA），用于灵敏检测CBF/3-OH-CBF。同时，将OLAb-ICA与随机标记的mAb-ICA（RLAb-ICA）进行了比较。有效的OLAb-ICA是基于竞争原理构建的，其T线强度随目标浓度的增加而降低（方案1B）。在竞争性免疫测定中，检测限（LOD）严重依赖于mAb的数量、活性和信号强度（Bu等人，2022；Di Nardo, Cavalera, Baggiani, Giovannoli, & Anfossi, 2019）。传统的纳米材料（NMs）-mAb-ICA常常由于mAb在NMs上的随机定向而导致部分或完全失去抗体活性。相比之下，OLAb探针的主要优势在于它们提供了高发光的载体和与mAb Fc片段的方向性耦合。这种方法将mAb的消耗量减少了50–92.9%，有效暴露了Fab片段区域，并提高了系统灵敏度。此外，OLAb探针最佳地保护了Fc片段和mAb的生物活性，显著减少了9种水果和蔬菜中的基质干扰，并减少了提取体积，从而提高了检测准确性（方案1C）。这项工作为在复杂样品中开发高性能OLAb-ICA提供了新的视角。
