1 Introduction
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，深入了解肿瘤微环境（TME）对于开发更有效的疗法至关重要。TME包含多种细胞成分，如免疫细胞、内皮细胞和基质细胞，以及非细胞成分，如细胞外基质（ECM）和可溶性信号因子。所有这些成分在肿瘤发生、进展、转移和治疗反应中扮演重要角色。当前的治疗方法靶向肺TME的各种成分以阻止癌症进展。精确表征TME内的细胞群有助于开发新颖有效的靶向疗法。肺癌TME中CD45+细胞的异质性因其表型、丰度和空间分布不同而具有抑制或促进肿瘤生长的双重能力，特别令人关注。这些免疫细胞与肿瘤衍生因子之间的相互作用进一步影响疾病行为。例如，肿瘤衍生外泌体可将microRNA转移至这些细胞，激活促进肿瘤进展的通路。对miR-21和miR-29a的研究表明，这些microRNA可增强Toll样受体（TLR）信号传导，并有助于免疫调节和癌症转移。
在非小细胞肺癌（NSCLC）中，TME内CD45+细胞的组成动力学鉴定出至少十三种不同的免疫细胞类型，其中Cd4+T细胞和Cd8+T细胞占主导地位，突出了旨在消除肿瘤的强大适应性免疫反应。此外，使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）的研究为TME内不同免疫细胞的功能状态和相互作用提供了日益深入的见解。例如，调节性T（Treg）细胞和耗竭的Cd8+T细胞在早期和转移性肺癌中普遍存在，作为免疫抑制的介质，可促进肿瘤进展。另一项研究确定了三个免疫抑制群：耗竭的Cd8+T细胞、促炎性M2肿瘤相关巨噬细胞和促肿瘤的调节性B细胞，它们共同抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤进展。特定的免疫细胞类型可能根据癌症亚型对肿瘤动力学产生不同的影响，这使理解TME内的免疫相互作用进一步复杂化。一项对72,475个来自肺癌患者的免疫细胞的研究揭示了每种亚型独特的免疫组成和基因表达谱。CD45+细胞包括肿瘤和邻近组织中的不同群体。肺腺癌有更多具有免疫调节和脂质代谢特征的髓系细胞，而鳞状细胞癌则具有与T细胞激活和细胞因子反应相关的细胞毒性/效应T细胞和NK细胞增加，突出了塑造肿瘤免疫微环境的关键亚群。肺癌TME内的CD45+免疫细胞高度异质，由具有不同功能状态的不同亚型组成，且因肺癌亚型而异。这种异质性对肿瘤进展和治疗反应具有重要意义，使其成为改进免疫治疗策略的研究重点。
为了克服批量低分辨率方法的局限性，我们对来自健康肺、原位肿瘤和KrasLA2（Kras）小鼠模型的CD45+免疫细胞进行了scRNA-seq。该分析揭示了广泛的免疫重塑，并发现了已知和先前未识别的巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞亚群。不同的转录程序反映了肿瘤特异性的免疫适应和功能多样性。这些发现共同提供了肺TME的高分辨率图谱，并突出了可能为未来免疫治疗策略提供信息的细胞和分子通路。
2 Methods
2.1 Animal experiments
所有动物实验均经当地主管部门批准，并按照欧盟实验室动物护理和使用指南进行。小鼠饲养在无特定病原体条件下。本研究使用了两种小鼠肺癌模型：（i）静脉注射肺癌模型，其中通过尾静脉向C57BL/6小鼠注射LLC1细胞，并在注射后密切监测最多18天；（ii）KrasLA2基因工程肺腺癌小鼠模型。小鼠在达到预定义的人道终点时被安乐死，肺被采集并处理用于荧光激活细胞分选（FACS）分析。
2.2 Sample preparation and single-cell RNA sequencing
为了分离CD45+细胞，对每种条件（C57BL/6J对照、LLC1荷瘤和KrasLA2荷瘤）的三只小鼠的肺进行单独处理。每个肺被切碎并在含有5%胶原酶和1% DNase I的缓冲液中于37°C消化30分钟。消化后，细胞悬液依次通过100 µm和40 µm细胞筛网。细胞通过500 × g离心10分钟收集，并重悬于2 ml红细胞裂解液中以去除红细胞。裂解被淬灭后，细胞被洗涤、重悬于PBS中，并使用BD FACSAria III细胞分选仪分选CD45+细胞。根据设门策略，通过7-AAD染色排除死细胞。FACS后，将每种条件的三只小鼠的分选CD45+部分合并，为每种条件生成一个合并样本。细胞悬液用Moxi细胞计数器计数，并根据制造商方案稀释以获得每个样本10,000个单细胞数据点。每个样本在Chromium Controller上使用Chromium Next GEM Single Cell 3′ Reagent Kits v3.1（10x Genomics）单独运行。单细胞RNA测序文库制备使用标准方案进行。测序在NextSeq 500上进行，原始读数与小鼠基因组（mm10）比对并由StarSolo计数，随后以注释数据格式进行二次分析。
预处理后的计数使用Scanpy进行进一步分析。通过考虑检测到的基因数量和线粒体含量进行基本的细胞质量控制。我们移除了表达少于300个基因或线粒体含量大于8%的21个细胞。此外，我们过滤掉了在少于30个细胞中检测到的14,083个基因。所有核糖体和性别相关基因均从数据集中排除。每个细胞的原始计数被标准化为所有细胞的中位数计数，并转换为对数空间以稳定方差。我们最初使用PCA降低数据集的维度，保留了50个主成分。
2.3 Cell clustering
所有下游分析均使用SC-Framework进行。基于初始PCA的前6个PC，使用均匀流形近似和投影（UMAP）将数据转换为低维嵌入。使用Leiden算法进行聚类，分辨率为0.5。进一步细化产生4个最终簇。使用Scanpy中的“rank_genes_groups”功能识别标记基因。该方法应用t检验，并使用Benjamini-Hochberg程序进行多重假设检验校正以控制错误发现率。随后根据以下标准过滤标记基因：（i）相应簇内至少25%的细胞表达该标记基因，（ii）与所有其他簇的聚合表达相比，倍数变化≥0.5，以及（iii）在组外表达≤80%。通过将相同的功能和过滤器独立应用于按条件分层的每个子集来识别条件特异性标记基因。通过将识别出的标记基因与可公开访问的数据库进行比较，手动执行簇注释。从每个簇生成子集并进行子聚类，所有下游分析一致地在每个结果子集上进行。
2.4 Pathway enrichment analysis
对于通路分析，分别使用簇特异性和条件特异性标记基因作为KOBAS 2.0的预排序输入，利用KEGG Pathway参考数据库。使用上调或下调的基因执行两个独立的测试，以识别每个方向上受干扰的通路。通过保留仅在一个输入数据集中显示显著过度代表性（Benjamini-Hochberg调整后p值<0.2）的通路来整合结果，表明这些通路明显富集于上调或下调的基因，但不同时富集两者。为每个对比和调控方向选择前20个通路。
2.5 Receptor-ligand analysis
使用组平均表达的z-score计算受体-配体相互作用，按组大小缩放并按表达相应基因的细胞比例加权。相互作用得分定义为基于LIANA包中“mouseconsensus”数据库的有效受体-配体配对的总和。通过计算相互作用得分的成对分位数排序差异，进行条件间受体-配体相互作用的差异分析。
2.6 Flow cytometric validation of Cd3+macrophages
从KrasLA2肺制备单细胞悬液。细胞首先用Fc受体封闭溶液封闭以减少非特异性结合。使用碘化丙啶（PI）排除法鉴定活细胞。然后用以下抗体对细胞进行染色：CD45、CD3和F4/80。包括适当的同种型对照和荧光减一（FMO）对照以设门和评估非特异性染色。在流式细胞仪上分析染色的细胞。对于巨噬细胞中CD3表达的定量，测量平均荧光强度（MFI）。使用FlowJo软件分析数据。
2.7 Validation of Cd3+macrophages by immunofluorescence staining
使用PhenoCycler-Fusion平台对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的Kras肺肿瘤组织进行免疫荧光。将3微米厚的切片安装在带电玻璃载玻片上，并在65°C下烘烤一小时。载玻片在二甲苯中脱蜡，并通过分级酒精再水化至蒸馏水。在高压下在DAKO PT Link抗原修复缓冲液（pH 9）中进行热诱导表位修复20分钟，然后冷却至室温。载玻片在ddH2O中冲洗，洗涤两分钟，然后用水合缓冲液洗涤两次，每次两分钟，随后再用染色缓冲液处理30分钟。使用针对小鼠CD3ϵ（T淋巴细胞）和F4/80（巨噬细胞）的一抗。抗体要么是预偶联的，要么使用Akoya抗体-寡核苷酸偶联化学按照制造商方案与独特的寡核苷酸条形码偶联。在实验采集之前，在小鼠脾和肺对照组织上验证偶联效率和染色特异性。载玻片在4°C湿润室中与抗体混合物孵育过夜，随后在PBST中洗涤。根据制造商的说明，用1.6% PFA、甲醇和固定剂固定切片以稳定抗体-寡核苷酸复合物。将染色的载玻片加载到PhenoCycler-Fusion仪器上，并按照制造商的建议执行自动报告基因杂交、成像和切割循环。依次杂交与CD3ϵ和F4/80特异性条形码互补的荧光报告基因并进行成像。使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色进行图像配准和细胞分割。使用20倍物镜获取图像，优化每个通道的曝光时间以避免饱和。使用PhenoCycler-Fusion软件进行图块扫描和拼接。监测仪器提供的质控指标，包括信噪比、组织完整性和循环配准精度。
2.8 Statistics
比例分析：使用Scanpro评估不同条件下细胞群的相对变化。比例数据经过logit转换以方便统计分析。使用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。使用非配对t检验比较两个独立组之间的均值。
3 Results
3.1 Lung tumor type dictates immune landscape, transcriptional programs, and cellular crosstalk
为了研究免疫异质性，对来自健康小鼠、LLC1和致癌性KrasLA2肺肿瘤的CD45+免疫细胞进行了scRNA-seq。基于UMAP的聚类识别出四个主要免疫群体：B细胞、T细胞、NK细胞和巨噬细胞，这是由所有三种模型中的经典标记基因表达决定的。值得注意的是，免疫细胞群的组成在模型之间有所不同。在健康肺中，CD45+区室由36.8%的B细胞、39.4%的T细胞、10.1%的NK细胞和13.7%的巨噬细胞组成。LLC1肿瘤诱导了剧烈变化，B细胞扩增至62.7%，而T细胞和NK细胞分别减少至20.2%和6.5%，巨噬细胞相对稳定在10.6%。KrasLA2驱动的肿瘤保持了更接近健康肺的组成，B细胞占39.2%，T细胞占40.8%，NK细胞占9.3%，巨噬细胞占10.7%。模型间细胞类型比例的进一步分析显示，与健康和KrasLA2小鼠相比，LLC1模型中B细胞显著增加，T细胞减少。这些结果表明，LLC1肿瘤优先重塑适应性免疫群体，而KrasLA2肿瘤维持了更平衡的免疫景观。
B细胞转录程序是模型特异性的，反映了观察到的比例变化。LLC1 B细胞上调Ier5、Jun、Fos、Ifi27l2a和Scd1，与激活、炎症和代谢应激一致。相比之下，KrasLA2B细胞表达Fau、Ubb、Serf2和Adgre5，与应激反应和粘附相关，而健康B细胞维持稳态基因（Zfp36l2、Iglc1、Ccr7、Btg2）。T细胞也表现出环境依赖性状态。在健康肺中，T细胞表达Crlf3、Lck、Lef1和Saraf，反映了正常激活。LLC1 T细胞上调Ier2、Stk17b、Ifngr1和Ppp1r15a，表明了一种激活的、可能耗竭的表型。KrasLA2T细胞表达Grip2、Fau和Ptmaps2，显示出不同于健康和LLC1肺的独特激活状态。NK细胞遵循类似的模式：健康NK细胞表达Lgals1、S100a10、Klre1、Anxa2和Tagln2（稳态监视）；LLC1 NK细胞上调Fos、Dusp2、Klf6和Ubc（激活和应激）；KrasLA2NK细胞表达Klrc1、Psme2b和Ly6c2，提示功能抑制。巨噬细胞表现出相对稳定的组成但具有环境依赖性的转录状态。健康巨噬细胞表达Hspa1a、Hspa1b、Ahnak、Dynll1和Gpr141，而LLC1巨噬细胞上调Pim1、S100a11和Neat1（促炎性、肿瘤相关），KrasLA2巨噬细胞表达Ccl5和Psme2b，表明其具有免疫调节和抗原提呈作用。
基因集富集分析突出了免疫亚群的功能特化。在B细胞中，LLC1肿瘤激活了MAPK和TNF信号传导，而KrasLA2B细胞富集了代谢通路，包括肌醇磷酸代谢和Notch信号传导。LLC1巨噬细胞上调NF-κB信号传导、氧化磷酸化和内质网（ER）蛋白加工，而KrasLA2巨噬细胞富集了NK细胞介导的细胞毒性和抗原提呈通路。LLC1肿瘤中的T细胞显示氧化磷酸化、TNF信号传导和剪接体激活，而KrasLA2T细胞激活了谷胱甘肽代谢、N-聚糖生物合成和氨基糖代谢。LLC1肿瘤中的NK细胞富集了过氧化物酶体、Ras和磷脂酶D信号传导，而KrasLA2NK细胞表现出转录失调、TNF信号传导和凋亡。
受体-配体分析揭示了肿瘤特异性的免疫相互作用重编程。NK细胞和巨噬细胞显示出最高的相互作用密度，在KrasLA2模型中最强。健康肺通过Cd44、Ptprc和Klrd1显示相互作用，而LLC1肿瘤显示巨噬细胞配体（Lyz2、Vim、Tgfb1）减少，交互减少。KrasLA2肿瘤表现出增加的相互作用，包括Thy1-Itgb2（T细胞-NK细胞）、Cd44-Pkm（巨噬细胞）和S1pr1-Gnai2（T细胞-巨噬细胞），突出了环境依赖性的免疫通讯。这些发现表明，TME以模型依赖的方式塑造肺免疫细胞的组成和功能状态。LLC1肿瘤驱动B细胞扩增和适应性免疫抑制，伴随着炎症和应激相关的转录程序。KrasLA2驱动的肿瘤保留了更平衡的免疫组成，但诱导了独特的转录重塑和新型的细胞间通讯网络，强调了跨B细胞、T细胞、NK细胞和巨噬细胞的环境特异性免疫调节和功能特化。
3.2 Tumor-driven expansion and functional divergence of antigen-presenting and regulatory B cells
B细胞构成了健康、LLC1和KrasLA2荷瘤小鼠中最大的免疫簇之一。基于经典标记基因的子聚类识别出转录不同的亚群：晚期祖B细胞、成熟B细胞、浆细胞、前Bcr细胞和静息B细胞。这些亚群的比例在模型之间显著不同。成熟B细胞是KrasLA2肿瘤中的主要亚群（81.5%），但在健康（11.5%）和LLC1（8.1%）肺中代表少数群体。相比之下，静息B细胞在健康（66.4%）和LLC1（76.5%）小鼠中占大多数，但在KrasLA2（5%）中罕见。前Bcr细胞在KrasLA2（3.9%）中也比在健康（10.6%）和LLC1（12.2%）中减少，而晚期祖B细胞在LLC1（2.8%）中低于健康（10.5%）和KrasLA2（9%）。浆细胞在所有模型中始终罕见（<1%）。这些转变表明，KrasLA2肿瘤以牺牲静息和早期B细胞群体为代价驱动成熟B细胞的扩增，而LLC1维持了更稳态的B细胞组成。
转录程序反映了这些比例变化。KrasLA2中的静息B细胞，尽管数量有限，但富集了免疫信号和代谢基因（Grip2、Nfkbid、Ccl5、Ndufb1），而LLC1和健康的静息B细胞维持了稳态或应激反应程序。KrasLA2成熟B细胞上调促炎和免疫调节基因（Ccl5、Nfkbid、Eno1），与其在TME中的主导地位一致，而LLC1成熟B细胞表达细胞骨架、应激和代谢基因（Actg1、Ier5、Scd1、Selenow）。晚期祖B和前Bcr细胞表现出肿瘤特异性的转录适应，KrasLA2亚群偏向线粒体功能和蛋白质周转（Serf2、Fau、Ubb），LLC1亚群表达应激和分化基因（Ier5、Fos、Jun）。浆细胞，尽管丰度低，但显示出模型特异性的基因特征：KrasLA2细胞上调泛素化和细胞骨架重塑基因，而LLC1细胞激活应激反应和即时早期基因。
通路和受体-配体分析进一步反映了这些差异。KrasLA2B细胞富集了NK细胞介导的细胞毒性、mTOR、TCR和N-聚糖生物合成通路，而LLC1亚群激活了NF-κB、Toll样受体、MAPK和氧化磷酸化通路。KrasLA2B细胞也表现出静息到浆细胞的交互（Cd69-Lgals1、Sell-Selplg），而LLC1肿瘤显示出广泛的跨亚簇相互作用，健康肺主要显示浆细胞自身相互作用。总体而言，B细胞比例的变化与肿瘤特异性的转录程序和细胞间通讯模式一致，突出了KrasLA2肿瘤中功能活跃的成熟B细胞的扩增，以及LLC1和健康肺中稳态群体的维持。
3.3 Context-dependent reprogramming of Cd4+, Cd8+, and regulatory T cells in lung tumors
在分析了B细胞区室后，接下来检查了T细胞群体，这是在所有条件下免疫景观的关键组成部分。鉴于T细胞在抗肿瘤免疫中的关键作用，我们更详细地评估了它们的异质性。基于经典标记基因表达的子聚类揭示了跨健康、LLC1和KrasLA2模型的六个不同的T细胞亚群：激活的Cd8+T细胞、Cd4+T细胞、Cd8+记忆T细胞、Cd8+T细胞、T辅助17（Th17）细胞和调节性T细胞（Tregs）。群体分布在条件之间显著不同。Cd4+T细胞是最丰富的亚型，在健康对照中占T细胞的42.6%，但在LLC1和KrasLA2肿瘤中分别降至32.2%和30.2%。Cd8+T细胞在条件之间保持相对稳定的存在（健康：28.2%；LLC1：25.5%；KrasLA2：25.2%）。值得注意的是，Cd8+记忆T细胞在肿瘤模型（LLC1：16.8%；KrasLA2：14%）中扩增，与健康组织（9.4%）相比，反映了潜在的抗原驱动记忆反应。激活的Cd8+T细胞在KrasLA2肿瘤（13.9%）中显著富集，其频率相对于LLC1（6.7%）和健康样本（5.9%）增加了一倍以上。Tregs在两种肿瘤环境中（LLC1：15.5%；KrasLA2：12.9%）也比健康对照（10.2%）增加，而Th17细胞比例在所有组中保持稳定。然而，不同亚型比例的分析显示模型之间没有显著变化。
为了阐明这些亚群内的功能状态，我们检查了转录谱。KrasLA2肿瘤中的Cd4+T细胞上调了基因，如Grip2、Uba52和未表征基因（Gm10269、Gm11878、Gm14303）。LLC1 Cd4+T细胞表达Dusp1、Ifngr1、Pim1、Nfkbia和Mcl1，与增强的激活、凋亡抵抗和干扰素信号传导一致。健康Cd4+细胞上调静止相关基因Klf2和Lef1。Cd8+T细胞表现出模型特异性的适应：KrasLA2肿瘤显示Ms4a4c、Ly6a、Cd74和Ccl5增加，表明激活、抗原提呈和趋化因子信号传导增强。LLC1细胞上调Btg1、Ddx5、Vps37b、Ifngr1和Mcl1，反映了增殖、干扰素反应和凋亡抵抗。健康Cd8+细胞表达基线免疫信号标记，如Crlf3、Lck、Peli1和S100a10。Cd8+记忆T细胞显示出不同的代谢和激活特征：KrasLA2相关记忆细胞上调应激和代谢基因（Hspa8、Ndufb1、Eno1），而LLC1记忆细胞表达Ifngr1和Cd69，与免疫参与一致。健康记忆T细胞升高Il7r、Ccr7和Hspa1b，支持稳态和迁移。
荷瘤小鼠中的Tregs表现出免疫抑制转录程序。KrasLA2Tregs上调Mir703、Snrpg、Grip2、Serf2、H2-Q7和Eno1，暗示代谢和抗原加工适应。LLC1 Tregs显示Hif1a、Tnfrsf4（OX40）、Ifngr1、Tnfrsf18（GITR）、Traf1和Arf4表达增加，支持存活、激活和免疫抑制。健康Tregs偏向与细胞骨架组织和稳态相关的基因，包括Tagln2、Lsp1和S100a10。激活的Cd8+T细胞，在KrasLA2肿瘤中显著扩增，表达效应分化标记（Zeb2、Pdcd4、Ly6c2、Cd6）以及耗竭相关基因。LLC1激活的Cd8+T细胞上调Mcl1、Dusp2、Klf6和Rgs1，表明在免疫抑制微环境内存在抗凋亡机制和功能障碍。健康激活的Cd8+细胞表达稳态基因Hsp90ab1和Lsp1。最后，Th17细胞，尽管丰度稳定，但显示出模型特异性的转录谱。KrasLA2Th17细胞上调Serf2、Ubb和未表征基因，提示应激反应和抗原提呈作用。LLC1 Th17细胞表达Mcl1、Fosb、Cd69和Tnfrsf18，反映了促肿瘤炎症和存活。健康Th17细胞偏向稳态基因，如Hsp90ab1和Rack1。
进一步的通路分析
