Abstract
背景
肾移植是终末期肾病患者最后的治疗选择。尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是移植受者尿路感染（UTI）的主要致病菌。大肠杆菌对抗生素治疗日益增长的耐药率以及多种毒力因子的存在，对这一脆弱人群构成了严重关切。本研究旨在调查肾移植受者来源的UPEC分离株中喹诺酮耐药性和关键毒力基因的情况。
材料与方法
研究收集了2022年至2024年间来自伊朗德黑兰Yekta、Gholhak和Labbafi Nezhad医院实验室的50株肾移植术后诊断为UTI的患者来源的大肠杆菌分离株。采用 Kirby-Bauer 纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验（AST）。此外，通过聚合酶链式反应（PCR）检测 ompT、fimH、hlyA、aac (6’)-Ib、qnrA 和 qnrB 基因的存在。
结果
药敏试验结果显示，分离株对多种抗生素呈现高耐药率：氨苄西林（94%）、阿莫西林-克拉维酸（54%）、氨苄西林-舒巴坦（64%）、哌拉西林-他唑巴坦（54%）、头孢唑林（88%）、头孢吡肟（70%）、头孢噻肟（80%）、头孢西丁（48%）、头孢泊肟（80%）、多利培南（16%）、厄他培南（20%）、美罗培南（72%）、亚胺培南（18%）、庆大霉素（34%）、妥布霉素（44%）、阿米卡星（28%）、环丙沙星（62%）、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（70%）、呋喃妥因（20%）以及磷霉素（86%）。喹诺酮相关耐药基因的检出频率分别为：aac (6′)-Ib 为30%，qnrA 为18%，qnrB 为8%。毒力基因的分布情况为：ompT 为40%，fimH 为82%，hlyA 为10%。
讨论与结论
肾移植受者因长期使用免疫抑制剂而增加UTI风险。大肠杆菌是最常见的病原体，且常与多重耐药（MDR）相关。本研究显示，对氨苄西林和环丙沙星的耐药率尤其高。基因检测揭示了喹诺酮耐药基因和毒力基因的流行，其中fimH粘附素基因频率最高，提示其在感染中的关键作用。相当数量的分离株同时携带侵袭性基因和耐药基因，这可能加剧感染严重程度并影响治疗效果，且存在通过质粒共转移传播的风险。环丙沙星等治疗性抗生素的高表型和分子耐药率增加了大肠杆菌UTI感染治疗失败的风险。fimH的高流行强调了其在细菌定植和持续感染中的作用。这些发现凸显了应用表型药敏试验和分子筛查抗生素耐药性，并结合毒力基因分析，以制定有效治疗策略和预防UTI患者大肠杆菌感染的迫切需要。
引言
肾移植是终末期肾病患者的最终治疗选择，显著提高了患者的生存率和生活质量。然而，移植后感染构成了重大挑战，可能导致严重并发症和死亡率增加。尿路感染（UTI）尤其令人担忧，因为它们与移植物功能不全风险增加和更高的医疗成本相关。多种因素会增加肾移植受者发生UTI的风险，例如移植前肾功能不全、糖尿病、高龄和复发性UTI病史。UTI可导致败血症，近期数据表明，即使是单次UTI发作也可能对移植物功能产生负面影响，此外还有进展为败血症的风险。
在引起UTI的细菌中，尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是最常见的原因，占社区获得性感染的90%和医院获得性感染的50%。该细菌已进化出多种毒力因子，例如fimH（1型菌毛）、hlyA（溶血素）和ompT（外膜蛋白T）。这些因子在细菌粘附、侵袭和抵抗宿主免疫防御中起关键作用，从而加剧了UTI的严重程度。由于大肠杆菌具有多样的系统发育背景，这些毒力因子的存在和表达可能存在显著差异。
世界卫生组织（WHO）已将氟喹诺酮类药物列为关键抗生素类别，常被处方用于治疗感染大肠杆菌的肾移植患者。然而，日益增长的抗生素耐药性限制了其使用。大肠杆菌分离株对喹诺酮类的耐药是通过保护DNA旋转酶和拓扑异构酶IV免受喹诺酮类抗生素作用而发生的。这种耐药性由质粒介导的喹诺酮耐药基因如qnrA和qnrB所介导。此外，由aac(6′)-Ib基因编码的氨基糖苷类修饰酶通过乙酰化氟喹诺酮类药物，降低了对这些抗生素的敏感性，从而促进了耐药性。
鉴于移植后感染导致高死亡率，有必要进行进一步研究以了解与移植患者抗生素耐药性发展和UTI严重程度相关的因素。因此，本研究旨在调查肾移植后UTI患者大肠杆菌分离株中关键毒力基因和喹诺酮相关耐药基因的流行情况。
方法
本研究中的所有肾脏均为自愿捐赠，并获得了书面知情同意，且研究遵循《伊斯坦布尔宣言》进行。
尿液采集
尿液采集作为所有出现UTI体征患者常规医院实验室程序的一部分。所有尿液样本均基于中段清洁排尿法收集于无菌容器中。
细菌分离与鉴定
本研究使用了50株非重复的大肠杆菌分离株，这些菌株来源于2022年2月至2024年5月期间转诊至伊朗德黑兰Yekta和Gholhak实验室以及Labbafi Nezhad医院的肾移植术后患有UTI的患者。尿液样本采集于无菌容器中，随后接种于血琼脂平板、EMB琼脂平板和麦康凯琼脂平板进行培养。对疑似为肠杆菌科的革兰氏阴性分离株进行生化鉴定。被鉴定为大肠杆菌的分离株随后被送往德黑兰 Shahid Beheshti 医科大学微生物学研究实验室。本研究获得了 Shahid Beheshti 医科大学伦理委员会的批准（批准号：IR.SBMU.RETECH.REC.1403.533）。通过革兰氏染色和标准生化试验（包括过氧化氢酶、氧化酶、IMViC（吲哚、甲基红、VP试验、枸橼酸盐利用）、三糖铁琼脂（TSI）、脲酶、动力以及氧化发酵试验）对血琼脂和麦康凯琼脂平板上的纯培养物进行确认。分离株保存于含10%甘油和TSB的溶液中，于-70°C储存以备进一步评估。
抗菌药物敏感性试验
根据临床和实验室标准协会（CLSI）指南，采用 Kirby-Bauer 纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验，并使用大肠杆菌 ATCC 25922 作为质控菌株。本研究使用的抗生素包括：氨苄西林（10 μg）、氨苄西林-舒巴坦（10/10 μg）、阿莫西林-克拉维酸（20/10 μg）、头孢噻肟（30 μg）、头孢西丁（30 μg）、头孢吡肟（30 μg）、头孢唑林（30 μg）、亚胺培南（10 μg）、美罗培南（10 μg）、厄他培南（10 μg）、多利培南（10 μg）、阿米卡星（30 μg）、妥布霉素（10 μg）、庆大霉素（10 μg）、哌拉西林/他唑巴坦（100/10 μg）、环丙沙星（5 μg）、磷霉素（200 μg）、呋喃妥因（300 μg）、甲氧苄啶（5 μg）、头孢泊肟（10 μg），购自 Mast group 和 Rosco 公司。
DNA提取
采用煮沸法提取细菌DNA。简要步骤如下：从过夜培养物中收获纯化的大肠杆菌菌落，用无菌蒸馏水洗涤。将细胞沉淀重悬于无菌蒸馏水中，涡旋混匀，然后在100°C煮沸10分钟。立即将裂解液置于冰上冷却5分钟，离心去除细胞碎片。收集含有基因组DNA的上清液，于-70°C保存用于后续分子研究。
毒力因子和氟喹诺酮耐药基因的检测
如表1所述，采用特异性引物的PCR技术筛查hlyA、fimH、ompT、aac(6′)Ib、qnrA和qnrB基因。PCR反应总体积为25 μL，包含1.5X Taq PCR Master Mix、每种引物各1 μM以及2 μL模板DNA。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。本研究使用三株大肠杆菌作为对照，包括ATCC 25922、一株同时携带hlyA和fimH基因的大肠杆菌菌株（由伊朗医科大学的Shiva MirKalantari博士惠赠）以及一株来自我们先前研究的qnrA阳性大肠杆菌分离株。
测序
由Metabion公司对临床分离株中携带的ompT、aac(6′)Ib和qnrB基因进行Sanger测序以确认其存在。使用Chromas 1.45软件和NCBI的BLAST进行进一步的核苷酸分析。
统计分析
本研究采用描述性统计学方法，使用GraphPad Prism软件版本9.4.1评估抗生素耐药性和毒力基因的频率。以n（%）形式提供患病率估计值，并计算95%置信区间（CI）。未进行比较分析。
结果
细菌鉴定与药敏结果
所有大肠杆菌菌落经鉴定和确认，表现为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性，TSI为A/A产气，H2S阴性，IMViC为+ + - -，脲酶阴性，动力阳性。根据CLSI指南判读的药敏试验结果显示，耐药率最高的抗生素是氨苄西林（94%， CI: 83.5–98.0），其次是头孢唑林（88%， CI: 76.2–94.4）、磷霉素（86%， CI: 73.4–93.1）、头孢噻肟（80%， CI: 66.8–88.9）、头孢泊肟（80%， CI: 66.8–88.9）、美罗培南（72%， CI: 58.1–82.5）、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（70%， CI: 56.2–80.9）、头孢吡肟（70%， CI: 56.2–80.9）、氨苄西林-舒巴坦（64%， CI: 50.1–75.9）、环丙沙星（62%， CI: 48.2–74.1）、阿莫西林-克拉维酸（54%， CI: 40.4–67.0）、哌拉西林-他唑巴坦（54%， CI: 40.4–67.0）、头孢西丁（48%， CI: 34.8–61.5）、妥布霉素（44%， CI: 31.2–57.7）、庆大霉素（34%， CI: 22.4–47.8）、阿米卡星（28%， CI: 17.5–41.7）、厄他培南（20%， CI: 11.2–33.0）、呋喃妥因（20%， CI: 11.2–33.0）、亚胺培南（18%， CI: 9.8–30.8）、多利培南（1%， CI 0.0–7.1）。
耐药基因和毒力基因的PCR鉴定
PCR结果显示，在肾移植受者UTI来源的大肠杆菌分离株中，fimH基因的检出频率最高（82%， CI: 69.2–90.2），其次是ompT（40%， CI:27.6–53.8）、aac (6´) Ib（30%， CI: 19.1–43.8）、qnrA（18%， CI: 9.8–30.8）、hlyA（10%， CI: 4.3–21.4）和qnrB（8%， CI: 3.2–18.8）。
在多个分离株中观察到侵袭性基因和耐药基因同时存在。值得注意的是，28%（CI: 17.5–41.7）的分离株同时携带aac (6´) Ib和fimH基因，20%（CI: 11.2–33.0）同时携带aac (6´) Ib和ompT基因，6%（CI: 2.1–16.2）同时存在aac (6´) Ib和hlyA基因。此外，16%（CI: 8.3–28.5）的大肠杆菌分离株同时携带qnrA和fimH基因，而4%（CI: 1.1–13.5）同时存在qnrA和ompT基因。没有分离株同时检出qnrA和hlyA、qnrB和hlyA（CI: 0.0–7.1）。另外，4%（CI: 1.1–13.5）的分离株显示同时存在qnrB和fimH基因，4%（CI: 1.1–13.5）的分离株同时携带qnrB和ompT基因。
讨论
肾移植受者因长期使用免疫抑制药物而增加UTI风险。在各种细菌中，大肠杆菌是与这些感染相关的最常见病原体，并且通常与多重耐药（MDR）相关。在本研究中，β-内酰胺类抗生素中对氨苄西林和氨苄西林/舒巴坦的耐药率高于该类其他抗生素。此外，氟喹诺酮类药物环丙沙星的耐药率显著偏高，超过60%。这些发现与先前的研究一致。然而，其他流行病学调查报道的氟喹诺酮耐药频率较低。这些发现之间的差异可能归因于地理区域、抗生素处方模式和各自国家感染控制政策的差异。
除流行病学因素外，遗传机制在氟喹诺酮耐药模式的发展中也起着关键作用。抗生素耐药性的出现可能与赋予耐药性的基因有关，包括专门影响氟喹诺酮敏感性的质粒介导的决定因子。
研究结果显示，qnrA、qnrB和aac (6′)-Ib基因的流行率分别为18%、8%和30%。Raheem等人报道了与本研究观察到的相似的模式。他们的研究强调，qnr基因在18%的UPEC分离株中检测到。类似地，其他研究也报道了临床分离株中qnr基因的低流行率。鉴于30%的分离菌株携带aac (6′)-Ib基因，该基因很可能有助于氟喹诺酮耐药性的发展。在Esmaeel等人进行的类似调查中，aac (6′)-Ib基因被确定为最常见的氟喹诺酮耐药基因。然而，qnr基因的流行率高于我们的报道。此外，Badamchi等人记录显示，aac(6′)-Ib基因存在于24%的伊朗患者大肠杆菌分离株中。
研究表明，抗生素耐药基因在不同研究和地理区域中表现出不同的流行率。这种变异性可能与抗生素使用模式和不同的用药方案有关。除了抗菌药物耐药性，细菌毒力因子显著影响尿路感染的严重程度和临床结局。
多种毒力因子有助于大肠杆菌的致病性，可通过PCR检测。编码FimH粘附素的基因被认为是大肠杆菌在UTI中毒力的重要因素之一，通过促进UPEC在膀胱中的定植、侵袭和持续存在来促进致病性。我们的研究结果表明，fimH基因的频率高于其他检测的基因，表明该基因在引起UTI的大肠杆菌感染中起着至关重要的作用。该基因在我们菌株中的分布与先前公布的数据一致。然而，其他研究注意到UTI患者中fimH PCR阳性菌株的百分比更高。这种差异可以通过突变的发生和未能检测到它们来解释。在本研究中，hlyA和ompT基因的频率分别为10%和40%。然而，这些毒力因子的流行率在其他研究中有所不同，样本来源、地理区域和宿主临床条件的差异可以解释这种不一致。此外，我们的研究结果表明，相当数量的分离株同时携带侵袭性基因和耐药基因，这与先前的研究一致。同时携带两种类型基因的分离株可能导致更严重的感染或表现出较差的治疗反应。此外，侵袭性基因和耐药基因在质粒上的共存可能对大肠杆菌感染控制构成更大的威胁，因为它们可以共同转移并传播到其他分离株。
结论
本研究揭示了肾移植受者UTI来源的大肠杆菌分离株中存在显著的抗生素耐药性水平以及毒力基因的分布。据我们所知，当前研究首次报道了肾移植患者UTI大肠杆菌分离株中质粒介导的喹诺酮耐药基因和侵袭性基因同时存在，这可能与不良的治疗结局相关。对环丙沙星等治疗性抗生素的高表型和分子耐药率增加了大肠杆菌UTI感染治疗失败的风险。与细菌粘附、定植和尿路中大肠杆菌持续存在相关的fimH基因的高流行，也强调了该基因在UTI患者大肠杆菌感染发展中的作用。总的来说，这些发现强调了应用表型抗菌药物敏感性试验和抗生素耐药性分子筛查，并结合毒力基因分析，以制定有效治疗策略和预防UTI患者大肠杆菌感染的迫切需要。需要进一步进行多中心、纵向研究，以检验这些遗传谱在更广泛临床分离株中的临床影响，从而确定治疗结果并为基于证据的治疗指南提供信息。
缩写
aac (6′)-Ib, 氨基糖苷乙酰转移酶(6′)-Ib; AST, 抗菌药物敏感性试验; ATCC, 美国模式培养物集存库; CI, 置信区间; CLSI, 临床和实验室标准协会; 大肠杆菌, 大肠埃希菌; fimH, 菌毛粘附素基因; hlyA, 溶血素A; IMViC, 吲哚, 甲基红, VP试验, 枸橼酸盐利用; MDR, 多重耐药; NCBI, 美国国家生物技术信息中心; ompT, 外膜蛋白酶T; PCR, 聚合酶链式反应; qnrA, 喹诺酮耐药基因A; qnrB, 喹诺酮耐药基因B; TSI, 三糖铁琼脂; UPEC, 尿路致病性大肠杆菌; UTI, 尿路感染。
伦理批准与知情同意
本研究经 Shahid Beheshti 医科大学伦理委员会批准（批准号：IR.SBMU.RETECH.REC.1403.533）。
作者贡献
所有作者对报告的工作做出了重大贡献，无论是在构思、研究设计、执行、数据获取、分析和解释方面，还是在所有
