研究围绕机会性人类病原体铜绿假单胞菌展开。这是一种在危重病人和慢性肺病患者（如囊性纤维化）中引起医疗相关感染的常见原因。随着多重耐药（MDR）、广泛耐药（XDR）甚至难治性耐药（DTR）菌株的出现，治疗变得极具挑战。近年来，虽然引入了新型抗假单胞菌β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合（BL/BLI），但耐药率仍在上升。在这种背景下，头孢地罗（Cefiderocol， FDC）作为一种创新的铁载体头孢菌素偶联抗生素被设计出来，旨在利用细菌自身的铁摄取系统——TonB依赖性铁载体受体——来穿透革兰氏阴性菌的外膜，从而克服固有的和获得性的β-内酰胺耐药机制。尽管FDC在体外对许多耐药菌株显示出高活性，但在治疗过程中出现的临床失败和耐药性增长已成为关注焦点。先前的研究已表明，TonB依赖性受体的失活，特别是儿茶酚铁载体受体piuA，会显著阻碍药物渗透，导致快速耐药。本研究则聚焦于实验室菌株PA14，深入探究了FDC耐药机制，特别是铁载体吡啶螯铁素受体FptA的作用。
FptA是FDC的推定受体
既往研究发现，临床分离株在抗生素暴露后出现的fptA突变与FDC敏感性降低相关，且过表达FptA会增强菌株对FDC的敏感性，暗示铁结合的FDC（Fe(III)-FDC）可能利用FptA进入细菌。为了证实这一点，研究团队进行了分子对接模拟。他们首先验证了对接方案，成功复现了Fe(III)-pyochelin复合物与FptA蛋白（PDB 1XKW）的结晶结构结合模式。随后，他们构建了FDC与Fe3+离子配位的三种不同络合物模型，并分别与FptA进行对接。
对接实验显示，所有预测的Fe(III)-FDC复合物均与Fe(III)-pyochelin结合在FptA的同一口袋中。其中，[Fe(III)–FDC(H2O)]构象的结合评分与吡啶螯铁素复合物相当，其结合模式与Fe(III)-pyochelin复合物相似，涉及与残基L116和L117骨架形成氢键，以及与F114、M271、L332、Y334、Y356、F358和W702等残基产生疏水/芳香相互作用。这些预测结果支持了FptA可能作为FDC受体的假说。
fptA失活是PA14产生FDC耐药性的第一步突变
为了验证FptA缺失在PA14中对FDC耐药的作用，研究团队构建了fptA基因缺失突变体（PA14ΔfptA）。结果显示，fptA的缺失导致对FDC的敏感性显著下降，表现为抗生素纸片扩散法抑菌圈直径减小和最低抑菌浓度（MIC）增加2至4倍。有趣的是，在野生型PA14的FDC纸片扩散试验中，48小时内出现了内环菌落（inner-zone colonies），这些菌落几乎全部（10/12）表现出FDC敏感性降低，表明它们是获得了耐药机制的自发突变体。
随后，研究人员利用Chrome Azurol S（CAS）活性测定法筛选了这些自发突变体的铁载体产量。在Mueller-Hinton琼脂上，铁载体活性主要由更小、扩散性更强的吡啶螯铁素驱动。与野生型相比，fptA缺失突变体（PA14ΔfptA）表现出较低的铁载体活性，这与其通过正反馈环路调控吡啶螯铁素生物合成的已知作用一致。10株FDC适应性自发突变体中，有9株表现出较差的吡啶螯铁素产量。对其中两株进行全基因组测序发现，一株在fptA基因中存在无义突变，另一株在fptA的转录调节因子pchR基因中存在移码突变。唯一一株FDC敏感性降低但吡啶螯铁素产量正常的突变体，则被发现存在cpxS基因突变。这些发现表明，fptA的失活或下调是PA14适应FDC压力的首选第一步突变。
为了进一步验证在单一FDC暴露下，fptA是否也是被选择性靶向的基因，研究团队对PA14进行了转座子插入筛选。从最高允许细菌生长的FDC浓度培养物中分离出的三个随机突变体，均表现出FDC敏感性降低，并且转座子插入位点均在fptA的开放阅读框内。这再次证实了FptA缺失是面对FDC暴露时的一个首要适应性步骤。同时，研究还发现，通过基因手段破坏吡啶螯铁素生物合成（ΔpchA）也会降低野生型PA14和pyoverdine生物合成突变体（PA14ΔpvdA）对FDC的敏感性。
fptA失活后的第二步突变导致PA14对FDC完全不敏感
此前在临床分离株中已观察到，第一步突变之后常伴随着第二步突变，共同导致完全的FDC不敏感。为了系统性识别在FptA缺失背景下与FDC不敏感相关的其他突变，研究团队在PA14ΔfptA背景下进行了转座子诱变，并从最高允许生长的FDC浓度培养物中分离出突变体。
他们鉴定出三种不同的突变体，其FDC MIC相对于ΔfptA亲本株至少增加了2倍。这些转座子分别插入了piuA（编码儿茶酚铁载体受体）、PA14_31850（编码一种假设蛋白）和pilM（IV型菌毛生物合成基因）的开放阅读框。piuA是先前已确定的FDC摄取重要受体。而PA14_31850和pilM分别位于多重药物外排泵基因muxA和编码青霉素结合蛋白1A（PBP1A）的ponA基因上游。研究人员推测，由于转座子中的庆大霉素抗性盒缺乏转录终止子序列，插入这些上游基因可能导致了muxA和ponA的组成型过表达。通过qRT-PCR测量mRNA水平，证实了这两个基因在转座子突变体中确实存在过表达。
基于这些发现和既往临床分离株中鉴定出的突变组合（如pirR失活、fptA失活以及cpxS活性增加），研究团队通过等位基因交换在实验室菌株中构建了相应的单突变和组合突变体，以验证其对FDC表型的具体贡献。结果显示，单基因突变中，PA14ΔpirR菌株的FDC敏感性（纸片直径和MIC）与野生型无显著差异；而携带临床分离株中发现的cpxSΔ86-98等位基因的菌株，其FDC MIC增加了约2倍。多基因组合突变则表现出更强的耐药性：PA14ΔfptAΔpirR双突变体的FDC MIC增加至接近临床实验室标准化协会（CLSI）的折点（4 µg/mL），而PA14ΔfptAcpxSΔ86-98双突变体则表现出不敏感的MIC值（8 µg/mL）。
尽管fptA缺失和cpxSΔ86-98突变在单基因背景下产生了相似的FDC MIC（2 µg/mL），但细菌在不同浓度FDC下的生长动力学曲线显示，fptA缺失突变体在低浓度FDC下的生长延迟不如pirR或cpxS突变体明显，表明其在FDC存在下具有更好的适应性。重要的是，与影响药物摄取的突变（如ΔfptA或ΔpirR）不同，cpxS突变与更广泛的β-内酰胺耐药性相关。药敏试验证实，仅影响铁载体摄取的突变（ΔfptAΔpirR）并未改变其他抗假单胞菌β-内酰胺类药物（如亚胺培南-瑞来巴坦、头孢他啶-阿维巴坦、头孢洛扎-他唑巴坦、头孢吡肟或氨曲南）的MIC。而携带cpxSΔ86-98等位基因的突变体对其他几种药物的MIC有约2倍的轻度增加，但仍在敏感范围内。这表明，虽然临床鉴定出的FDC耐药机制足以在实验室菌株PA14中导致FDC不敏感，但对其他用于耐药铜绿假单胞菌感染的抗生素活性影响有限。
Pyoverdine产量对FDC敏感性的影响
除了通过铁载体摄取受体缺失导致的药物摄取减少外，pyoverdine（一种对三价铁具有极高亲和力的内源性铁载体）的产生也与铜绿假单胞菌的FDC耐药相关。研究表明，pyoverdine可以从FDC中螯合铁，从而阻止抗生素利用铁载体摄取受体。
为了确定pyoverdine在FDC不敏感突变体（如PA14ΔpirRΔfptAcpxSΔ86-98）中的作用程度，研究人员将这些突变引入到一个pyoverdine生物合成突变体（PA14ΔpvdA）的背景下。结果显示，在缺乏pyoverdine的情况下，上述三种FDC耐药机制的组合（ΔpirRΔfptAcpxSΔ86-98）不足以导致完全的不敏感（MIC = 1 µg/mL）。与能产生pyoverdine的背景相比，在ΔpvdA背景下构建的每个中间突变体（单突变或组合突变）的FDC MIC都降低了约8倍，且纸片抑菌圈直径显著增加。这支持了pyoverdine产生在FDC耐药中的作用。
FptA的缺失在pyoverdine生物合成突变体中造成适应度代价
先前研究表明，在缺乏pyoverdine生产的情况下，无法摄取铁载体吡啶螯铁素会严重破坏细菌的铁稳态，从而在铁限制培养基中造成适应度代价。为验证此点，研究人员在添加或不添加三价铁（100 µM FeCl3）的铁耗竭Mueller-Hinton肉汤（IDMH）中，测量了能产生pyoverdine和不能产生pyoverdine的突变株的生长动力学。
在能产生pyoverdine的菌株中，fptA的失活并不影响在IDMH中的细菌生长。然而，在ΔpvdA突变体（不能产生pyoverdine）中，fptA的缺失严重阻碍了细菌生长，在整个生长曲线中菌体密度（O.D. 600 nm）显著降低。不过，这种生长缺陷在补充铁后得到了完全恢复，证明了在缺乏pyoverdine生产和铁载体吡啶螯铁素摄取的情况下，铁饥饿阻碍了细菌生长。当在培养基中加入铁螯合剂EDDHA时，这种差异更为明显：pyoverdine的生产是在EDDHA补充培养基中生长所必需的；在低于0.5 mg/L的EDDHA浓度下，pyoverdine生物合成突变体的生长受到剂量依赖性抑制，而在此基础上失活fptA会进一步抑制生长。
基于这些发现，研究人员探究了在缺乏pyoverdine的背景下（PA14ΔpvdAΔpirR），FptA缺失是否仍是适应FDC耐药的主要机制。他们筛选了FDC纸片扩散试验48小时后出现的内环菌落，发现这些自发突变体均未表现出吡啶螯铁素产量下降。对其中一个随机选择的突变体进行全基因组测序，意外地发现其携带一个fptA移码突变，而没有其他与FDC耐药相关的已知突变。通过CAS测定法测量PA14ΔpvdAΔpirRΔfptA缺失突变体的吡啶螯铁素产量，证实了在缺乏pyoverdine的情况下，铁载体受体FptA的丢失并未下调吡啶螯铁素的生物合成，这可能是因为严重的铁饥饿反应。重要的是，尽管无法完全利用吡啶螯铁素可能导致了观察到的生长缺陷，但fptA移码突变体的出现表明，即使存在适应度代价，该外膜受体的失活仍然是FDC耐药的主要机制之一。
适应度代价驱动混合种群中fptA等位基因的频率
最后，研究人员假设，在缺乏pyoverdine的情况下，获得fptA突变可能会导致一个FDC敏感性降低但不稳定的亚群。如果没有FDC的选择压力来抵消适应度代价，这些突变将无法在种群中稳定维持。作为概念验证，他们将在存在或不存在pyoverdine生产的情况下，分别将等基因的fptA阳性株和fptA缺失株进行共培养并连续传代10天。
在能产生pyoverdine的共培养物中，FDC敏感性保持稳定，传代第1天和第10天之间的纸片抑菌圈直径没有显著变化。然而，在pyoverdine生物合成突变体的共培养物中，整个种群对FDC逐渐变得敏感，同时ΔfptA亚群逐渐减少，到实验结束时已无法观察到。qPCR分析验证了这一点，显示在pyoverdine缺失的培养物中，ΔfptA等位基因的频率在第一次和第十次传代之间显著降低了3个数量级；而在能产生pyoverdine的培养物中，ΔfptA等位基因保持稳定。这些结果表明，对于不产生pyoverdine的铜绿假单胞菌菌株，fptA突变的选择可能依赖于抗生素的持续选择压力，并且代表了一个FDC敏感性降低的不稳定亚群。
讨论
本研究利用实验室菌株PA14，揭示了导致FDC不敏感的逐步事件。研究发现，在Mueller-Hinton琼脂和铁耗竭肉汤培养基上，铁载体吡啶螯铁素受体FptA的功能丧失是导致敏感性降低的常见第一步。这与之前针对PAO1菌株的研究不同，后者发现儿茶酚铁载体受体piuA的失活是FDC耐药的第一步突变。在不同菌株中的观察表明，TonB依赖性受体的失活对FDC摄取的影响可能因铜绿假单胞菌菌株而异。这可能需要通过系统性的转录组学和蛋白质组学研究来确定是哪些生物学差异决定了哪些受体对FDC进入更为重要。
在PA14中，单一的fptA突变不足以赋予耐药表型，研究人员鉴定出多种与FptA缺失导致的摄取减少协同作用的第二步突变。其中包括cpxS调节子的上调、piuA编码的铁载体转运蛋白的失活，以及一个导致编码PBP1A的ponA基因表达增加的转座子插入突变。PBP1A水平的增加可能部分补偿了FDC对PBP3转肽酶活性的抑制。
尽管先前的研究已在FDC耐药的背景下发现了pirR、cpxS和fptA的突变，但这些突变通常与其他多种变化同时出现，使得辨别其具体贡献变得困难。本研究通过等位基因交换在实验室菌株背景中直接比较了这些突变单独和组合的影响。研究证实，FptA的缺失和CpxS的激活单独均能导致FDC MIC的改变，而两者结合足以赋予FDC不敏感表型。相反，PirR的缺失对FDC纸片直径或MIC的影响甚微。重要的是，PA14中由FDC暴露引起的突变与其他抗假单胞菌β-内酰胺抗生素（包括亚胺培南-瑞来巴坦、头孢他啶-阿维巴坦和头孢洛扎-他唑巴坦）的交叉耐药性有限。
有趣的是，通过cpxSΔ86-98突变导致的muxABC-opmB操纵子过表达，即使在缺乏pyoverdine的情况下（在PA14ΔpvdAcpxSΔ86-98和PA14ΔpvdAΔpirRΔfptAcpxSΔ86-98背景下）也能降低细菌对FDC的敏感性。这与之前的研究假设不同，后者认为cpxS突变以pyoverdine依赖的方式促进FDC耐药。在本研究使用的IDMH中，cpxSΔ86-98突变并未影响pyoverdine的产生，这表明药物外排增加可能是本研究中观察到的FDC敏感性降低的原因。
最后，研究人员评估了fptA缺失突变体在铁限制条件下以及缺乏pyoverdine生产的菌株中的适应性。结果表明，pyoverdine的产生可以减轻FptA缺失的影响，这可能是因为其提供了获取铁的替代途径。pyoverdine的产生与铁载体吡啶螯铁素摄取的丧失同时发生，可能协同作用，在种群中维持具有降低的FDC敏感性的克隆。确实，在pyoverdine生物合成突变体背景下，在没有FDC选择压力的情况下传代导致了fptA缺失等位基因频率的下降。尽管种群中fptA突变体频率较低，但最终种群表现出敏感的纸片扩散直径，这暗示了一种可能的机制，可以解释在无法产生pyoverdine（这在囊性纤维化患者中很常见）的铜绿假单胞菌菌株中，FDC异质性耐药的出现。
总之，本研究评估了FptA对实验室菌株PA14的FDC敏感性和适应性的主要贡献。研究发现，FptA的缺失，加上CpxS组氨酸激酶、TonB受体的第二步突变以及PBP1A表达的增加，共同导致了FDC活性的降低。在缺乏pyoverdine生产的情况下，fptA缺失菌株表现出适应度缺陷，这导致其在共培养实验中缺失等位基因频率下降。需要进一步的工作来探索FDC耐药相关的适应度代价与异质性耐药表型之间的关联。
