在酿造风味独特的酱香型白酒过程中，高温大曲扮演着至关重要的角色，它不仅是糖化剂，也是产香剂。大曲制备后期的温度可攀升至65℃左右，这一严酷环境使得大部分常规酵母菌种因耐热性不足而进入休眠或死亡状态，导致大曲中微生物多样性及丰度下降，进而可能影响最终的出酒率与品质。因此，从高温大曲中筛选、发掘能够耐受极端温度的嗜热酵母菌株，不仅有助于深入理解大曲这一特殊微生态系统中微生物的功能，更能为优化酿酒工艺、提升产品风味与产量提供潜在的优质微生物资源。针对这一需求，研究人员开展了一项从酱香型高温大曲中分离嗜热酵母并系统研究其耐受机制与安全性的工作，相关成果发表在《Antonie van Leeuwenhoek》期刊上。
为了开展这项研究，研究人员首先从贵州茅台镇某酱香型白酒生产企业的三个大曲车间采集了贮存1个月的高温大曲样品，混合后作为实验样本。采用可培养方法，通过在28℃至55℃多个温度梯度下的麦芽提取物琼脂(MEA)平板培养，从样本中初步筛选出33株酵母，并进一步通过55℃耐受性复筛得到一株耐热性最强的菌株，编号为L253。随后，研究人员通过菌落形态观察、显微镜检以及基于ITS序列的分子生物学鉴定，确定L253为Lodderomyces elongisporus。在此基础上，研究团队系统测定了L253菌株的生长曲线，并评估了其对温度(30-55℃)、pH值(3-8)、乙醇浓度(0-12% v/v)和葡萄糖浓度(10-80% w/v)的耐受性。为了评估其应用安全性，研究进行了包括小鼠毒性实验（灌胃酵母悬浮液并检测血清生化指标及体重变化）、硝酸还原酶活性测定、吲哚试验以及溶血试验在内的一系列安全评价。最后，为了从遗传层面解析其耐受性机理，研究人员对L253菌株进行了全基因组测序（结合二代Illumina NovaSeq和三代PacBio Revio平台），完成了基因组组装、注释，并利用NR、GO、KEGG、CAZy、DFVF等多个数据库进行了深入的生物信息学分析，重点关注与耐热、耐高渗等胁迫响应相关的基因和通路。
研究结果主要包含以下几个部分：
嗜热酵母的初步筛选与鉴定
研究人员从样品中初步筛选出33株酵母，通过在28℃至55℃下的培养进行复筛，最终分离得到一株能耐55℃高温的菌株L253。经形态学和分子生物学鉴定（ITS序列与Lodderomyces elongisporus CP128568同源性达100%），确认L253为Lodderomyces elongisporus。其单菌落呈乳白色、微凸、边缘清晰、质地粘稠，细胞呈椭圆形。
生物学表征
生长曲线测定 ：在45℃下，L253菌株的生长曲线显示其经历约4小时的适应期后，进入4至15小时的旺盛对数生长期，15小时后进入稳定期，38小时后进入衰亡期。
耐受性测定 ：温度耐受性实验表明，L253在40-50℃范围内生长良好，在45℃时达到最佳生长状态，在55℃下仍能生长但细胞密度较低。pH耐受性实验显示，该菌株在pH 3-8范围内均可正常生长，最适pH为5。乙醇耐受性实验表明，L253在乙醇浓度高达6.8% (v/v)时仍能正常生长，超过此浓度生长受到抑制。葡萄糖耐受性实验结果显示，L253在葡萄糖浓度10%至45%的培养基中生长旺盛，在浓度高达80% (w/v)的培养基中仍能维持生长，表现出极强的耐高渗能力。
安全性评估
酵母悬浮液灌喂对小鼠血清生化指标的影响 ：对实验组小鼠连续灌胃L253悬浮液14天后，其血清生化指标（血糖、谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白、总胆固醇、肌酐）均在正常参考范围内。与对照组相比，灌喂酵母的雄性小鼠血糖水平显著降低，所有处理组小鼠的ALT、胆固醇和肌酐水平均显著降低，表明该菌株可能对肝功能、脂质代谢和肾脏具有保护作用，但其对血糖的调节作用存在性别差异。
酵母悬浮液灌喂对小鼠体重的影响 ：与对照组相比，灌喂L253的实验组小鼠体重增重减缓，表明该酵母悬浮液可能具有调节体重增长的作用，且雄性小鼠的体重增重率始终高于雌性小鼠。
硝酸还原酶检测 ：L253菌株的硝酸还原酶活性为0.972 ± 0.391 U/g，活性较低，从食品安全角度看有利于减少发酵食品中亚硝酸盐的积累。
吲哚试验结果 ：试验结果为阴性，表明L253不能分解色氨酸产生有害代谢产物吲哚。
溶血试验结果 ：试验显示L253菌株呈γ-溶血（无溶血环），而大肠杆菌对照呈α-溶血，表明L253不产生溶血素，符合食品工业应用的安全标准。
菌株基因组基本特征
L253菌株的全基因组大小为16,118,111 bp，GC含量为37.3%，包含8条线性染色体。共预测到5,456个蛋白质编码基因。基因组序列已提交至NCBI数据库，登录号为PRJNA1185419。通过Circos软件绘制的基因组圈图显示了GC偏倚、GC含量、碳水化合物活性酶(CAZy)、真菌毒力因子(DFVF)以及正负链上编码序列(CDS)的真核生物直系同源群(KOG)分类等信息。
功能基因分析
NR和GO功能分类 ：NR数据库注释结果显示，93%的基因被注释为L. elongisporus。GO注释将4,170个基因簇分为三大功能域：生物过程（占38.45%）、分子功能（占24.44%）和细胞组分（占37.11%）。在分子功能类别中，与离子结合相关的基因占比较高（16.91%），这有助于细胞在极端环境下快速响应胁迫。在生物过程类别中，参与细胞氮化合物代谢和生物合成过程的基因显著富集，这为热休克蛋白(HSPs)的高效合成提供了必需的氨基酸底物和能量，从而增强了酵母细胞的整体热应激响应能力。
KEGG代谢通路分析 ：共有3,390个基因被注释到KEGG数据库的51条代谢通路中。富集基因数量最多的通路包括遗传信息处理、信号转导与细胞过程、代谢、碳水化合物代谢等。值得注意的是，KEGG数据库分析发现了热休克转录因子(HSF)、HSP70及其相互作用蛋白（HSPBP1, HSPA5/BiP）以及HSP90家族19个成员的显著富集。这表明L253的高温耐受性可能与由HSF介导的热响应通路有关，该通路通过调控HSPs及其辅伴侣蛋白的表达来增强耐受性和应激反应。此外，基因组中还鉴定出糖酵解(EMP)途径和三羧酸(TCA)循环的所有关键酶基因，以及两个编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的基因，后者是酒精发酵的基础。研究还发现与高渗透压甘油(HOG)通路相关的关键酶基因，如甘油-3-磷酸脱氢酶(gpd)和甘油-3-磷酸酶(gpp)，初步推测其在生物学表征中表现出的耐高渗能力可能与该通路有关。
DFVF数据库分析 ：在真菌毒力因子数据库(DFVF)的分析中，L253的基因匹配到738个条目，其中27个匹配准确度超过90%。这些基因包括小GTPase家族基因、14-3-3家族蛋白（可抑制细胞凋亡）以及一个匹配度超过90%的HOG家族丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因。该激酶参与渗透感应信号转导，通过调控靶基因转录来控制渗透压，并在胁迫下介导甘油和D-阿拉伯糖醇的产生。重要的是，分析未发现经典的霉菌毒素合成基因，结合安全性实验（无溶血活性、硝酸还原酶活性弱、吲哚试验阴性），表明该菌株无致病潜力。
本研究从酱香型高温大曲中分离得到一株耐热酵母Lodderomyces elongisporus L253，其最大生长温度可达55℃，最适生长温度为45℃，并具有广泛的pH耐受性（3-8）、6.8% (v/v)的乙醇耐受性以及80% (w/v)葡萄糖的高渗透压耐受性。全面的安全性评估证实其具有微弱的硝酸还原酶活性、呈γ-溶血（非溶血性）且吲哚试验阴性，符合工业应用的安全要求。全基因组测序与生物信息学分析揭示了其丰富的遗传背景。其耐热性可能与HSF-HSP（热休克因子-热休克蛋白）调控通路相关，该通路通过协调HSP90及其他HSP家族成员的作用来增强其高温适应能力。而其突出的耐高渗特性，则可能与HOG（高渗透压甘油）信号通路有关，该通路调控着gpd和gpp等关键酶的表达，以应对高糖或高盐环境。这些特性使得L253菌株能够适应大曲制作过程中温度和渗透压的剧烈变化，在高温、高渗的极端条件下保持代谢活性。该菌株的发现为嗜热酵母的研究与应用提供了重要的微生物资源，其基因组信息为深入解析其耐受性分子机制奠定了坚实基础，对理解和优化酱香型高温大曲的微生物功能、提升大曲及最终白酒产品的品质具有重要的理论意义与应用潜力。
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