糖尿病溃疡是糖尿病的一种严重且可能危及生命的慢性并发症[1]，[2]，[3]。它们在糖尿病足溃疡中尤为普遍，这些溃疡以难以愈合和易感染而闻名，常常导致坏疽形成[4]，[5]。这已成为临床非创伤性截肢的最常见原因[6]，[7]。许多研究表明，糖尿病伤口中存在过多的活性氧（ROS）是导致其难以愈合的重要原因[8]。在糖尿病患者中，高血糖水平会导致非酶促糖基化，在此过程中会释放大量ROS[9]，[10]。糖尿病伤口中的过量ROS不仅会诱导促炎因子的上调，从而在伤口部位引发强烈的炎症反应，并阻碍从炎症阶段向增生和重塑阶段的转变[8]，[11]，还会导致内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞的氧化损伤，从而阻碍血管新生、胶原沉积和上皮再生过程，使得糖尿病伤口的愈合变得困难[12]，[13]，[14]。同时，开放性伤口的慢性状态和高血糖微环境使它们极易受到细菌感染[15]。在严重情况下，这可能导致伤口愈合延迟以及截肢和死亡风险的增加。因此，消除ROS和预防细菌感染对于糖尿病溃疡的有效愈合至关重要[16]。
目前，抗生素、抗菌材料和光热抗菌剂已被用于抑制糖尿病伤口的细菌感染[17]。非甾体抗炎药和人工纳米酶也被用于伤口愈合过程中的ROS清除[18]，[19]。这些治疗干预措施取得了一定的效果，证实了抑制细菌或清除ROS确实可以加速糖尿病伤口的愈合过程。然而，随着研究的进展，人们提出了更精细的标准来根除细菌和清除ROS以促进伤口愈合。首先，皮肤上寄居着多种有益细菌，它们在伤口愈合中起着关键作用。据报道，其中一些共生细菌可以刺激免疫系统产生抗炎细胞因子，从而促进伤口愈合[20]。然而，传统的抗菌方法虽然在消除有害病原体方面有效，但也会无意中伤害皮肤表面的有益细菌，从而阻碍伤口愈合。其次，ROS包括多种类型，包括超氧阴离子（O– 2•）、羟基自由基（•OH）、过氧亚硝酸盐阴离子（ONOO−）、一氧化氮（NO•）、过氧化氢（H2O2）等[21]。上述ROS清除方法可能非特异性地清除所有ROS种类，这可能会破坏身体的氧化/抗氧化平衡[22]。
事实上，低浓度的O– 2•和H2O2是许多信号转导级联反应中的关键调节分子，参与调节诸如细胞凋亡、细胞增殖和分化等重要生物过程[23]，[24]。NO•在血管扩张中作为神经递质起着关键作用[25]。所有这些过程都对伤口修复有益。然而，与其他ROS相比，•OH和ONOO−表现出更强的反应活性，尤其是•OH，它被认为是最具活性的活性氧，可以与核酸、脂质和蛋白质无差别地反应[26]。•OH和ONOO−都具有高毒性，会导致组织损伤和伤口愈合受阻。因此，在对糖尿病溃疡治疗进行广泛研究后，提出了选择性抑制有害细菌和选择性清除•OH和ONOO−的新要求。然而，同时实现这两个“选择性”目标的研究尚未有报道，这既具有挑战性，也是一项开创性的工作。
根据文献报道，氢气（H2）能够选择性地清除•OH和ONOO−[8]，[22]。自2007年Ohsawa等人发现H2可以通过中和•OH来保护大脑免受缺血-再灌注损伤以来，H2已成为一种前沿的治疗气体。H2能够选择性地清除这两种高毒性的自由基•OH和ONOO−，从而保护细胞和组织免受氧化应激和炎症损伤。它被广泛认可具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用[27]。
为了确保自身的生存，某些益生菌能够通过代谢过程产生抗菌物质，如游离脂肪酸和细菌素。这些物质能有效抑制竞争细菌的生长，从而对有害细菌产生选择性杀菌作用[28]，[29]，[30]。最近，乳酸菌已被纳入水凝胶中用于治疗感染性皮肤伤口[28]。研究结果表明，负载乳酸菌的水凝胶成功抑制了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和沙门氏菌等病原菌。因此，它对感染了S. aureus的小鼠皮肤伤口表现出更好的愈合效果。
受此启发，我们关注了一种名为丁酸梭菌（C. butyricum）的益生菌，它能够在厌氧环境中高效产生氢气（H2）并抑制病原菌的生长，有可能同时实现上述两个“选择性”目标。因此，丁酸梭菌在糖尿病溃疡伤口愈合方面具有巨大潜力。然而，目前尚无相关报道。这主要是因为丁酸梭菌作为一种厌氧菌，在皮肤上外部应用时无法在正常氧环境中维持其生理活性，因此无法发挥其产氢和抗菌作用。
为了解决这个问题，我们提出构建一种新型水凝胶，称为厌氧水凝胶，其内部提供无氧环境。这种厌氧水凝胶将作为丁酸梭菌的载体，以满足其厌氧生长需求（在方案1中简称为C. butyricum>@Anaerobic-Gel）。选择从香草豆中提取的天然醛类化合物香草醛（Van）作为耗氧底物，因为它具有优异的生物相容性、良好的溶解性、明显的反应颜色和高度可控的反应性[31]，[32]。值得注意的是，漆酶和香草醛已被用于构建厌氧水凝胶，作为脂肪来源的间充质干细胞的载体，以实现干细胞的靶向输送和在体内的保留[33]。在本研究中，Van与醛修饰的海藻酸盐（ALG-CHO）结合。然后将Van-ALG-CHO与含有丁酸梭菌、漆酶和羧甲基壳聚糖（CMCS）的溶液混合。通过醛（–CHO）和氨基（–NH2）基团之间的席夫碱反应，Van-ALG-CHO和CMCS交联形成所需的水凝胶。因此，丁酸梭菌和漆酶都被封装在这个水凝胶系统中，成功构建了C. butyricum>@Anaerobic-Gel（方案1A）。在这个系统中，Van与漆酶发生氧化还原反应，有效消耗水凝胶基质中的溶解氧，从而在其内部创建一个厌氧微环境（方案1A）。即使在正常氧条件的皮肤上局部应用，封装在其中的丁酸梭菌仍保持厌氧状态，同时维持其产氢和抗菌作用。因此，C. butyricum>@Anaerobic-Gel满足了“选择性抑制细菌和选择性清除ROS”的两个要求，显示出在糖尿病伤口愈合应用中的巨大潜力（方案1B）。本研究有望解决丁酸梭菌在皮肤表面正常氧环境中局部应用的瓶颈问题，通过建立一个适合维持厌氧微环境的平台。这不仅为未来丁酸梭菌在糖尿病溃疡治疗中的应用铺平了道路，也为其他厌氧益生菌在正常氧环境中的应用提供了参考。
