Mariana Liessa Rovis Sanches | Cintia Kazuko Tokuhara | Flávia Amadeu de Oliveira | Talita Ventura | Adriano de Souza Pessoa | Flávia Godoy Iano | Mariana Rodrigues Santesso | Emanuelle Pangoni de Carvalho | Larissa Tercília Grizzo Thomassian | Marília Rabelo Buzalaf | Rodrigo Cardoso de Oliveira
巴西圣保罗大学Bauru牙科学院生物科学系
摘要
骨稳态受到脂肪组织的强烈影响，因为这两种细胞类型共同存在于骨髓中，并通过可溶性介质进行交流。这种相互作用可能导致骨生成与脂肪生成之间的失衡，从而促进脂肪生成，进而引发骨质疏松症等病症，而这些病症通常与骨髓脂肪增多有关。在本研究中，我们探讨了脂肪细胞条件培养基（CM）对成骨细胞的影响。尽管CM没有表现出细胞毒性，甚至提高了细胞活力，但它显著抑制了成骨细胞的功能。经过CM处理的细胞缺乏钙沉积，并且碱性磷酸酶（ALP）活性显著降低，表明分化过程受阻。蛋白质组学分析显示，关键的细胞外基质蛋白（如纤维连接蛋白、asporin和periostin）的表达下调，而这些蛋白对基质组织和矿化至关重要。相反，与炎症和氧化应激相关的蛋白（如GAPDH、vimentin和酸性60S核糖体蛋白）表达上调。STRING网络分析发现，相关蛋白簇主要涉及应激反应、蛋白质折叠和细胞骨架重塑，而与基质相关的蛋白则出现片段化且表达不足。长期暴露于CM会进一步富集核糖体和翻译相关蛋白，表明细胞趋向于适应应激状态而非基质生成。血红蛋白的过表达和组蛋白异构体的减少表明NF-κB激活、氧化应激以及不良的表观遗传变化。总体而言，这些发现表明脂肪细胞分泌的因子会创造一个不利于成骨细胞分化的微环境，表现为矿化受损、炎症信号传导异常、氧化应激以及细胞骨架和表观遗传功能障碍。这些发现为在病理条件下恢复骨生成提供了潜在的分子靶点。
引言
骨骼结构通过不同类型细胞的协调活动不断重塑：成骨细胞负责合成主要由I型胶原蛋白、糖蛋白和蛋白聚糖组成的有机基质；破骨细胞是参与骨骼吸收和重塑的多核细胞；而成骨细胞则是维持基质完整性的关键成熟细胞[1]。骨骼重塑的调控非常复杂，涉及细胞间的相互作用以及局部和系统因素[2]。调控介质包括激素、信号分子、细胞因子和脂质介质[3][4][5]。
成骨细胞的分化始于前体细胞在特定因子作用下的成骨定向[6][7]。前成骨细胞向成骨细胞的转变由转录因子RUNX2（Runt相关转录因子2）调控，该因子在整个分化过程中保持活性[8][9]。在成熟过程中，成骨细胞逐渐增加碱性磷酸酶（ALP）等蛋白的产量[10]，从而导致骨钙素表达和细胞外基质矿化——这些都是成骨细胞表型的关键特征[11]。
尽管骨组织和脂肪组织（AT）具有不同的生理功能，但在骨生成过程中它们之间存在显著相互作用。目前已识别出几种类型的脂肪细胞：白色脂肪细胞（WAT），主要作为能量储存库；棕色脂肪细胞（BAT），专门进行脂质氧化以产生热量，并具有解偶联蛋白-1（UCP-1）合成和在低温下增加葡萄糖摄取的能力[12]；以及最近发现的米色脂肪细胞（BeAT），它们通过“褐变”过程从WAT衍生而来，获得了类似BAT的功能特性，包括产热能力[13]。
成骨细胞和脂肪细胞都起源于骨髓中的共同间充质前体细胞，这表明骨生成和脂肪生成分化之间存在相互关系。研究表明，在某些条件下，成骨细胞可以逆向分化为脂肪细胞，导致骨生成与脂肪生成失衡，进而引发骨质疏松症等病症，这些病症常与骨髓脂肪增多有关[14]。骨髓腔内的脂肪堆积可能是由于间充质干细胞（MSCs）优先分化为脂肪细胞所致，尽管具体机制尚不明确。骨质疏松症中的脂肪生成增加可能通过影响MSCs或直接作用于成熟成骨细胞来限制成骨细胞的生成[15]。
有证据表明脂肪细胞是分泌细胞，能够产生瘦素和脂联素等激素以及脂肪酸，这些物质可以影响邻近细胞（如成骨细胞）的增殖、功能和凋亡[16]。因此，骨组织和脂肪组织之间的相互作用非常复杂，需要进一步研究。上述关系仅揭示了这两种细胞类型相互作用的部分机制。理解这些相互作用可能为治疗骨骼和代谢性疾病（包括骨关节炎和骨质疏松症）提供重要线索[17][18]。
本研究深入探讨了在骨组织和脂肪细胞失衡情况下调节成骨细胞分化的分子机制，表明脂肪细胞分泌的可溶性因子会对骨矿化和关键成骨蛋白的表达产生负面影响。
来自MC3T3-E1细胞系（CRL2593，亚克隆4，ATCC®）的小鼠前成骨细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的基础α-MEM培养基（Minimum Essential Medium Eagle - Alpha Modification）中培养，培养温度为37°C，培养箱内CO2浓度为5%（Bighetti等人，2019年）。培养基每3天更换一次。当细胞达到亚融合状态时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化处理，然后进行接种。
为了评估处理对细胞活力的影响，将MC3T3-E1细胞暴露于不同处理条件下，并在24小时、48小时和72小时时使用MTT测定法进行评估。实验重复三次（n = 5）。在24小时时（图2A），9天和12天条件培养基（9d CM和12d CM）处理组的细胞活力显著高于对照组。在48小时时（图2B），除FM组外，所有处理组的细胞活力均显著增加。
成骨细胞和脂肪细胞之间的相互作用对维持骨稳态至关重要，因为这两种细胞类型在骨髓中共享相同的微环境，并通过分泌因子相互调节。这种交流的失衡与骨骼脆弱性和骨质疏松症等病症密切相关，在这些病症中，骨髓脂肪增多伴随着骨形成减少[25][26]。已知脂肪细胞会释放多种生物活性物质
本研究结果表明，在我们的实验条件下，即使存在成骨刺激，脂肪细胞条件培养基（CM）也会抑制成骨细胞的分化。尽管细胞活力保持不变甚至在某些情况下有所提高，但CM处理会导致碱性磷酸酶活性降低、矿化基质沉积减少，以及关键细胞外基质和成骨蛋白（包括纤维连接蛋白）的表达下降。
Adriano Pessoa：撰写初稿、数据可视化、监督、概念构思。
Talita Ventura：撰写初稿、数据可视化、软件应用、数据分析。
Mariana Santesso：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、实验实施。
Flávia Iano：撰写初稿、监督、方法学设计、实验实施。
Larissa Thomassian：撰写初稿、结果验证、数据分析、数据整理。
Emanuelle Carvalho：撰写初稿、方法学设计。
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
本研究得到了高级人才发展协调计划（CAPES）（项目编号88882.182718/2018-01）对MLRS的支持，以及圣保罗研究基金会（FAPESP）（项目编号2021/13697-6）对RCO的支持，还有国家科学技术发展委员会（CNPq）（项目编号318897/2021-8）对RCO的支持。
我们感谢圣保罗州立大学（UNESP）Botucatu医学院内科系的Célina Regina Nogueira博士和Miriane de Oliveira博士捐赠的3T3-L1细胞。
