张倩倩|陈洁英|张颖|王颖欣|李佳琪|潘雅娜|张增|杨宏杰|何彦明|周萍
中国复旦大学高分子科学系，聚合物分子工程国家重点实验室，上海，200433
摘要
肠道微生物群、氧化应激与肠道屏障完整性之间的相互作用日益被认为是2型糖尿病发病机制的关键驱动因素。本研究聚焦于从灵芝中提取的一种新型蛋白多糖FYGL，评估其肠道安全性及其对肠道微生物群的调节作用，并探讨这些效应与其降糖机制之间的关联。体外实验表明，FYGL具有优异的生物相容性，可通过调节MAPK/NF-κB/Nrf2信号通路减轻H₂O₂诱导的肠上皮细胞（IEC-6）的氧化损伤和细胞凋亡。此外，它还能增加紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin-1）的表达，从而增强肠道屏障的完整性。体内实验中，FYGL有效改善了与糖脂和抗氧化指标相关的肠道微生物群失衡，同时维持了db/db糖尿病小鼠的代谢稳态。这些发现表明，FYGL既能被肠上皮细胞吸收，又能通过肠道微生物群的发酵作用作为潜在的益生元，从而缓解糖尿病相关的肠道功能障碍。这些双重作用为其在改善糖尿病及其并发症方面的多靶点机制提供了重要证据。
引言
糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，已成为21世纪增长最快的全球健康挑战之一[1]。2型糖尿病（T2DM）以胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能障碍为特征，占全球糖尿病病例的90%以上，是最常见的糖尿病类型。其发病机制涉及多种代谢异常的相互作用，如高血糖、血脂异常、炎症因子、过多的胰岛淀粉样多肽（IAPP）产生以及肠道微生物群的变化。所有这些因素通过炎症、内质网应激（ERS）和氧化应激等共同途径协同作用，加剧胰岛素抵抗和β细胞功能障碍[2]。其中，肠道已成为开发T2DM新型诊断和预后生物标志物的关键靶点。对大规模人类队列（n > 34,000人）的肠道微生物群分析显示，其组成与饮食模式和心血管健康相关，并能预测血糖、血脂水平和炎症标志物等关键健康指标。荟萃分析表明，健康个体的有益微生物数量显著较多，其中与T2DM的关联最为显著[3]。此外，肠道菌群失衡引起的过量脂多糖（LPS）和高血糖会引发炎症和氧化应激，这些病理过程进一步损害肠道屏障，导致通透性增加（即“肠漏”），这是T2DM的典型特征[4],[5]。通透性的增加又促进了肠道微生物群及其代谢产物进入血液[6]。因此，肠道微生物群失衡、氧化应激和肠道屏障损伤之间的恶性循环共同推动了糖尿病及其并发症的发展[7],[8]。
尽管目前的抗糖尿病药物能够降低血糖并调节肠道微生物群，但由于存在肝脏和肾脏毒性等风险，其长期安全性仍值得关注[9]。这凸显了迫切需要新的治疗方法。天然大分子，尤其是特定的膳食多糖和蛋白多糖，具有良好的安全性，并能多靶点调节代谢，使其成为有前景的治疗选择[10]。由于人体内缺乏碳水化合物活性酶（CAZymes），大多数多糖或蛋白多糖难以被胃肠道消化[11]。此外，它们的大分子尺寸和亲水性使得它们难以穿过细胞膜的磷脂双层，导致肠道吸收率较低[12]。然而，它们的核心优势在于能够到达远端结肠，并被厌氧微生物群发酵产生短链脂肪酸（SCFAs）[13]。通过促进组蛋白乙酰化和激活G蛋白偶联受体，这些SCFAs可共同增强肠道屏障完整性，减轻炎症反应和氧化应激，促进肠道微生态平衡[14]。粪便微生物群移植（FMT）研究的结果也表明，肠道微生物群失衡在T2DM发病机制中起关键作用，膳食纤维通过调节微生物群进一步改善了血糖稳定性[15],[16],[17]。然而，现有研究主要集中在单一多糖上，而结构复杂的蛋白多糖（尤其是那些具有特定蛋白质与碳水化合物比例的蛋白多糖）仍缺乏探索。
我们团队从灵芝的水提取物中筛选出一种新型水溶性蛋白多糖Fudan-Yueyang-灵芝（FYGL），其分子量为2.6 × 105。它作为胰岛素信号通路中的负调控蛋白蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）的抑制剂[18]。FYGL的蛋白质部分和多糖部分通过丝氨酸和苏氨酸残基的O-糖苷键以17:77的比例连接（图1）。实证研究表明，FYGL可通过两种主要机制改善糖尿病及其并发症：保护胰腺组织以促进胰岛素分泌，以及选择性抑制PTP1B以减轻胰岛素抵抗[19],[20],[21]。小鼠口服FYGL后，这种两亲性物质主要分布在小肠中，分布顺序为：小肠 > 大肠 > 胃[21]。这表明FYGL可能不会在胃肠道中被完全消化，而可能被肠道吸收或被肠道微生物群发酵。目前，尚需研究FYGL对糖尿病患者的胃肠道安全性和肠道微生物群组成的影响。鉴于氧化应激在糖尿病性肠道屏障损伤和肠道微生物群失衡中的关键作用，本研究旨在阐明FYGL通过缓解氧化应激引起的肠道屏障损伤、调节肠道微生物群和宿主代谢来发挥降糖作用的潜在机制。为此，我们使用了H₂O₂诱导的IEC-6细胞模型来模拟糖尿病性肠道氧化应激环境，评估FYGL的细胞吸收特性及其对肠道屏障功能的影响。同时，还利用db/db小鼠模型研究FYGL对肠道微生物群组成和SCFAs代谢的调节作用。这些多层次的研究将为FYGL的降糖机制提供基础见解，并支持其作为糖尿病管理的功能性成分或治疗策略的应用。
材料
根据我们之前的研究[18]，从灵芝中提取、分离并纯化了蛋白多糖FYGL。IEC-6细胞购自北京协和医学院细胞资源中心。Dulbecco改良的 eagle培养基（DMEM，高糖）和胎牛血清（FBS）购自Gibco。胰岛素购自江苏福sun万邦制药集团有限公司。1,1′,3,3′-四乙基-5,5′,6,6′-四氯碘化氰胺（JC-1）和一氧化氮检测试剂盒亦来自同公司。
FYGL在IEC-6细胞中的摄取与安全性
为研究FYGL在肠道中的摄取情况，将FITC-FYGL与IEC-6细胞共培养6小时。激光扫描共聚焦显微镜显示FITC-FYGL在IEC-6细胞内的定位非常清晰（图2A）。流式细胞术分析表明，IEC-6细胞对FITC-FYGL的摄取具有浓度依赖性（图2B）。CCK-8检测用于评估FYGL对细胞的安全性。结果显示，浓度为50–200 μg/mL的FYGL
结论
在H₂O₂诱导的IEC-6细胞模型中，FYGL被细胞内化后能够增强SOD活性，有效清除ROS和NO，降低MDA水平，从而缓解线粒体膜电位的下降。FYGL通过调节MAPK/NF-κB/Nrf2信号通路发挥保护作用，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，并上调紧密连接蛋白（ZO-1）的表达，
CRediT作者贡献声明
张倩倩：撰写——原始稿件、软件开发、方法学设计、实验实施、数据整理。陈洁英：数据验证、方法学设计。张颖：数据验证、方法学设计。王颖欣：数据验证、方法学设计。李佳琪：数据验证、方法学设计。潘雅娜：数据验证、方法学设计、实验实施、数据整理。张增：资源提供、方法学设计。杨宏杰：资源提供。何彦明：资金筹集、概念构思。周萍：撰写——审稿与编辑、资源协调、资金管理
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号21374022和81374032）、国家卫生健康委员会（编号2017ZX09301006）、上海市科学技术委员会（编号17401902700）、上海市临床医学研究中心（编号SHDC12019124）以及上海中药制剂产业转化协同创新中心的支持。
