**摘要**
本研究对一种新发现的Vancleaveus属物种进行了综合分类学分析，该物种首次被发现寄生于巴西帕拉州Xingú河流域的Doras higuchii（Siluriformes，Doradidae）鱼的鳃中。Vancleaveus perditus n. sp.与其他同属物种的区别在于：其阴道孔位于左侧，腹侧杆具有前内侧突起，背侧杆具有后内侧突起，且MCO（交配器官）呈轻微的S形，末端呈舌状。研究人员为该物种生成了新的28S rDNA片段序列。通过系统发育分析发现，这一新物种与Vancleaveus januacaensis Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986（该属的模式种）共同构成一个单系群。此外，这项研究还描述了第六种Vancleaveus物种。
**引言**
Doradidae（Siluriformes），俗称“会说话的鲶鱼”或“cuiú-cuiú”、“bacus”，是一类分布于南美洲淡水地区的鲶鱼，主要栖息在亚马逊河下游支流中。它们多生活在湖泊和河流的底部区域，部分物种也存在于开阔水域、洪泛区、水流缓慢的区域或河流边缘（Sabaj & Arce, 2021）。这类鱼的特点是身体两侧具有一排中部的骨质鳞片，这些鳞片上长有向后的尖刺用于防御（Birindelli, 2014）。该科包含33个属，共计96个有效物种（Sabaj & Arce, 2021），其中约75%分布在该区域的亚马逊河流域（Dagosta & De Pinna, 2019），其中15种已被记录在Xingú河中（Soares et al., 2018）。其中，Doras higuchii Sabaj & Birindelli广泛分布于亚马逊河下游的支流中（Trombetas河和Jari河），是目前在Xingú河中发现的唯一Vancleaveus属物种（Sabaj Pérez & Birindelli, 2008）。
目前已知有29种属于Monopisthocotyla类的寄生虫寄生于Doradidae鱼类中，这些寄生虫分为4个属：Cosmetocleithrum Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986（24种）、Pavanelliella Kritsky & Boeger, 1998（1种）、Unibarra Suriano & Incorvaia, 1995（1种）以及Vancleaveus Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986（3种）（表1）。在Xingú河中已记录到5种Monopisthocotyla寄生虫：Cosmetocleithrum phryctophallus Soares, Santos-Neto & Domingues, 2018和C. bifurcum Mendoza-Franco, Mendoza-Palmero & Scholz, 2016寄生于Hassar orestis（Steindachner）；C. leandroi Soares, Santos-Neto & Domingues, 2019寄生于Hassar gabiru Birindelli, Fayal & Wosiacki；C. akuanduba Soares, Santos-Neto & Domingues, 2019同时寄生于H. orestis和H. gabiru；Vancleaveus klasseni Soares, Santos-Neto & Domingues, 2019也寄生于H. orestis和H. gabiru（Soares et al., 2018）。然而，关于Doras higuchii上的Monopisthocotyla多样性信息仍较为缺乏。
**材料与方法**
**宿主采集**
2015年2月和10月，研究人员使用刺网从以下地点采集了25件Doras higuchii标本：巴西帕拉州Altamira市的Xingú河Gorgulho da Rita（03°21′15.7″S，52°11′47.5″W）和Bacajá河（03°33′47.1″S，51°36′50.3″W）。
**寄生虫学操作**
采集后的鳃弓被取出并放入装有加热水（约65°C）的标记试管中。每个试管剧烈摇晃后，将沉淀物和鳃固定在5%甲醛溶液中用于形态学研究，或固定在96%乙醇溶液中用于分子特征分析。在实验室中，使用立体显微镜（LEICA S6D，Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）观察每个试管的内容物；用解剖针将寄生虫从鳃或沉淀物中取出并送进行分析。用于研究内部结构的标本用Gomori三色染色法（Humason, 1979; Boeger & Vianna, 2006）染色，并用Dammar胶固定。对于骨化结构的观察，标本用Hoyer’s或Gray & Wess培养基（Humason, 1979; Boeger & Vianna, 2006）进行固定。所有测量均按照Mizelle & Klucka (1953)的方法进行，并使用Leica LAS Interactive Measurement软件记录数据。器官和其他结构的尺寸表示为腹视方向的最大值；弯曲或折弯结构的长度为两端之间的直线距离；雄性交配器官（MCO）的总长度使用ImageJ软件（Rasband, 2022）的手动工具测量。钩子的分类依据Mizelle & Price (1963)的方法。平均值后括号内注明测量样本的数量（n）。初步插图使用带有差分干涉对比和相位对比光学的显微镜（LEICA DM 2500，Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）和铅笔绘制；最终插图和图版使用Affinity Designer 2.6.5版本制作。分类学部分中平面形状和轮廓的术语遵循Stearn (1985)的标准。新分类单元的作者归属按照《国际动物命名法规》第50.1条（作者身份）的规定确定。患病率和平均强度的定义依据Bush et al. (1997)的方法。
**DNA提取、扩增和测序**
用于分子分析的Monopisthocotyla标本按Soares et al. (2023)的方法进行基因组DNA提取。使用Qiagen公司的QIAamp DNA Micro Kit（美国）按制造商的方案提取基因组DNA，最终体积为30 μl。使用NanoDrop One光谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）检测DNA浓度。使用引物对U178和L1642（Lockyer et al., 2003）进行28S rDNA大核糖体亚基（LSU）基因的基因组扩增。PCR反应按照Soares et al. (2023)的方法进行，使用Eppendorf公司的Mastercycler nexus（德国汉堡）仪器，反应体积为25 μl，并加入DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）（Thermo Scientific Wilmington，美国）。反应中每种引物使用量为0.1 mM，提取的DNA量为3 μl（约100 ng）。PCR程序设置为：初始变性95°C 3分钟，随后是34个循环：94°C 30秒、56°C 30秒、72°C 90秒，最后72°C延伸4分钟（Soares et al., 2023）。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶（TAE缓冲液：40 mM Tris、20 mM醋酸、1 mM EDTA）中进行电泳，染色使用SYBRsafe（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）和1 kb Plus DNA Ladder（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州），电泳条件为100 V 30分钟。PCR产物使用QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen，美国）纯化，然后使用Applied Biosystems™公司的BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 Kit（ABI 3730自动测序仪，OMIKKA公司，巴西圣保罗州）进行测序，所用引物包括用于扩增28S rDNA的引物以及额外的900F和1200R引物（Littlewood & Olson, 2001）。
**系统发育分析与比对**
生成的contigs使用Sequencher v.4.1.4（Gene Codes，密歇根州安娜堡）编辑后提交到BLAST数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）与其他Monopisthocotyla序列进行比对。从GenBank中检索了47条属于Dactylogyridae的序列（Geer et al., 2010），以及四条属于Diplectanidae（Murraytrema pricei Bychowsky & Nagibina, 1977、Pseudorhabdosynochus lantauensis (Beverley-Burton & Suriano, 1981)和Pseudorhabdosynochus epinepheli (Yamaguti, 1938)）和Pseudomurraytrematidae（Pseudomurraytrema sp.）的序列（作为外群），并与新获得的D. higuchii的Vancleaveus序列进行比对。比对使用Geneious版本7.1.3中的MUSCLE默认参数生成（Kearse et al., 2012）。比对结果经过修剪，长度约为945 bp。系统发育重建采用最大似然（ML）和贝叶斯推断（BI）方法进行。ML分析使用PhyML v3.0（Guindon et al., 2010）在ATGC–Montpellier网络平台上进行，节点支持度通过1000次自助法（B）复制估算。核苷酸替换模型（GTR + R）基于JModelTest v2.1.1中的Akaike信息准则（Aikaike Information Criterion, 1997）选择（Darriba et al., 2012）。BI分析使用MrBayes v3.2.6（Ronquist et al., 2012）进行，采用混合替换模型（lset nst = mixed），并考虑了位点之间的不变率和伽马分布的变异率（rates = invgamma）。后验概率（PP）基于5 × 10^5代的数据进行推断，每次运行包含四个独立的马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）过程。贝叶斯分析的收敛性通过平均标准偏差低于0.001来确认，有效样本量（ESS）值超过200，符合Tracer v1.7（Rambaut et al., 2018）的评估标准。树状图间隔1000代生成，收敛诊断通过Tracer v1.7进行评估。初始的25000代数据被舍弃以优化后验分布的统计结果。遗传分歧使用MEGA v7（Kumar et al., 2016）中的p-distance模型矩阵确定。树状图使用Figtree 1.3.1（Rambaut, 2012）可视化，图表使用CorelDraw 2019制作。
**结果**
共分析了25件Doras higuchii标本，其中13件（52%）的鳃被Monopisthocotyla寄生。以下提供了基于28S rDNA基因的形态学、形态测量和遗传数据，支持将这一新物种归入Vancleaveus属的提议。
**分类学部分**
**Monopisthocotyla** Brabec, Salomaki, Kolisko, Scholz & Kuchta, 2023
**目：** Dactylogyridea Bychoswhy, 1937
**科：** Dactylogyridae Bychoswhy, 1933
**属：** Vancleaveus Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986
**鉴别特征**
Vancleaveus属物种的特征包括：无眼睛；两个肠盲肠在后部与生殖腺相连且无分支；生殖腺重叠，睾丸位于生殖腺的背部；交配器官由雄性交配器官（MCO）和辅助结构组成，两者不相连；MCO骨化、呈管状、J形或轻微S形；阴道单个；阴道孔位于右侧或左侧，且骨化；存在腹侧和背侧锚结构；腹侧杆具有前内侧突起或无突起，背侧杆具有后内侧突起或无突起；钩子（10个腹侧，4个背侧），钩柄膨胀。
**新物种Vancleaveus perditus** Souza, Soares & Domingues n. sp.（图1）：
a. 全身（合成图，腹视图）；
b. 交配器官；
c. 第II-IV、VI和VII钩；
d. 第I钩；
e. 第V钩；
f. 腹侧杆；
g. 背侧杆；
h. 腹侧锚；
i. 背侧锚。图例比例尺：a：50 μm；b：25 μm；c–i：30 μm
宿主类型：Doras higuchii Sábaj Pérez & Birindelli（Doradidae科）。
模式产地：巴西帕拉州阿尔塔米拉市Xingú河的Gorgulho da Rita（03°21′15.7″S 52°11′47.5″W）。
其他产地：巴西帕拉州阿尔塔米拉市Xingú河的Ilha grande（03°35′50.2″S 52°21′22.5″W）；巴西帕拉州阿尔塔米拉市Bacajá河（03°33′47.1″S 51°36′50.3″W）。
感染部位：鳃丝。
感染率：在检查的25个宿主中，有52%被感染。
平均感染强度：每个宿主21个寄生虫。
平均丰度：0.5个。
存档的标本：正模标本（CHIOC编号41038a）；13个副模标本（CHIOC编号41038b–f、41039、41040a–g）；1个凭证标本（CHIOC编号41041）；1个全基因组片段（ZUEC PLA编号337）。
动物银行生命科学标识符：C6963939-4A08-4376-AF17-2A1D2528DFCCM
分子序列数据：28S rDNA基因的1380 bp部分序列（登录号：PZ237731）。
词源：种名“perditus”（拉丁语意为“丢失”或“破坏”）指的是标本采集的地点，由于巴西Xingú河上Belo Monte大坝的建设，该地点已不复存在。该名称突出了这种寄生虫原始自然环境的丧失。
描述：
基于15个标本进行研究，其中10个用Gomori三色染色，5个用Hoyer培养基制成玻片。体型细长，呈纺锤形，长度为269（168–410；n = 14），不包括吸盘部分，宽度为84（49–140；n = 14），位于生殖腺水平（图1a）；外皮光滑。头部结构不发达，头部裂片不明显；具有3至4对头部器官；头部腺体为单细胞结构，位于咽部后方两侧。存在球形色素颗粒。口位于近端腹侧；咽部肌肉发达，直径为23（30–14；n = 12）；食道较短。生殖孔位于中腹侧，位于交配结构前方。生殖腔未硬化。未观察到前列腺储囊、输卵管、Mehlis腺、子宫和卵。雄性交配器官呈轻微S形，长度为26（20–38；n = 8）；基部有硬化盖，末端逐渐变细，呈舌状（图1b）。辅助结构的棒状部分末端有沟槽（图1b）。睾丸呈卵圆形，长度为37（33–41；n = 3），宽度为17（17–18；n = 3）；输精管环绕左侧肠盲囊；精囊盘旋，近端呈卵圆形，中间部分有下降和上升的环状结构，远端呈宽椭圆形。阴道孔位于左侧腹侧；阴道前庭未硬化，呈郁金香状；阴道管肌肉发达，较短，略呈S形；精液接受器的形状为横椭圆形。生殖腺狭长，长度为63（38–84；n = 5），宽度为34（21–53；n = 5）。卵黄腺密集，从食道延伸至肠盲囊汇合处。吸盘呈六边形，长度为69（43–122；n = 13），宽度为71（48–115；n = 13）。吸盘的锚状结构形状和大小各异：腹侧锚状结构具有发达的表层根，中部宽阔，末端凹陷并有纵向沟槽；深根较短，末端圆润；柄部细长，轴部略微弯曲；弯曲的尖端延伸至表层根的末端，基部宽度分别为16（20–13；n = 7）、内部43（35–48；n = 7）、外部40（33–44；n = 7）（图1h）。背侧锚状结构具有发达的表层根，基部呈亚三角形；深根较短，末端圆润；柄部细长，轴部略微弯曲；弯曲的尖端延伸超过表层根的末端，基部宽度分别为11（8–13；n = 6）、内部34（28.5–42；n = 6）、外部34（28–45；n = 7）（图1i）。腹侧杆状结构长度为54（34–68；n = 7），宽度为18（11–23；n = 7），前端具有亚三角形突起，末端部分膨胀（图1f）。背侧杆状结构长度为55（31–66.5；n = 7），宽度为13（10–18；n = 6），呈开放“V”形，具有后内侧突起，末端略微渐细，向后弯曲（图1g）。不同钩对的形态相似，柄部近端膨胀，拇指部分凹陷，柄部略微弯曲，尖端细小，钩丝纤细，延伸至柄部膨胀的边缘。钩对I的长度为30（26–34；n = 7）（图1c）；钩对II–IV、VI、VII的长度为32（26–38；n = 35）（图1d）；钩对V的长度为12（10–16；n = 7）（图1e）。
Vancleaveus perditus n. sp. 与其他同属物种的区别在于其独特的特征组合：首先，其阴道孔位于左侧，而V. klasseni的阴道孔也位于左侧，但V. cicinnus、V. fungulus、V. janauacaensis 和 V. platyrhynchi 的阴道孔位于右侧（Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986；Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986；Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986；Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986）。其次，V. perditus n. sp. 的腹侧杆状结构缺乏后内侧突起，这一特征仅存在于V. janauacaensis 中。然而，新物种具有前内侧突起，这一特征存在于V. cicinnus、V. fungulus、V. platyrhynchi 和 V. klasseni 中，但不存在于V. janauacaensis 中。再次，V. perditus n. sp. 的背侧杆状结构没有前内侧突起，这一特征存在于V. cicinnus、V. fungulus 和 V. janauacaensis 中，但不存在于V. klasseni 和 V. platyrhynchi 中。此外，新物种的背侧杆状结构具有后内侧突起，而其他所有物种均没有此特征。最后，V. perditus n. sp. 的 Meals of cycle（MCO）呈轻微S形，而V. cicinnus、V. fungulus 和 V. platyrhynchi 的MCO呈J形，V. janauacaensis 和 V. klasseni 的MCO呈卷曲状。新物种是首次在新热带地区描述的Vancleaveus属物种。
分子数据和系统发育推断：获得了Vancleaveus perditus n. sp. 的1380 bp长的28S rDNA基因部分序列。基于部分28S rDNA序列的最大似然法和贝叶斯分析得出了相似的系统树拓扑结构（图2）。大多数分支都具有显著的统计支持（图2）。Doradidae科的单吸盘类物种分为两个不同的分支：分支A具有较高的支持值（B = 93，PP = 1），其中Vancleaveus perditus n. sp. 和 V. janauacaensis 被归为一组，支持值中等（B = 0.95；PP = 51）。这一分支与Ameloblastella属物种关系密切，后者属于Pimelodidae科和Heptapteridae科，支持值中等（B = 72，PP = 0.93）。分支B进一步分为两个子分支（B1和B2），两者都具有较高的支持值（B = 100，PP = 1）。分支B1由Doradidae科的Cosmetocleithrum属物种组成（C. gussevi Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986；C. gigas Morey, Cachique & Babilonia, 2019；C. trachydorasi (Acosta et al., 2017；C. rarum Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986）以及Auchenipteridae科的物种组成（C. laciniatum Yamada et al., 2017；C. baculum Yamada, Yamada & Silva, 2020）。分支B2由仅寄生Doradidae科的Cosmetocleithrum属物种组成（C. bulbocirrus Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986；C. parvum Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986；C. confusus Kritsky, Thatcher & Boeger, 1986；C. bifurcum）（图2）。
图2：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。
**分子系统发育：**利用28S rDNA基因的部分序列通过最大似然法估计了所选Dactylogyrids属物种的分子系统发育关系。本研究测序的物种以粗体显示。物种名称前缀为GenBank序列ID。分支上方标注了ML自举支持值和后验概率（自举值<50和后验概率<0.90的未显示）。
Vancleaveus perditus n. sp. 与V. janauacaensis之间的遗传差异为15.2%（234 bp）。相比之下，Vancleaveus属物种与系统发育相关的Dactylogyridae属物种之间的遗传差异范围为15.1%至15.5%（235–246 bp，属于Ameloblastella属）以及16.2%至16.6%（260–262 bp，属于Unibarra属）（表2）。
**讨论：**
新物种的提出基于对Vancleaveus属成员的形态学和分子数据的全面分析。这一新描述的物种是首个已知寄生Doras属宿主的Dactylogyrids成员。这一发现使与Doradidae科相关的单吸盘类物种数量增加至30种。Vancleaveus属由Kritsky等人（1986）首次提出，包括四种新物种：V. janauacaensis（模式种）来自Doradidae鱼类；以及V. cicinnus、V. fungulus 和 V. platyrhynchi 来自亚马逊河流域的Pimelodidae科鱼类。随后，Santos & Brasil-Sato（2006）报道了V. cicinnus寄生于巴西圣弗朗西斯科河的Franciscodoras marmoratus（Lütken）鱼体内。十二年后，Soares等人（2018）在Xingú河流域的Hassar orestis和H. gabiru鱼的鳃中描述了V. klasseni。
该属物种的特征包括：Meals of cycle未与辅助结构连接；腹侧阴道孔；背侧锚状结构在表层根具有明显的基部褶皱；腹侧杆状结构具有中线突起（Kritsky et al., 1986；Boeger & Vianna, 2006）。我们观察到不同物种之间腹侧杆状结构中线突起的位置和阴道孔的位置存在差异。具体而言，Vancleaveus janauacaensis、V. fungulus 和 V. platyrhynchi 的腹侧杆状结构具有后内侧突起，而V. cicinnus 和 V. klasseni 具有前内侧突起。至于阴道孔，V. cicinnus、V. fungulus、V. janauacaensis 和 V. platyrhynchi 的阴道孔位于中腹侧，而V. klasseni的阴道孔位于左侧腹侧。Vancleaveus perditus n. sp. 具有这些特征的组合（腹侧杆状结构具有前内侧突起和左侧腹侧阴道孔），以及独特的特征，如背侧杆状结构具有后内侧突起，以及略微S形的 Meals of cycle，其远端部分呈舌状。
我们的系统发育分析（图2）支持Vancleaveus perditus n. sp. 作为有效属成员的地位，因为它与V. janauacaensis（模式种）归为一组，后者是目前该属唯一的已知序列。这两个物种具有15.2%（234 bp）的显著遗传差异。我们的结果支持了Mendoza-Palmero等人（2015, 2022）的研究，表明Vancleaveus属物种与感染Pimelodidae科和Heptapteridae科的Ameloblastella属物种密切相关，也与感染Pimelodidae科的Unibarra属物种密切相关。正如Mendoza-Palmero等人（2015）所指出的，即使感染相同Doradidae鱼的单吸盘类寄生虫也可能在系统发育上存在差异。例如，V. janauacaensis 和 C. bulbocirrus分别属于不同的分支A和B。同样，五种Cosmetocleithrum属物种（C. gussevi、C. gigas、C. rarum、C. parvus 和 C. confusus）感染Oxidoras niger鱼，分别属于分支B1和B2。我们还观察到不同Vancleaveus物种可以感染不同的新热带Siluriformes科鱼类，如Vancleaveus cicinnus同时存在于Pimelodidae科和Doradidae科中。Mendoza-Palmero等人（2015）还提出，独立的殖民和宿主转换事件促进了南美洲Siluriformes鱼类中单吸盘类寄生虫的多样化和分布。我们的发现进一步支持了这一观点，并强调未来的共系统发育研究有助于阐明这些单吸盘类物种及其Siluriformes宿主在南美洲的进化过程。
本研究通过结合形态学和分子数据，鉴定了一个新的Vancleaveus物种，强调了整合分类学的价值。研究还强调了需要更多关于新热带鱼类中单吸盘类寄生虫的研究，并提倡使用分子和形态学数据来阐明这种宿主-寄生虫系统的系统发育关系和共同进化。
打赏
