摘要：甲苯胺已被用于多种工业用途，但会导致接触该物质的工人患上膀胱癌。然而，其致癌机制仍不清楚。在本研究中，我们使用T24人膀胱上皮细胞检测了甲苯胺及其代谢物2-氨基间甲酚、4-氨基间甲酚（4AC）和N-(4-羟基-2-甲基苯基)乙酰胺引起的氧化性和硝化性DNA损伤。MTT实验表明，在这些代谢物中，4AC的细胞毒性最强。流式细胞术显示4AC在暴露细胞中产生活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）的能力最强。荧光免疫细胞化学分析显示，在5 nM浓度下，4AC显著增强了氧化性DNA损伤（8-氧代-2’-脱氧鸟苷）和硝化性DNA损伤（8-硝基鸟嘌呤）的染色强度，其染色强度高于其他化合物。彗星实验表明，甲苯胺及其代谢物在经甲酰胺嘧啶DNA糖基酶处理后显著增加了DNA的“彗尾”长度。通过转染小干扰RNA以及针对高迁移率组盒1（HMGB1）、晚期糖基化终产物受体（RAGE）和Toll样受体（TLR）9的抗体，DNA损伤显著减轻。这些发现表明，甲苯胺及其代谢物会诱导HMGB1的释放，HMGB1与CpG DNA形成复合物并结合到邻近细胞的RAGE上，随后被溶酶体中的TLR9识别，从而导致ROS和NO的产生及DNA损伤。在甲苯胺引起的致癌过程中，TLR9介导的炎症反应及其代谢物（尤其是4AC）引起的DNA损伤可能起着重要作用。
引言：甲苯胺是一种芳香胺，被广泛用于多种工业领域，如合成染料、橡胶和农药的中间体（IARC 2012）。非职业性暴露也可能由于使用染发剂、烟草烟雾以及局部麻醉剂普鲁卡因（其代谢产物为甲苯胺）而发生（IARC 2012）。然而，基于对职业暴露工人的研究，甲苯胺已被证实与膀胱癌的发生有关。一项回顾性队列研究表明，在使用甲苯胺和苯胺的化工厂中，膀胱癌的发病率显著增加（Ward等人，1991年）。化工厂的队列研究证实，累积暴露于甲苯胺与膀胱癌发病率的增加显著相关（Carreón等人，2014年；Markowitz和Levin，2004年）。最近，在一家日本化工厂中，长期接触甲苯胺的工人也出现了膀胱癌病例（Nakano等人，2018年）。国际癌症研究机构（IARC）将甲苯胺列为1类致癌物（IARC 2012）。然而，甲苯胺致癌的分子机制尚未完全明了。在工业化学品（包括芳香胺）引起的致癌过程中，其代谢物被认为起着重要作用。在接触甲苯胺的工人中，其代谢物2-氨基间甲酚（2AC）、4-氨基间甲酚（4AC）和N-(4-羟基-2-甲基苯基)乙酰胺（HMA）与甲苯胺一起在尿液中被检测到。特别是HMA和4AC在大部分尿液样本中被检测到（分别占92%和67%）（Eitaki等人，2019年）。它们的化学结构如图1所示。
图1：甲苯胺及其代谢物的化学结构
芳香胺的代谢物可以与DNA碱基相互作用形成DNA加合物，导致突变和致癌（Wang等人，2019年）。此外，氧化性和硝化性DNA损伤在致癌过程中也起着关键作用（Federico等人，2007年；Hiraku，2025年）。在甲苯胺的代谢物中，4AC已被报道通过产生活性氧（ROS）对DNA片段造成氧化损伤（Ohkuma等人，1999年）。ROS会诱导8-氧代-2’-脱氧鸟苷（8-oxodG）的形成，这是氧化DNA修饰的代表性产物（Lunec等人，2002年）。慢性炎症在环境致癌过程中起着重要作用。在炎症条件下，ROS和活性氮物种（RNS），如一氧化氮（NO），会在炎症细胞和上皮细胞中生成。NO与超氧阴离子（O₂⁻）反应生成过氧亚硝酸盐（ONOO⁻），后者与鸟嘌呤反应形成8-硝基鸟嘌呤（8-nitroG）（Yermilov等人，1995a）。8-oxodG和8-nitroG都是致突变的DNA损伤，因为在DNA合成过程中腺嘌呤会错误地掺入这些位置，导致G → T突变（Shibutani等人，1991年；Suzuki等人，2005年）。由于8-nitroG的化学不稳定性，它可能从DNA中释放出来形成脱嘌呤位点（Yermilov等人，1995b）。脱嘌呤位点也会与腺嘌呤结合，导致G → T突变。如果DNA修复系统无法修复这些损伤，就会发生突变，从而导致癌症的发生和发展（Kawanishi等人，2006年）。我们已经证明，各种工业化学品会在人肺上皮细胞中引起炎症反应和相应的DNA损伤（Ahmed等人，2020年；Hiraku等人，2016年，2017年）。然而，目前尚不清楚甲苯胺及其代谢物是否会在膀胱上皮细胞中通过炎症途径引起DNA损伤。
在本研究中，我们利用免疫细胞化学方法检测了甲苯胺及其代谢物对DNA的损伤能力，通过检测8-oxodG和8-nitroG来评估。为了确认这些DNA损伤的形成，我们使用了甲酰胺嘧啶DNA糖基酶（Fpg）进行了彗星实验。我们之前已经证明碳纳米管和铟化合物通过刺激高迁移率组盒1（HMGB1）、晚期糖基化终产物受体（RAGE）和Toll样受体（TLR）9相关的炎症途径在肺上皮细胞中引起DNA损伤（Ahmed等人，2020年；Hiraku等人，2016年）。然而，这些分子在接触工业化学品的膀胱上皮细胞中的DNA损伤中的作用仍不清楚。因此，我们使用小干扰RNA（siRNA）和针对这些分子的抗体来研究DNA损伤的分子机制。
材料与方法：
**化学品的制备**：甲苯胺、2AC和4AC从东京化学工业有限公司获得（纯度>98%，日本东京）。HMA从Alinda Chemical Trade Company Ltd.获得（纯度>98%，俄罗斯莫斯科）。这四种化合物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，制备成200 mM的储备溶液。在实验中，储备溶液用含有5%（v/v）胎牛血清（FBS）和100 mg/l卡那霉素（Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation，日本大阪）的完全培养基（Eagle’s Minimum Essential Medium (MEM)稀释。所有实验中DMSO的最终浓度保持在0.1%（v/v）以下。
**MTT实验**：为了测试甲苯胺及其代谢物的细胞毒性，我们按照先前描述的方法进行了3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）实验（Hiraku等人，2016年）。来自人膀胱移行细胞癌的T24细胞（RIKEN BioResource Center，日本筑波，3 × 10^4细胞/ml）接种到96孔板中，并在含有5%（v/v）FBS和100 mg/l卡那霉素的MEM中培养过夜。然后将细胞与甲苯胺及其代谢物（20-1000 µM）在37°C下孵育24小时，之后吸除培养上清液。细胞用0.5 mg/ml MTT（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）处理4小时，然后在室温下用DMSO处理10分钟。使用微孔板读数仪（Multiskan™ FC Microplate Photometer，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测量每个孔在570 nm处的吸光度。IC50值通过GraphPad Prism软件计算。
**流式细胞术测量ROS和NO**：T24细胞（1.3 × 10^5细胞/孔）在37°C下与甲苯胺及其代谢物处理指定时间。然后收集细胞并在190 g下离心4分钟。细胞分别用2.5 µM二氢乙锭（DHE，Molecular Probes，美国俄勒冈州尤金）或4-氨基-5-甲基氨基-2’,7’-二氟荧光素二乙酸酯（DAF-FM，Goryo Chemical，日本札幌）处理15分钟，以检测细胞中的ROS和NO。随后将细胞悬浮在500 µl PBS中，并使用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（BD Biosciences，美国加利福尼亚州）测量荧光强度。
**免疫细胞化学检测DNA损伤**：为了检测甲苯胺及其代谢物的DNA损伤能力，我们按照先前描述的方法进行了免疫细胞化学实验，以检测T24细胞中的8-oxodG和8-nitroG（Ahmed等人，2020年；Hiraku等人，2016年）。T24细胞（0.2 × 10^6细胞/ml）在含有5%（v/v）FBS和100 mg/l卡那霉素的MEM中培养过夜，培养在8孔培养板（BD Falcon，美国新泽西州富兰克林湖）。然后将细胞与甲苯胺或其代谢物在37°C下处理指定时间。为了检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及其转录因子NF-κB在DNA损伤中的作用，细胞同时用1 µM 1400 W（iNOS抑制剂，Sigma-Aldrich）或10 µM Bay 11-7082（NF-κB抑制剂，Sigma-Aldrich）处理。为了检测HMGB1和RAGE在DNA损伤中的作用，细胞先用5 µg/ml兔单克隆抗-HMGB1（ab79823，Abcam，英国剑桥）或抗-RAGE（ab216329，Abcam）抗体预处理30分钟。之后在37°C下干燥细胞，并用4%（v/v）甲醛固定10分钟。然后用0.5%（v/v）Triton-X100在PBS中渗透3分钟，再用2 N HCl处理30分钟以变性DNA，使抗体能够结合到DNA损伤部位（Nakae等人，2005年）。接着在室温下用1%（w/v）脱脂乳封闭细胞1小时。细胞用小鼠单克隆抗-8-oxodG抗体（2 µg/ml，日本老年控制研究所，福罗伊）或我们团队制备的兔多克隆抗-8-nitroG抗体（1 µg/ml）处理过夜，随后用相应的二次抗体Alexa 488抗小鼠lgG（1:400，Thermo Fisher Scientific）或Alexa 594抗兔IgG抗体（1:400，Thermo Fisher Scientific）处理3小时。细胞核用5 µM Hoechst 33258（Nacalai Tesque，日本京都）染色，并在荧光显微镜（BX53，Olympus，日本）下观察。通过ImageJ软件分析每个孔中随机选择的五个区域的DNA损伤染色强度，量化DNA损伤的总量，并减去细胞不存在区域的背景强度。用Hoechst 33258染色的核图像转换为二值图像，并用ImageJ软件量化其面积。最后，将DNA损伤的荧光强度除以相应的核面积。
**彗星实验**：为了评估甲苯胺及其代谢物引起的DNA切割，我们进行了彗星实验，有的实验使用了Fpg。T24细胞在37°C下与甲苯胺及其代谢物（20 nM）处理4小时。然后将细胞悬浮在0.7%低熔点琼脂糖（Nacalai Tesque，日本京都）中，浓度为1 × 10^5细胞/ml。混合物铺在预先涂有1%正常熔点琼脂糖（Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation）的载玻片上，并覆盖一层0.7%低熔点琼脂糖。在4°C下固化后，载玻片在冷裂解缓冲液（2.5 M NaCl，100 mM EDTA，10 mM Tris-HCl和1% Triton X-100，pH 10）中裂解1小时。裂解后，载玻片用NEBuffer™ 1平衡，并在37°C下与Fpg（1:1000，New England Biolabs，美国伊普斯威奇）孵育30分钟。未用Fpg处理的载玻片仅用NEBuffer™ 1处理。然后将切片放入电泳缓冲液（300 mM NaOH和1 mM EDTA）中浸泡20分钟，随后使用WSE-1720 Submerge-Multi海底电泳系统（ATTO，东京，日本）在25 V电压下进行20分钟的电泳。用PBS清洗后，用2 µg/ml的碘化丙啶（Thermo Fisher Scientific）染色，通过荧光显微镜观察彗星状结构，并使用CASP软件（SourceForge，圣地亚哥，CA，美国）进行分析。每个样本至少拍摄三张图像，每张图像分析大约20个随机选择的细胞（每个样本≥60个细胞）。DNA损伤程度通过橄榄尾矩来表示，定义为尾部DNA百分比与头部和尾部中心距离的乘积。
为了研究HMGB1、RAGE和TLR9在DNA损伤中的作用，我们按照先前的方法（Ahmed等人2020年；Hiraku等人2016年）检测了针对这些分子的siRNA的抑制效果。T24细胞被转染了20 nM的siRNA（Silencer® Select），分别针对HMGB1（s6645）、AGER（RAGE，s1166）和TLR9（s28873），以及阴性对照siRNA（4390846）。细胞在37°C下与Lipofectamine 3000转染试剂一起在Opti-MEM I培养基中孵育72小时。siRNA和这些试剂均购自Thermo Fisher Scientific。我们按照先前的方法（Ahmed等人2020年；Hiraku等人2016年）通过Western blotting确认了siRNA的转染效率。转染后，收集T24细胞并用RIPA缓冲液（Cell Signaling Technology，丹弗斯，MA，美国）裂解细胞。裂解液在10,000 g离心10分钟，然后用BCA™蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定上清液中的蛋白质浓度。蛋白质在SDS-PAGE凝胶（5–20%）上分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后用5%（w/v）脱脂牛奶封闭膜30分钟。接着，将膜与1 µg/ml的小鼠单克隆抗HMGB1抗体（ab190377，Abcam）、抗RAGE抗体（ab54741，Abcam）或兔多克隆抗TLR9抗体（ab37154，Abcam）以及0.1 µg/ml的小鼠单克隆抗β-actin抗体（sc-47778，Santa Cruz Biotechnology）一起孵育2小时。之后，用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG（1:10000，#7076，Cell Signaling Technology）或抗兔IgG（1:10000，#7074，Cell Signaling Technology）处理膜30分钟。最后，用ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagents（Amersham™，Little Chalfont，英国）处理膜，并使用ImageQuant LAS 4000 mini生物分子成像仪（Fujifilm，东京，日本）捕获图像。条带强度通过ImageJ软件进行量化。
为了检测细胞中HMGB1、RAGE和TLR9的共定位，按照先前的方法（Hiraku等人2016年）进行了双荧光染色。T24细胞首先与20 nM的4AC孵育4小时，然后按照上述方法处理。接着在室温下与5 µg/ml的小鼠单克隆抗HMGB1抗体或10 µg/ml的小鼠单克隆抗RAGE抗体以及5 µg/ml的兔多克隆抗TLR9抗体孵育过夜。之后，细胞与Alexa 488抗小鼠IgG（1:400）和Alexa 594抗兔IgG（1:400）抗体孵育3小时。细胞核用Hoechst 33258染色，并通过荧光显微镜观察。
统计分析通过方差分析（ANOVA）进行，随后使用GraphPad Prism软件进行Tukey多重比较检验或Student’s t检验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
通过MTT实验评估了o-甲苯胺及其代谢物对T24细胞的细胞毒性。尽管o-甲苯胺和HMA在1 mM浓度下24小时处理后没有表现出细胞毒性，但4AC和2AC在100 µM（p < 0.05）和200 µM（p < 0.001）浓度下显著降低了细胞活力（图2）。4AC和2AC的IC50值分别为72.7 ± 31.6 µM和249.2 ± 76.5 µM。这些结果表明4AC在o-甲苯胺的代谢物中具有最强的细胞毒性。
我们通过流式细胞术检测了o-甲苯胺及其代谢物处理后的T24细胞内的ROS和NO生成情况。处理3小时后，4AC在50 µM浓度下显著增加了DHE（ROS）和DAF-FM（NO）的荧光强度（p < 0.05和p < 0.01，图3）。4AC在50 µM浓度下1小时也显著增加了ROS和NO的产生（p < 0.05和p < 0.01，图S1）。然而，o-甲苯胺、2AC和HMA对ROS和NO水平没有显著影响（图3）。
由于4AC显著增加了ROS和NO的产生，我们进行了免疫细胞化学实验来检测4AC处理后的T24细胞中的DNA损伤。图4显示，即使在低浓度5 nM下，4AC也能形成DNA损伤（p < 0.01），并且在20 nM浓度下染色强度达到最大（p < 0.001）。图S2显示了4AC和其他代谢物（2AC和HMA）在4小时作用下8-oxodG和8-nitroG的形成。这些化合物以剂量依赖的方式增加了DNA损伤的形成。我们还检测了4AC诱导的DNA损伤的时间进程。8-oxodG和8-nitroG的染色强度在2小时时显著增加，在4小时时达到最大（图5）。
由于4AC促进了ROS和NO的产生，我们进行了免疫细胞化学实验来检测4AC处理后的T24细胞中的DNA损伤。图4显示，即使在低浓度5 nM下，4AC也能形成这些DNA损伤，且在20 nM浓度下染色强度最大（p < 0.001）。图S2显示了4AC和其他代谢物（2AC和HMA）在4小时作用下8-oxodG和8-nitroG的形成。这些化合物以剂量依赖的方式增加了DNA损伤的形成。我们还检测了4AC诱导的DNA损伤的时间进程。数据表示3次独立实验的平均值±标准差。**p < 0.01和***p < 0.001，通过与对照组的ANOVA和Tukey检验进行比较。
由于4AC显著增加了ROS和NO的产生，我们进行了免疫细胞化学实验来检测4AC处理后的T24细胞中的DNA损伤。图5显示，4AC处理后的T24细胞中8-oxodG和8-nitroG的形成。数据表示3次独立实验的平均值±标准差。**p < 0.01和***p < 0.001，通过与对照组的ANOVA和Tukey检验进行比较。
我们比较了o-甲苯胺及其代谢物引起的DNA损伤程度。o-甲苯胺及其所有代谢物都显著增加了8-oxodG和8-nitroG的形成（图6a和b）。其中，4AC形成这些DNA损伤的能力最强，其染色强度显著高于o-甲苯胺和HMA。o-甲苯胺及其代谢物的DNA损伤能力顺序为4AC > 2AC > HMA ≈ o-甲苯胺。
彗星实验显示，o-甲苯胺及其代谢物在没有Fpg处理的情况下没有显著增加细胞的DNA损伤。相比之下，在Fpg处理后，暴露于这些化合物的细胞中观察到橄榄尾矩显著增加，尤其是4AC。橄榄尾矩的顺序与8-oxodG和8-nitroG的形成能力相似（图6c和d）。
iNOS和NF-κB抑制剂对4AC诱导的DNA损伤的影响显示，iNOS和NF-κB的表达在炎症诱导的DNA损伤中起关键作用（Hiraku等人2010年）。为了证明这些分子在4AC诱导的DNA损伤中的作用，我们将细胞与1400 W和Bay 11-7082共同处理。如图7所示，这些抑制剂显著减少了4AC诱导的DNA损伤。这一结果表明NF-κB介导的iNOS表达促进了4AC诱导的DNA损伤。
我们通过Western blotting检测了每种siRNA的转染效率。每种siRNA都显著抑制了其相应蛋白质的表达，与对照组和阴性siRNA相比（p < 0.05，图8a）。完整的膜图像见图S3。我们进行了免疫细胞化学实验来检测这些siRNA对4AC诱导的DNA损伤的影响。siRNA对HMGB1、RAGE和TLR9的转染显著减少了8-oxodG和8-nitroG的形成，而对照siRNA对这些DNA损伤几乎没有影响（图8b和c）。这些发现表明HMGB1、RAGE和TLR9在4AC诱导的DNA损伤中起关键作用。为了确认DNA损伤的机制，我们检测了HMGB1和RAGE抗体的效果。这两种抗体显著减少了4AC诱导的8-oxodG和8-nitroG的形成，而对照IgG没有减少DNA损伤（图9）。这些结果证实HMGB1和RAGE会促进4AC引起的DNA损伤。图8：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
siRNA转染对4AC诱导的DNA损伤的影响。a siRNA转染细胞中目标蛋白的表达水平。T24细胞在37°C下用20 nM的siRNA处理HMGB1、AGER（RAGE）和TLR9 72小时。数据为3次独立实验的平均值±标准差。*p<0.05与对照组相比；#p<0.05与阴性对照siRNA相比，通过ANOVA后进行Tukey检验。b siRNA对4AC诱导的DNA损伤的抑制作用。T24细胞用20 nM的siRNA转染72小时，然后在37°C下用20 nM的4AC处理4小时。免疫细胞化学分析按照材料与方法中的描述进行。绿色和红色荧光分别代表8-oxodG和8-nitroG的形成。蓝色荧光代表细胞核。放大倍数：X200。c siRNA对4AC诱导的DNA损伤影响的定量图像分析。数据为3-4次独立实验的平均值±标准差。a, c **p<0.01和***p<0.001与对照组相比；#p<0.05和##p<0.01与阴性siRNA相比，通过ANOVA后进行Tukey检验。
图9：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
抗HMGB1和抗RAGE抗体对4AC诱导的DNA损伤的影响。T24细胞先用5 µg/ml的抗HMGB1或抗RAGE抗体预处理，然后在37°C下用20 nM的4AC处理4小时。对照IgG指的是它们的同型IgG。a 抗HMGB1和抗RAGE抗体对4AC诱导的DNA损伤的抑制作用。免疫细胞化学分析按照材料与方法中的描述进行。绿色和红色荧光分别代表8-oxodG和8-nitroG的形成。蓝色荧光代表细胞核。放大倍数：X200。b 抗HMGB1和抗RAGE抗体对DNA损伤抑制作用的定量图像分析。将对照组的相对强度设为1进行比较。数据为3-4次独立实验的平均值±标准差。**p<0.01和***p<0.001与对照组相比；#p<0.05、##p<0.01与4AC相比，通过ANOVA后进行Tukey检验。
图10显示了通过双免疫荧光技术在4AC处理的T24细胞中HMGB1、RAGE和TLR9的定位。在未经处理的对照组中，HMGB1主要在细胞核中表达，并且仅与细胞质中的TLR9弱共定位。在4AC处理的细胞中，HMGB1的染色出现在细胞质中，并与TLR9共定位（图10a）。同样，RAGE在4AC处理的细胞中与TLR9在细胞质中明显共定位，但在未经处理的对照组中仅弱共定位（图10b）。这些发现表明，HMGB1和RAGE在4AC处理后与TLR9在细胞质中相互作用。此外，Western blotting显示4AC处理显著诱导了HMGB1和RAGE的表达（p<0.01，图10c），这与它们在细胞质中与TLR9的增强共定位一致。完整的膜图像见图S4。
图10：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
图10显示了在4AC处理的T24细胞中TLR9与HMGB1和RAGE的共定位。T24细胞在37°C下用20 nM的4AC处理4小时。免疫细胞化学分析按照材料与方法中的描述进行。绿色和红色荧光分别代表HMGB1（a）或RAGE（b）和TLR9的表达。黄色染色代表TLR9与HMGB1（a）或RAGE（b）的共定位。蓝色荧光代表细胞核。放大倍数：X400。（c）Western blotting显示4AC处理细胞中HMGB1和RAGE的表达增加。数据为3次独立实验的平均值±标准差。**p<0.01与对照组相比，通过Student’s t检验。
讨论
在这项研究中，我们证明了邻甲苯胺及其代谢物通过炎症反应在膀胱上皮细胞中引起氧化性和硝基化DNA损伤。关于芳香胺诱导的膀胱癌发生的分子机制，已知它们的代谢物会与DNA结合，导致基因突变。实际上，先前的研究已经在人类膀胱肿瘤组织中发现了邻甲苯胺衍生的DNA加合物（Bohm等人，2011年）。我们之前报告过各种工业化学品在肺上皮细胞中引起硝基化DNA损伤（Ahmed等人，2020年；Guo等人，2012年；Hiraku等人，2016年，2017年）。这是首次研究表明工业化学品在膀胱上皮细胞中引起炎症反应并导致DNA损伤。
在这项研究中，邻甲苯胺及其代谢物在5 nM浓度下显著增加了DNA损伤产物8-oxodG和8-nitroG的形成。在接触邻甲苯胺的工人尿液中，其代谢物的浓度在用β-葡萄糖醛酸酶和芳基硫酸酶处理后达到微摩尔水平（Eitaki等人，2019年）。在大鼠皮下注射邻甲苯胺后，在尿液中检测到了未结合的代谢物[4AC（0.06%）和HMA（0.3%）]以及酸结合的代谢物[4AC的硫酸盐（27.8%）、HMA（8.5%）和2AC（2.1%）和4AC及HMA的葡萄糖醛酸苷（2.6%）和（2.8%）（Son等人，1980年）。在喂食乙酰乙酰邻甲苯胺的非人源化和人源化肝脏小鼠的尿液中也检测到了4AC的结合和未结合形式（Suzuki等人，2025年）。从这些发现来看，尿液中游离邻甲苯胺代谢物的浓度似乎比结合代谢物低1-3个数量级。据估计，包括4AC在内的游离邻甲苯胺代谢物在尿液中的浓度达到纳摩尔水平，因此，我们的实验条件似乎具有职业相关性。
在MTT测定中，在邻甲苯胺及其代谢物中，4AC在较小程度上，2AC引起了细胞毒性，但在所使用的条件下，邻甲苯胺和HMA没有引起细胞毒性。这些化合物在纳摩尔浓度下引起了DNA损伤产物8-oxodG和8-nitroG的形成。我们的研究显示，DNA损伤能力的顺序为4AC>2AC>HMA≈邻甲苯胺，这与细胞毒性一致。在流式细胞术中，只有4AC在50 µM浓度下显著增加了ROS和NO的生成。这种差异可以通过假设细胞通过控制活性物质的定位、数量和持续时间来严格调节其产生来解释，而在细胞毒性条件下，这些物质会从产生源随机扩散到整个细胞中（Herb等人，2021年）。在邻甲苯胺诱导的癌变过程中，其代谢物，特别是4AC，似乎通过这些活性物质引起DNA损伤起主导作用。Ohkuma等人已经证明4AC在无细胞系统中通过生成ROS引起DNA损伤（Ohkuma等人，1999年）。4AC在铜离子存在下通过氧化羟基被氧化为氨基甲基苯氧基自由基，然后与分子氧反应生成O₂⁻和过氧化氢（Ohkuma等人，1999年）。因此，在无细胞系统中生成的ROS可能有助于4AC引起的DNA损伤。
4AC在5 nM浓度下引起了DNA损伤产物的形成，其染色强度在20 nM时达到最大，而其他化合物在200 nM浓度下以剂量依赖的方式增加了DNA损伤产物的形成。这些结果可能可以通过这些DNA损伤的修复和化学不稳定性来解释。8-oxodG在暴露于ROS和RNS的DNA中大量产生，然后迅速被8-oxoguanine糖基酶1（OGG1）修复，后者切除8-oxoguanine以启动碱基切除修复（You等人，2024年）。或者，8-oxodG极易进一步氧化，产生更稳定的产物，包括螺亚胺二氢杨酮和胍基二氢杨酮（Andres等人，2023年；Cui等人，2013年）。此外，8-nitroG在化学上不稳定，容易从DNA中释放，产生一个脱嘌呤位点（Yermilov等人，1995b），尽管尚未发现直接修复8-nitroG的酶。
先前的研究报告称，短期暴露于相对高浓度的邻甲苯胺可以引起DNA双链断裂，这通过γ-H2AX的形成得到证实，γ-H2AX是DNA双链断裂的敏感标记物（Qi等人，2022年）。在这项研究中，彗星试验显示邻甲苯胺及其代谢物没有引起或仅引起轻微的DNA切割，而Fpg处理显著增加了橄榄尾矩。Fpg是一种双功能DNA糖基酶，具有DNA N-糖基酶和脱嘌呤/嘧啶（AP）裂解酶活性。N-糖基酶活性有助于释放受损的嘌呤，包括8-oxoguanine，生成AP位点。Fpg还切割AP位点，创建一个单核苷酸DNA缺口。我们的结果将证实邻甲苯胺及其代谢物主要引起氧化性和硝基化碱基损伤，而不是DNA链断裂。从这些研究中可以看出，邻甲苯胺引起的DNA损伤类型可能取决于暴露剂量和条件。
HMGB1是一种核蛋白，在炎症和膀胱癌发展中起关键作用（Jia等人，2014年；Liao等人，2014年）。TLR9在膀胱癌细胞中表达（Olbert等人，2015年），它识别HMGB1-CpG DNA复合物以促进炎症反应（Ivanov等人，2007年；Tian等人，2007年）。在这项研究中，通过siRNA减少HMGB1、RAGE和TLR9的表达显著降低了4AC引起的DNA损伤。双免疫荧光显示HMGB1和RAGE在4AC处理的细胞中与TLR9在细胞质中相互作用，可能在溶酶体中。一致地，Western blotting显示4AC显著增加了HMGB1和RAGE的表达。此外，iNOS及其转录因子NF-κB的抑制剂减轻了DNA损伤。
根据这些结果，图11展示了邻甲苯胺及其代谢物引起的DNA损伤的假设机制。邻甲苯胺及其代谢物对细胞造成损伤，随后HMGB1和CpG DNA释放到细胞外空间。HMGB1和CpG DNA形成复合物，通过RAGE被邻近细胞的溶酶体吸收。CpG DNA被TLR9识别，触发炎症反应，包括NF-κB激活和iNOS表达。炎症途径的激活导致ROS和NO的过量产生，从而形成8-oxodG和8-nitroG。这些DNA损伤可能导致基因突变和癌症的发生。我们已经证明碳纳米管和铟化合物可以通过HMGB1-RAGE-TLR9途径刺激炎症反应，导致肺上皮细胞的DNA损伤（Ahmed等人，2020年；Hiraku等人，2016年）。这是首次研究表明工业化学品通过这一途径在膀胱上皮细胞中引起DNA损伤。
总结来说，我们证明了邻甲苯胺及其代谢物在职业相关浓度下在膀胱上皮细胞中引起氧化性和硝基化DNA损伤，其中4AC显示出最强的DNA损伤能力。这项研究提供了关于邻甲苯胺代谢物引起的DNA损伤机制的关键见解，并强调了其在致癌作用中的作用。这些DNA损伤被认为是评估致癌风险的潜在生物标志物（Hiraku 2010年；Huang等人，2011年）。我们的发现可能有助于预防和减少由环境和工业化学品引起的癌变。然而，目前的研究基于有限的体外实验条件，主要提供了它们作用机制的见解。为了理解这些DNA损伤在邻甲苯胺诱导的癌变中的作用，需要进一步的研究。
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