摘要：Psyttalia ponerophaga是一种寄生蜂，具有潜在的生物控制作用，可以用于防治橄榄果蝇Bactrocera oleae。这种寄生蜂可以在人工宿主Ceratitis capitata上大规模繁殖。本研究旨在评估在Ceratitis capitata上连续繁殖76代后，其对目标宿主Bactrocera oleae的生物控制效果。研究人员比较了在Ceratitis capitata上繁殖的寄生蜂与直接从野外采集的寄生蜂在多个生物学参数上的差异。此外，还进行了无选择和有选择条件下的宿主利用测试，测试对象包括两种非目标实蝇科昆虫：黑樱桃果蝇Rhagoletis fausta和Cape-ivy瘿蝇Parafreutreta regalis。结果表明，野生种群在防治Bactrocera oleae方面表现更好，其寄生率和每宿主的繁殖产出更高，后代的性别比例也更偏向雌性。宿主利用测试显示，实验室繁殖的种群和野生种群都能成功寄生这两种非目标物种。对非目标物种死亡蛹的遗传分析还发现，两种寄生蜂种群都存在寄生失败的情况。总之，在人工宿主上繁殖或大规模繁殖会显著降低寄生蜂对Bactrocera oleae的防治效果，这可能对其在现实野外条件下的生物控制效果产生不利影响。
引言：橄榄果蝇Bactrocera oleae（双翅目：实蝇科）是全球橄榄的主要害虫，对橄榄产业造成了巨大的经济损失（Daane & Johnson, 2010）。其幼虫会在成熟的橄榄内部发育，导致橄榄无法作为食用橄榄出售，并降低橄榄油的质量（Gómez-Caravaca et al., 2008; Mraicha et al., 2010）。由于当地的自然天敌无法有效抑制Bactrocera oleae的种群数量（Borowiec et al., 2012; Orsini et al., 2007），这种害虫成为了欧洲（Borowiec et al., 2012）和北美（Borowiec et al., 2012）经典生物控制研究的目标。其中一个项目始于2000年代初的加利福尼亚州，该地区于1998年首次发现这种害虫（Daane & Johnson, 2010）。该项目包括在亚洲和非洲部分地区寻找天敌的工作。两种属于Psyttalia属（膜翅目：茧蜂科）的内寄生蜂被引入加利福尼亚：Psyttalia humilis Silvestri和P. lounsburyi Silvestri。其中只有P. lounsburyi成功定殖（Daane et al., 2015; Wang et al., 2022），并在加利福尼亚中部沿海地区广泛传播，但未在橄榄生产集中的内陆山谷地区定殖（Wang et al., 2022）。要在加利福尼亚有效控制这种害虫，可能需要引入一种适应当地气候条件且不对非目标生物构成威胁的寄生蜂种群或物种。在这种情况下，第三种Psyttalia物种P. ponerophaga Silvestri（图1A）特别值得关注，因为它可能比P. lounsburyi更耐寒（Daane et al., 2013; Sime et al., 2007; Wang et al., 2021）。P. ponerophaga是一种独居的幼虫内寄生蜂，成年后从宿主蛹中羽化。在巴基斯坦，P. ponerophaga会攻击野生橄榄（Olea europea subsp. cuspidata）的幼虫（Bon et al., 2016）。野生橄榄的体积比栽培橄榄小得多，而橄榄的大小与P. ponerophaga的寄生率呈负相关（Sime et al., 2007），这可能是由于P. ponerophaga的产卵器长度适合攻击野生橄榄的幼虫（Wang et al., 2009）。
美国农业部农业研究服务欧洲生物控制实验室（USDA ARS EBCL，以下简称EBCL）自2003年以来一直参与加利福尼亚州橄榄果蝇的生物控制研究，并参与了多种寄生蜂的繁殖工作（Hoelmer et al., 2011）。EBCL在将超过80,000只P. lounsburyi释放到加利福尼亚之前发挥了关键作用（Chardonnet et al., 2019; Wang et al., 2022）。由于在Bactrocera oleae上繁殖寄生蜂具有挑战性，大规模繁殖并不实际。为了持续繁殖并产生大量Psyttalia寄生蜂，EBCL使用了一种人工宿主——地中海实蝇Ceratitis capitata（双翅目：实蝇科）进行繁殖（Chardonnet et al., 2019）。该方法包括在人工饲料上培养Ceratitis capitata幼虫，将其转移到覆盖有Parafilm™的圆形聚苯乙烯球上，让寄生蜂在此产卵，然后再将幼虫放回人工饲料中完成发育。为了刺激P. ponerophaga雌蜂，会在暴露期间在球上附着一些橄榄（图1B）。2010年至2019年间，EBCL使用这种方法共繁殖了76代P. ponerophaga，在第60代后添加了从野外采集的个体。在受控实验室条件下长期大规模繁殖并使用人工宿主可能会导致生物控制剂出现生理和行为变化，从而增加其不适应自然野外条件的风险（Sørensen et al., 2012）。已有研究表明，大规模繁殖的昆虫寄生蜂在宿主搜索效率、飞行能力、宿主接受度和求偶行为方面发生了变化（Canale & Benelli, 2012; Naranjo-Guevara et al., 2020）。实验室繁殖的昆虫还表现出对非生物胁迫的耐受性降低、饮食灵活性下降以及产卵偏好和活动模式的变化（Hoffmann & Ross, 2018）。此外，遗传瓶颈、近亲繁殖和奠基者效应等遗传因素会在短期内和长期内影响繁殖昆虫的适应性，通常使其适应性低于野生种群（Baeshen et al., 2014; Bertin et al., 2017; Szűcs et al., 2019）。因此，在涉及有益昆虫大规模生产的生物控制操作中，制定严格的质量控制程序至关重要（Lenteren, 2003; Sørensen et al., 2012）。因此，评估在人工宿主上繁殖对P. ponerophaga的影响尤为重要，特别是其寄生栽培橄榄中Bactrocera oleae幼虫的能力。
在其原产地范围内，P. ponerophaga被认为专门寄生于Bactrocera oleae，因为尽管在该地区进行了广泛的搜索，但只在Bactrocera oleae的蛹中发现了这种寄生蜂（Sime et al., 2007; Wharton, 2009）。然而，在加利福尼亚进行的初步宿主特异性测试表明，来自EBCL繁殖的P. ponerophaga个体会对两种非目标实蝇科昆虫产生攻击：黑樱桃果蝇Rhagoletis fausta（双翅目：实蝇科）和Cape-ivy瘿蝇Parafreutreta regalis（双翅目：实蝇科）（Daane & Johnson, 2010）。黑樱桃果蝇原产于北美洲，而Cape-ivy瘿蝇是一种有益的生物控制剂，用于控制加州的一种杂草Delairea odorata（菊科）（Balciunas & Smith, 2006; Daane & Johnson, 2010）。这些结果引发了疑问：在人工宿主上大规模繁殖是否影响了P. ponerophaga的宿主选择？在宿主暴露实验中（图1B），那些绕过橄榄、直接在聚苯乙烯球上寻找宿主的寄生蜂可能会在每一代中被优先选择和保留。因此，这种繁殖方法可能会使P. ponerophaga对橄榄或Bactrocera oleae特有的物理和/或化学信号的依赖性减弱，而这些信号原本可能是阻止其寄生于非目标宿主的障碍。
本研究的首要目的是比较两种P. ponerophaga种群在寄生栽培橄榄中Bactrocera oleae幼虫方面的表现：一种是在Ceratitis capitata上繁殖的种群，另一种是从野外采集的野生种群。具体比较了两种寄生蜂种群的寄生率、可用宿主数量与产生的寄生蜂数量之间的相关性以及后代的性别比例。第二个目的是测试在人工宿主上繁殖的P. ponerophaga种群是否比野生种群更容易攻击非目标宿主。通过不同的实验让两种种群的寄生蜂接触非目标物种R. fausta和P. regalis，并比较它们的寄生成功率。遗憾的是，用于研究的R. fausta幼虫数量太少，无法进行可靠的数据分析和解释，因此关于这一物种的测试结果仅会在讨论部分简要讨论。
材料与方法：
用于研究的野生P. ponerophaga种群来自巴基斯坦西北部Khyber Pakhtunkhwa省（靠近Swat和Abbottabad的地区）采集的被寄生的Bactrocera oleae蛹（Olea europea subsp. Cuspidata）。2019年10月7日至11月9日期间，共向EBCL运送了2655个蛹。在隔离条件下监测寄生蜂的羽化情况，寄生率计算公式为[羽化的寄生蜂数量/(羽化的寄生蜂数量+羽化的果蝇数量) × 100]。新羽化的蜂被放入饲养笼中，并提供蜂蜜和水直到实验使用。
P. ponerophaga的饲养种群最初是从2004年至2008年在巴基斯坦Khyber Pakhtunkhwa省采集的个体建立的。这个种群随后在加州大学伯克利分校的隔离设施中以Bactrocera oleae为宿主进行维持，直到2010年。之后将其转移到EBCL，并按照引言中描述的方法在人工宿主Ceratitis capitata上继续繁殖（Chardonnet et al., 2019）。在本研究开始时（2019年10月），EBCL已在Ceratitis capitata上繁殖了76代P. ponerophaga。新羽化的成虫被放入饲养笼中，提供蜂蜜和水，与野生种群相同。所有饲养笼都置于受控条件下（22 ± 2°C, 16L: 8D, 30–40% RH）。所有测试都使用3至7天大的未接触过宿主的雌蜂，且每只雌蜂仅用于一次实验。
由P. regalis引起的瘿瘤来自美国农业部农业研究服务入侵物种和传粉者研究单位（ISPHRU，Albany, CA）维持的P. regalis种群。含有1–2个瘿瘤的D. odorata茎被送往EBCL，直接用于宿主特异性测试。每个瘿瘤通常包含1–3个P. regalis蛹。从巴基斯坦进口的B. oleae蛹以及从美国进口的R. fausta和P. regalis蛹被运送到EBCL，是通过由Service Régional de l'Alimentation – Occitanie（SRAL Occitanie）颁发的进口许可证完成的。为了生产用于效果测试的受感染橄榄，EBCL在研究期间建立了一个B. oleae饲养设施。在研究前的几周内，定期从当地的一个有机橄榄园（Domaine de l’Oulivie，34980 Combaillaux，法国）收集受感染的橄榄，从这些橄榄中孵化出的蝇类被保存在EBCL的生长室中，生长室的条件为22±2°C、16L:8D、50–70%的相对湿度，同时提供水和蔗糖与酵母羟基酸盐的混合物作为食物（Folmer等人，2007年）。用于饲养和测试的橄榄都属于“Lucques”品种，这是一种中等重量的法国橄榄品种。新鲜的橄榄会定期提供给成年蝇类用于产卵。在所有测试中，使用的受感染橄榄都已被蝇类接触了24小时，并且选择了有2-4个产卵痕迹的橄榄。在B. oleae产卵后的10天，将这些受感染的橄榄提供给寄生蜂。预计经过10天感染的橄榄中会含有大量的第三龄B. oleae幼虫，这些幼虫适合被P. ponerophaga寄生（Sime等人，2007年）。测试后从橄榄中出来的蛹的数量被用作每次测试中可供寄生蜂利用的宿主数量的代理指标。初步观察表明，蝇类幼虫很少在果实内部化蛹。
**P. ponerophaga种群对商业橄榄中B. oleae的寄生效果比较**
为了比较两种寄生蜂种群对B. oleae的寄生效果，在EBCL的检疫设施中进行了测试，每次测试中向野生或饲养的个体寄生蜂提供5个受感染的橄榄，持续时间为48小时，测试在受控的室温条件下进行（22±2°C、16L:8D、30–40%的相对湿度）。所有测试都在带有网状盖子的圆柱形塑料笼子（13×9厘米）中进行。测试期间为寄生蜂提供水和蜂蜜滴。测试后监测了从橄榄中出来的蝇类和寄生蜂的数量以及寄生蜂的性别比例，并根据上述方法估算了可利用的宿主数量。总共进行了81次测试（每次测试重复一次），其中81次使用饲养种群，85次使用野生种群。此外，还进行了10次对照测试，这些对照测试中使用的是未接触寄生蜂的5个受感染橄榄。
**宿主利用测试**
测试内容包括将疑似被R. fausta感染的苦樱桃或被P. regalis感染的Cape-Ivy瘿果暴露给一只来自饲养种群或野生种群的雌性寄生蜂48小时。随后几周内监测果实或瘿果，记录孵化出的蛹、成年蝇和成年寄生蜂的数量，并记录寄生蜂的性别。P. regalis的幼虫在瘿果内化蛹，并在化蛹后不久作为成虫从瘿果中羽化。在测试后的几周内，对用于测试的Cape-ivy瘿果进行了解剖，以寻找死亡的蛹。这些蛹被分析是否含有P. ponerophaga的DNA。由于某些瘿果已经严重腐烂或完全干燥，无法进行解剖。
宿主利用测试采用了两种不同的方法，分别使用野生或实验室饲养的P. ponerophaga：
1) 无选择测试，顺序暴露：首先将一只雌性寄生蜂暴露于1个Cape-ivy瘿果48小时，然后暴露于5个受感染的橄榄48小时。
2) 无选择测试，顺序暴露：首先将一只雌性寄生蜂暴露于5个受感染的橄榄48小时，然后暴露于1个Cape-ivy瘿果48小时。顺序测试用于控制最近接触目标宿主的影响。因为之前的遭遇或产卵可能会通过联想学习、敏感化或简单的卵负荷减少来改变寄生蜂对后续宿主的接受度，因此第一次和第二次暴露之间的寄生差异可能并不反映第二种寄生蜂的真正生理适应性（Lenteren等人，2006年）。
作为阴性对照，一组10个Cape-ivy瘿果未暴露于寄生蜂，并单独监测其昆虫的孵化情况。也进行了选择测试，但由于Cape-ivy瘿果的有限可用性，这些测试只能使用野生种群进行。这些结果将在讨论部分简要讨论。
在每次测试的48小时期间，随机选择三个时间点观察每只寄生蜂。尽管P. ponerophaga是昼行性的，但目前尚不清楚它在一天中的某些时段是否更活跃。记录寄生蜂在测试容器中的位置，即是在果实上还是瘿果上。每次测试结束后计算每只寄生蜂在果实或瘿果上的观察频率。
所有测试都在带有网状孔的圆柱形塑料容器（13×9厘米）中进行。橄榄放置在由鸡丝制成的支撑物上，使果实高出笼底2厘米。这种放置方式增加了通风性，使寄生蜂可以从各个方向检查果实。对于P. regalis，提供带有大约5-8厘米茎段的瘿果给寄生蜂，寄生蜂被放置在装有水的小花管中。测试期间为寄生蜂提供水和蜂蜜滴。测试后监测从橄榄中出来的蝇类和寄生蜂的数量以及寄生蜂的性别比例，并根据上述方法估算可利用的宿主数量。总共进行了81次测试（每次测试重复一次），其中81次使用饲养种群，85次使用野生种群。此外，还进行了10次对照测试，使用的是未接触寄生蜂的5个受感染橄榄组。
**宿主利用测试的具体步骤**
测试包括将疑似被R. fausta感染的苦樱桃或被P. regalis感染的Cape-Ivy瘿果暴露给一只来自饲养种群或野生种群的雌性寄生蜂48小时。随后几周内监测果实或瘿果，计数孵化出的蛹、成年蝇和成年寄生蜂的数量，并记录寄生蜂的性别。在寄生蜂羽化时记录其性别。P. regalis的幼虫在瘿果内化蛹，并在化蛹后不久作为成虫从瘿果中羽化。在测试后的几周内解剖用于测试的Cape-ivy瘿果，以寻找死亡的蛹。这些蛹被分析是否含有P. ponerophaga的DNA。由于某些瘿果腐烂严重或完全干燥，无法进行解剖。
宿主利用测试采用了两种不同的模式，分别使用野生或实验室饲养的P. ponerophaga：
1) 无选择测试，顺序暴露：首先将一只雌性寄生蜂暴露于1个Cape-ivy瘿果48小时，然后暴露于5个受感染的橄榄48小时。
2) 无选择测试，顺序暴露：首先将一只雌性寄生蜂暴露于5个受感染的橄榄48小时，然后暴露于1个Cape-ivy瘿果48小时。顺序测试用于控制最近接触目标宿主的影响。由于之前的遭遇或产卵可能会通过联想学习、敏感化或简单的卵负荷减少来改变寄生蜂对后续宿主的接受度，因此第一次和第二次暴露之间的寄生差异可能并不反映第二种寄生蜂的真正生理适应性（Lenteren等人，2006年）。
作为阴性对照，一组10个Cape-ivy瘿果未暴露于寄生蜂，并单独监测其昆虫的孵化情况。这些对照用于评估自然感染水平。也进行了选择测试，但由于Cape-ivy瘿果的有限可用性，这些测试只能使用野生种群进行。这些结果将在讨论部分简要讨论。
在每次测试的48小时期间，随机选择三个时间点观察每只寄生蜂。尽管P. ponerophaga是昼行性的，但目前尚不清楚它在一天中的某些时段是否更活跃。记录寄生蜂在测试容器中的位置，即是在果实上还是瘿果上。每次测试结束后计算每只寄生蜂在果实或瘿果上的观察频率。
所有测试都在带有网状孔的圆柱形塑料容器（13×9厘米）中进行。橄榄放置在由鸡丝制成的支撑物上，使果实高出笼底2厘米。这种放置方式增加了通风性，使寄生蜂可以从各个方向检查果实。对于P. regalis，提供带有大约5-8厘米茎段的瘿果给寄生蜂，寄生蜂被插入装有水的小花管中。测试期间为寄生蜂提供水和蜂蜜。如果至少在一个暴露于寄生蜂的瘿果中发现了P. regalis的蛹，则认为宿主利用测试有效。
**在非目标物种的蛹中检测P. ponerophaga的DNA**
对来自暴露于寄生蜂的瘿果的P. regalis死亡蛹进行基因分析，使用诊断性多重PCR检测蛹中是否存在P. ponerophaga的DNA痕迹。如果在蛹中检测到P. ponerophaga的DNA，则认为寄生尝试失败（宿主被攻击但未成功发育出后代）。
从单个P. regalis蛹中提取基因组DNA，使用蓝色聚丙烯研棒进行研磨，并按照制造商的协议使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒进行提取，除了裂解步骤持续15小时。此外，使用相同的协议从实验室饲养的P. ponerophaga成虫中提取DNA，作为诊断性多重PCR的阳性对照。使用NanoDrop 2000c分光光度计（ThermoScientific Inc., Waltham, MA, USA）测量提取的DNA浓度。诊断性多重PCR使用三种微卫星引物组（Pslo4、Pslo14和Pslo20）在单个反应管中进行。这些微卫星标记最初是为P. lounsburyi开发的，但后来发现它们也能在P. ponerophaga中扩增（Bon等人，2008年）。PCR反应液的总体积为10μl，包含5μl的Master Mix（2×Qiagen Multiplex PCR Master Mix, Qiagen, Hilden, Germany）、每种引物0.2μl（10μM浓度）、1.8μl的分子级H2O和2μl的DNA模板。PCR扩增程序包括95°C下的初始变性步骤15分钟（用于激活HotStarTaq DNA聚合酶），接着是40个循环的94°C变性30秒、60°C退火60秒和72°C延伸60秒；最终延伸在60°C下进行30分钟。扩增产物（5μl）在含有SybrSafe™凝胶染料（Invitrogen Inc., Waltham, MA, USA）的2%琼脂糖凝胶中通过电泳分离，并使用FastGene 50bp DNA Marker（Nippon Genetics）在Fusion FX7成像系统（Vilber, Marne la Vallée, France）上可视化。多重PCR扩增后，P. ponerophaga寄生蜂或被这种寄生蜂寄生的蛹显示出304bp（Pslo20）、224bp（Pslo14）和126bp（Pslo4）的三条带状图案。未显示这种三条带状图案的蛹被认为是未被寄生的（图S1）。共有37个P. regalis蛹（每个寄生蜂种群17个蛹加上3个未暴露于寄生蜂的对照蛹）经过了P. ponerophaga DNA的分子检测程序。
从巴基斯坦收集的蛹中提取的其他膜翅目寄生蜂的基因组DNA，使用Folmer的引物（Folmer等人，1994年）对COI基因标记（658bp）进行DNA条形码分析。使用BOLD Identification Engine和Genbank中的Blast（Basic Local Alignment Search Tool）进行基于DNA的鉴定。
**寄生蜂对B. oleae的效果分析**
使用非参数Wilcoxon秩和检验（α=0.05）分析了寄生蜂对B. oleae的效果（产生寄生蜂后代的测试百分比、产生的后代数量、寄生率、性别比例）。由于未转换的数据不符合正态分布，因此使用了非参数检验。为了探讨两种P. ponerophaga种群可利用的宿主数量与寄生率之间的关系，构建了一个双因素ANOVA（α=0.05），以产生的寄生蜂数量为因变量，P. ponerophaga种群（饲养或野生）为离散变量，宿主数量为连续变量，以及两者的交互作用。数据经过平方根转换以满足模型的假设。对于P. regalis的宿主利用测试，提供了成功寄生、寄生失败（非目标宿主蛹中存在寄生蜂DNA但未出现寄生蜂）的发生次数以及两种寄生蜂种群的寄生率的描述性统计。使用单独的非参数Wilcoxon秩和检验（α=0.05）以及具有二项分布和logit链接函数的广义线性模型（GLM），以在果实/瘿果上的观察结果（是/否）为因变量，寄生蜂种群和宿主处理（橄榄或P. regalis瘿果）为独立变量，比较了P. ponerophaga在橄榄和P. regalis瘿果上的观察频率差异。所有统计分析均使用JMP® Pro 15（SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989–2023）进行。
**结果**
**野生橄榄中P. ponerophaga的寄生效果**
从收集的2655个B. oleae蛹中，记录到较高的蛹死亡率（69.5%），共有363只P. ponerophaga成虫从这些蛹中孵化出来，总体寄生率为44.8%。还有三种其他膜翅目寄生蜂从蛹中孵化出来，数量非常少（总共4只），通过结合形态学检查和条形码推断鉴定：2只属于Diachasmimorpha longicaudata（Hymenoptera: Braconidae）的个体，1只属于Ichneumonidae科的未鉴定物种的个体，以及1只属于Chalcidoidea总科的未鉴定物种的个体（图S2）。
**P. ponerophaga种群对商业橄榄中B. oleae的寄生效果**
在166次测试中（81次使用饲养种群，85次使用野生种群），产生至少一只寄生蜂后代的测试百分比野生种群高于饲养种群（分别为88.2%和76.5%，χ2=3.93，P=0.048）。野生种群可利用的宿主数量显著高于饲养种群（分别为10.6±7.0和7.0±0.4，χ2=33.1，P<0.001）。野生种群产生的后代平均数量高于饲养种群（分别为4.6±0.3和2.2±0.2，χ2=30.7，P<0.0001），以及平均寄生率（分别为52.3±3.2和36.6±3.4，χ2=12.0，P<0.001）和产生的雌性后代百分比（分别为59±3.0和35±5.0，χ2=17.5，P<0.001）（表1）。未暴露于寄生蜂的橄榄的对照测试总是产生至少一只B. oleae蛹。一个ANOVA模型探讨了P. ponerophaga种群和可利用宿主数量对产生的寄生蜂数量的影响，结果显示这两个因素都对产生的寄生蜂数量有影响（完整模型：R2=0.28，F3,162=22.5 P<0.0001；种群效应：F1,162=6.05，P=0.01；宿主数量效应：F1,162=33.0，P<0.0001），以及两者之间的交互作用（F1,162=4.90，P=0.03）。交互作用项显著表明，每增加一个宿主产生的寄生蜂数量增加的速率在两种种群之间有显著差异：实际上野生种群的增加率是饲养种群的两倍（图2）。
**表1：使用两种Psyttalia ponerophaga种群对受Bactrocera oleae感染的橄榄进行的无选择测试总结（平均值±标准误差）**。寄生率：[孵化的寄生蜂数量/(孵化的寄生蜂数量+孵化的蝇类数量)]×100。信件表明两个种群之间存在显著差异（对于“至少产有一只后代的测试次数”这一变量，采用双样本比例假设检验；对于所有其他变量，采用非参数Wilcoxon检验，α = 0.05）。
图2：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。
**B. oleae数量与P. ponerophaga两个种群在无选择测试中产生的寄生虫后代数量之间的相关性**（饲养种群：红色圆圈；野生种群：蓝色菱形）。数据点及其线性拟合线以及拟合线的方程式均已显示（饲养种群：红色实线；野生种群：蓝色虚线）。
**P. regalis的宿主利用测试**：无选择测试显示，P. ponerophaga的两个种群都能成功寄生这种非目标物种。在用饲养种群进行的16次测试中，共出现了8只P. regalis苍蝇和1只雄性寄生虫（表2）。相比之下，在用野生种群进行的24次测试中，共出现了26只苍蝇和10只寄生虫（8只雌性和2只雄性）。与寄生虫测试同时进行的是，共有10个虫瘿未受到寄生虫的影响，被用作对照组：其中8个虫瘿至少有1只P. regalis苍蝇出现（表2）。对Cape-ivy虫瘿的解剖显示，在用饲养种群进行的测试中，有22个虫瘿中的蛹死亡，在用野生种群进行的测试中，有33个虫瘿中的蛹死亡。对这些蛹的遗传分析结果显示，其中29.4%（5/17）含有P. ponerophaga的DNA（来自饲养种群的测试），47.1%（8/17）含有P. ponerophaga的DNA（来自野生种群的测试），这表明有寄生尝试失败的情况。测试后的虫瘿解剖还发现许多虫瘿中没有任何P. regalis幼虫或蛹，这些测试因此被视为无效。在无选择测试中，大多数受到寄生虫影响的虫瘿至少含有1个P. regalis蛹（饲养种群：连续测试非目标→宿主：70%，连续测试宿主→非目标：90%；野生种群，非目标→宿主：65.4%），但野生种群的连续测试宿主→非目标中，只有31.2%的虫瘿至少含有1个P. regalis蛹（表2）。在连续暴露测试中，寄生在受B. oleae侵染的橄榄上的寄生虫能够在大多数测试中产生至少1只可存活的后代（连续测试非目标→宿主：饲养种群，80%，n = 10；野生种群，95.6%，n = 23；连续测试宿主→非目标：饲养种群，60%，n = 10；野生种群，53.3%，n = 15），这表明它们在生理上能够寄生宿主。然而，由于这一系列测试中观察到了异常高的B. oleae死亡率（70%），可能是由于使用了一批质量较低的橄榄，因此需要对野生种群的结果持谨慎态度。
**Parafreutreta regalis进行的P. ponerophaga宿主利用测试**：连续nt→h：将1只P. ponerophaga暴露于1个Cape-ivy虫瘿（非目标）48小时后，再暴露于3个受侵染的橄榄（宿主）48小时。连续h→nt：先暴露于宿主48小时，再暴露于非目标48小时。选择测试：同时暴露于1个Cape-ivy虫瘿和3个受侵染的橄榄48小时。阴性对照：未暴露于寄生虫的单独Cape-ivy虫瘿。如果虫瘿中至少发现1只P. regalis蛹或苍蝇，则测试被视为有效。寄生率计算公式为[产生的寄生虫数量/(产生的寄生虫数量+产生的苍蝇数量)×100]。数字仅表示来自Cape-ivy虫瘿的昆虫出现数据。
**P. ponerophaga在宿主利用测试中的行为观察**：在无选择测试期间，寄生虫在橄榄上的出现频率显著高于在Cape-ivy虫瘿上的出现频率（34.0±2.2%，平均值±标准误差，χ2 = 106.9，自由度=2，P < 0.0001）（图3）。两个寄生虫种群在橄榄上的出现频率相当（饲养种群：35.9±2.9；野生种群：34.0±2.2，χ2 = 1.3，自由度=1，P = 0.26）；在Cape-ivy虫瘿上的出现频率也相当（饲养种群：8.3±3.3；野生种群：8.7±2.8，自由度=1，χ2 = 0.04，P = 0.84）。广义线性模型（GLM）模型确认处理方式（橄榄或Cape Ivy虫瘿）对P. ponerophaga的出现频率有显著影响，但寄生虫种群的影响不显著（完整模型：χ2 = 8.2，P = 0.04；处理效应：χ2 = 6.0，P = 0.01；寄生虫种群效应：χ2 = 2.9，P = 0.08）。
**图3**：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。
**无选择测试期间，饲养种群和野生种群的P. ponerophaga雌性在Cape-ivy虫瘿和橄榄上的出现频率**。***表示在两个种群中，橄榄上的出现频率显著高于Cape-ivy虫瘿或苦樱桃（P < 0.0001）；N.s. = 不显著（Wilcoxon秩和检验，α = 0.05）。
**讨论**：橄榄果蝇是橄榄的主要害虫，尽管已经做出了大量努力来开发可持续的控制管理策略，但仍迫切需要找到有效的生物控制剂来限制其在橄榄园中的影响。我们的研究表明，独居内寄生虫P. ponerophaga的饲养历史（野生种群与在人工宿主上大规模饲养的种群）影响了其在商业橄榄上攻击B. oleae的表现：野生种群的寄生率总体更高，每宿主的寄生效果更好，并且产生的雌性后代更多。同时，两个寄生虫种群在无选择测试条件下也成功寄生了P. regalis（表S1）。对野生种群进行的额外测试还显示，在选择测试条件下也成功寄生了P. regalis（表S2）。对R. fausta的测试表明，这两个寄生虫种群也能寄生这种非目标物种（表S2），但由于有效重复次数太少，无法进一步解释数据。
为获得野生种群的P. ponerophaga所做的努力提供了有关巴基斯坦B. oleae寄生虫群落的宝贵信息。P. ponerophaga在从B. oleae蛹中出现的寄生虫中的优势表明，它可能是巴基斯坦B. oleae的重要寄生虫（Wang等人，2021年），尽管需要更广泛的采样才能得出这一结论。野生种群的P. ponerophaga在商业橄榄上寄生B. oleae的成功率高于饲养种群。研究中用于衡量寄生程度的所有指标（产生寄生虫后代的测试次数、产生的后代数量、寄生率和性别比例）在野生种群中都显著更高。然而，野生种群的宿主可用性也更大，这限制了这一比较的结论性。野生种群表现更优的关键证据来自于根据可用宿主数量分析寄生率的结果，结果显示随着宿主数量的增加，野生种群能够寄生更多的宿主（图2）。这一结果与研究实验室长期适应如何影响昆虫表现的研究一致（Hoffmann & Ross，2018年），可能源于大规模饲养和使用人工宿主的单独或综合影响。大规模饲养的寄生虫种群在B. oleae上的表现下降具有直接的应用意义。由于其看似次优的繁殖输出和较低的寄生成功率，与野生个体相比，饲养种群在新环境中的建立和传播可能会受到限制（Mason，2021年）。本研究未关注的额外生活史特征和生理或行为参数（例如寿命、终生繁殖力、飞行能力、对环境变化的适应等）也可能受到在人工宿主上大规模饲养的影响，需要进一步探索以全面评估这种饲养方法对P. ponerophaga的净正面和负面影响。还应注意的是，与长期实验室饲养相关的效应不太可能是不可逆的，因为经典生物控制剂在适应新环境时可能会失去或获得新的特征（Bertin等人，2017年；Roderick & Navajas，2003年）。
数据并不支持“由于在人工宿主上长期饲养，饲养种群的P. ponerophaga更有可能攻击非目标宿主”的假设，但由于感染率低和有效测试数量少，这些结果的解读存在局限性。为了得出关于P. ponerophaga种群宿主利用模式的结论，进行更多控制更严格的果实感染水平的额外实验是明智的。
宿主利用实验的核心发现是，两个P. ponerophaga种群都能在两种非目标宿主体内成功寄生和发育，分子分析还揭示了更多寄生尝试失败的情况。此外，在无选择测试期间，两个种群的寄生虫在橄榄上的出现频率远高于在Cape-ivy虫瘿上的出现频率。由于橄榄的感染程度高于苦樱桃和Cape-ivy虫瘿，因此无法确定寄生虫在橄榄上花费更多时间是因为橄榄本身更具吸引力，还是因为橄榄中含有更多潜在宿主。来自宿主幼虫的化学信号或由幼虫取食引起的信号可能使橄榄更具吸引力。进一步的测试将有助于进一步探索P. ponerophaga与其饲养历史相关的行为变化（Canale & Benelli，2012年）。
P. ponerophaga在控制条件下成功攻击这两种非目标宿主并不一定意味着这些非目标物种在自然条件下也会面临风险。虽然实验室无选择测试有助于了解寄生虫的基本宿主范围（Murray等人，2010年），但它们并不一定能可靠地指示寄生虫在现实条件下的宿主选择（Lenteren等人，2006年）。许多生态障碍，如物候不同步或栖息地特化，可能会阻止寄生虫接触到某些非目标宿主（Haye等人，2024年；Nadel等人，2009年）。因此，寄生虫的基本宿主范围通常大于其在自然环境中的实际宿主范围（Cock等人，2021年；Haye等人，2005年）。在我们的研究系统中，三种测试物种的宿主植物（B. oleae、R. fausta和P. regalis）通常不生活在同一栖息地中。商业橄榄树适应地中海气候，在温暖干燥且阳光充足的栖息地中生长良好。而苦樱桃树P. emarginata则偏好较凉爽的栖息地、湿润的森林，通常生长在溪流旁或山坡上。Cape-ivy也是一种特定栖息地的植物。在加利福尼亚，它已在连续湿润的环境中建立并扩散，如河岸栖息地和含水量高的土壤中。因此，空间和生态障碍可能会在自然条件下消除或减少P. ponerophaga与R. fausta和P. regalis之间的相遇。这种寄生虫可能对这两种非目标物种的种群密度产生长期影响的可能性并非不存在，但鉴于过去几十年引入外来寄生虫的情况（Driesche & Hoddle，2017年；Haye等人，2024年），这种可能性并不明显。
分子检测工具在生物控制领域得到了越来越多的开发和应用（Gariepy等人，2007年，2019年；Gaskin等人，2011年）。我们的研究表明，这些工具可以补充控制条件下宿主利用生物测定的结果，并有助于评估非生殖性死亡（Desurmont等人，2020年；Hepler等人，2020年）。我们开发的方法用于检测非目标宿主死亡蛹中的P. ponerophaga DNA，使我们能够发现寄生尝试失败的情况，并将其与自然蛹死亡区分开来。特别是，饲养种群主要导致P. regalis幼虫的非生殖性死亡，而野生种群更有可能在这种非目标宿主体内成功发育。
总之，在人工宿主上大规模饲养寄生虫在控制条件下有利于应用生物控制，特别是在释放前的大规模生产背景下。然而，这种方法可能会对生物控制剂的适应性、表现和行为产生意想不到的影响，从而削弱它们在其引入地区建立和调节害虫种群的能力。我们的研究结果表明，在人工饲养的宿主上大规模繁殖后，寄生蜂在目标宿主上的表现会下降。数据并未支持“饲养历史会影响寄生蜂对非目标物种的选择”这一假设，但由于样本量有限，无法得出明确结论，因此需要进一步研究。在假设将P. ponerophaga的饲养种群引入北美的情况下，可能会发生快速的进化过程，这些过程有可能抵消饲养历史带来的影响。
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