摘要
肾结石（KS）是一种复杂且全球普遍存在的疾病；然而，其形成机制尚未完全明了。炎症反应和晶体聚集被认为是肾结石发病机制中的关键因素。白细胞介素-6（IL-6）被广泛认为是炎症介质；然而，它对草酸钙（CaOx）肾结石形成的具体贡献尚未完全阐明。本研究旨在探讨IL-6影响草酸钙肾结石形成的详细机制。为此，通过给大鼠饮用含有1%乙二醇（EG）的水来建立草酸钙肾结石模型。同时，通过用草酸钙一水合物（COM）晶体处理人肾近端管状上皮细胞（HK-2）来建立体外细胞损伤模型。利用各种分子生物学和免疫学技术，全面研究了IL-6在草酸钙结石形成中的具体作用。数据表明，在体内和体外草酸钙肾结石模型中，IL-6的表达显著升高。IL-6的增加加剧了结石形成过程中的炎症反应，触发了p38 MAPK信号通路的激活，并促进了骨桥蛋白（OPN）和CD44的表达水平升高。这些分子变化增强了肾管状上皮细胞（RTECs）与晶体之间的粘附，从而促进了晶体聚集、成核并加速了结石的形成。总之，研究表明IL-6通过激活p38 MAPK信号通路、放大炎症并促进晶体-细胞粘附来加速草酸钙肾结石的发展。因此，IL-6成为干预草酸钙肾结石的有希望的治疗靶点。
引言
肾结石（KS）是一种全球普遍存在的慢性疾病，具有高发病率和复发率。在五种主要类型的肾结石中，草酸钙（CaOx）结石占最大比例。目前对其发病机制的理解主要集中在两个方面：尿液成分的改变和炎症氧化应激（OS）途径。流行病学研究表明，中国肾结石的患病率约为6.4%，大约每17个成年人中就有1人受到影响。重要的是，31至60岁的男性患病率显著高于女性[1,2,3]。在北美，肾结石的患病率约为7%至13%，而欧洲的报告数字在5%至9%之间[4]。尽管采取了积极的治疗措施，肾结石的复发率仍高达50%[5]。这一限制是因为单独的机械碎石术或外科干预无法完全解决肾管细胞与晶体之间的炎症反应和粘附作用。因此，确定精确有效的分子靶点对于预防肾结石复发至关重要。作为关键的炎症细胞因子，IL-6在炎症中起着重要作用。先前使用EG诱导的草酸钙肾结石的小鼠模型研究表明，IL-6水平升高与OS标志物8-OHdG之间存在显著正相关。此外，抑制IL-6的释放可以减少肾炎症损伤，并显示出对尿酸结石形成的显著效果[6]。然而，这些观察结果背后的具体机制仍不确定。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一组丝氨酸/苏氨酸激酶，主要包括三个亚家族：细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK。MAPKs将细胞外信号传递到细胞核，协调细胞对多种刺激的反应。最近的研究发现，在肾结石的大鼠模型中p38 MAPK的表达显著升高，表明其参与了肾结石的发病机制[7, 8]。
OPN是一种非胶原酸性糖蛋白，与结石病的发病机制密切相关。OPN作为一种炎症生物标志物，不仅与OS和炎症损伤有关，还通过其磷酸化形式促进肾上皮细胞与晶体的粘附，从而加速草酸钙晶体的聚集，进而加速结石的形成[9, 10]。CD44是一种I型跨膜糖蛋白，作为关键的细胞表面粘附分子，介导细胞粘附、迁移和炎症。表现出CD44表达增加的实验模型进一步证实了其在草酸钙肾结石发病机制中的关键作用[11, 12]。基于这些发现，我们假设IL-6通过p38 MAPK信号通路介导与草酸钙肾结石相关的炎症和组织损伤，从而影响肾结石的进展。这项研究证实了IL-6激活p38 MAPK信号通路，上调OPN和CD44的表达，放大炎症反应，并增强晶体与细胞的粘附，最终促进草酸钙结石的形成。这些发现强调了阐明发病机制和改善草酸钙肾结石治疗策略的有希望的治疗靶点。
材料与方法
**动物实验**
本研究中的所有动物程序均获得了广西医科大学动物伦理委员会的批准。使用了6周大的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，无特定病原体，体重在160–200克之间。动物在标准化实验室条件下饲养，并在实验前一周进行适应。每个实验组由六只大鼠组成，具体安排如下：
(1) 对照组（RC组）：大鼠连续28天饮用正常饮用水，并在指定时间点接受等体积的正常盐水腹腔注射。
(2) 草酸钙肾结石组（EG组）：大鼠连续28天饮用含有1% EG的饮用水（CAS: 107-21-1），并在指定时间点接受正常盐水腹腔注射。
(3) IL-6纯化蛋白干预组（RI组）：大鼠接受重组大鼠IL-6蛋白（MCE，Cat# HY-P7103A）的腹腔注射，剂量为100 µg/kg，间隔14天注射两次，总持续时间为28天。
(4) p38 MAPK抑制剂干预组（RS组）：大鼠接受p38 MAPK抑制剂SB203580（MCE，Cat# HY-112349）的腹腔注射，剂量为5 mg/kg，间隔14天注射两次，总持续时间为28天。
(5) IL-6和p38 MAPK抑制剂联合干预组（R + I + S组）：大鼠同时接受重组大鼠IL-6（100 µg/kg）和p38 MAPK抑制剂SB203580（5 mg/kg）的腹腔注射，间隔14天注射两次，总实验时间为28天。
实验结束后，大鼠通过过量戊巴比妥钠实施安乐死。收集肾脏组织并储存在-80°C下以供后续分析。
**细胞培养**
人肾近端管状上皮细胞（HK-2）来自中国上海的一个政府认证的细胞库。细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中培养，条件标准。当细胞达到约80%汇合度时，用胰蛋白酶解离，重新悬浮，计数后均匀接种到10厘米培养皿中。在干预前让培养物稳定。重组人IL-6蛋白（MCE，Cat# HY-P7044）、SB203580（MCE，Cat# HY-112349）和COM晶体（Shyuanye，Cat# S66467-500 g）溶解在培养基中以供后续使用。
**细胞分组和干预**
使用0、0.5、1.0、1.5和2.0 mM浓度的COM建立体外HK-2细胞损伤模型，确定1.0 mM为进一步实验的最佳浓度。各组如下：
(1) 对照组（CC组）：在标准条件下培养细胞，不进行干预。
(2) 草酸钙干预组（COM组）：细胞在80%-90%汇合度时用1.0 mM COM处理24小时。干预后收集细胞。
(3) IL-6纯化蛋白干预组（CI组）：细胞在80%-90%汇合度时用20 ng/mL重组人IL-6处理24小时，干预后收集细胞。
(4) p38 MAPK抑制剂干预组（CS组）：细胞在80%-90%汇合度时用20 µmol/L p38 MAPK抑制剂（SB203580）处理24小时，干预后收集细胞。
(5) IL-6和p38 MAPK抑制剂联合组（C + I + S组）：细胞首先用20 µmol/L p38 MAPK抑制剂处理2小时，然后加入重组人IL-6蛋白（20 ng/mL）处理24小时，再收集细胞。
(6) 草酸钙 + IL-6干预组（COM + I组）：细胞首先用1 mM COM处理24小时，然后加入重组人IL-6（20 ng/mL）处理24小时，再收集细胞。
(7) 草酸钙 + p38 MAPK抑制剂干预组（COM + S组）：细胞首先用20 µmol/L p38 MAPK抑制剂处理24小时，然后加入1 mM COM处理24小时，再收集细胞。
(8) 草酸钙 + IL-6 + p38 MAPK抑制剂组（COM + I + S组）：细胞同时用重组人IL-6（20 ng/mL）和20 µmol/L p38 MAPK抑制剂处理24小时，然后加入1 mM COM处理24小时，再收集细胞。
**基因调控**
为了抑制IL-6表达，构建并购买了特定的siRNA质粒（Sea Star Biotechnology Company）。siRNA质粒溶解在DEPC处理过的水中。转染时，将5 µL siRNA与15 µL无血清培养基混合并孵育5分钟。另外，将5 µL Lipofectamine 3000转染试剂（Living，Cat# C1055）与15 µL无血清培养基（Biosharp，Cat# BL1524B）混合。稀释后的siRNA和转染试剂轻轻混合，孵育20分钟形成复合物，然后加入培养在无血清培养基中的HK-2细胞中。细胞在标准条件下孵育6–8小时，然后更换为新鲜完全培养基再持续24小时。恢复后，去除培养基，细胞接受COM干预（1 mM）24小时，再进行后续分析。
**细胞-晶体粘附**
实验处理前，吸出培养基，向细胞中加入3 mL Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS，Solarbio，Cat# H1025）。样品在轨道摇床上以150 rpm振荡2分钟，重复四次。然后补充HBSS，并立即使用倒置显微镜观察和记录样品。使用ImageJ软件（版本1.53s，美国）量化残留晶体面积。
**Von Kossa染色**
石蜡包埋的肾脏切片脱蜡、复水并冲洗。切片在紫外光下用5%硝酸银处理10分钟，然后彻底清洗。用5%硫代硫酸钠去除残留的银。用核快红或苏木精复染后，切片脱水、透明处理并封片。在显微镜下，钙沉积物呈现黑色或深棕色，便于评估肾脏组织病理学和晶体沉积。
**定量实时逆转录PCR（qPCR）**
使用RNAiso Plus试剂（TAKARA，Cat# 9108）从培养的HK-2细胞和大鼠肾外髓质组织中分离总RNA。使用PrimeScript™ FAST RT试剂盒和gDNA Eraser（TAKARA，Cat# RR092A）合成互补DNA（cDNA），以去除潜在的基因组DNA污染。使用TB Green® Premix Ex Taq™ II FAST试剂盒（TAKARA，Cat# CN830A）在SYBR Green检测平台上进行定量实时PCR（qPCR）（Gentier，中国）。目标基因的相对表达水平归一化到GAPDH或β-actin的几何平均值，并使用2−∆∆Ct方法进行量化。引物序列见表1。
**Western blotting（WB）**
使用RIPA缓冲液（Solarbio，Cat# R0010）和PMSF（Solarbio，Cat# P0100）及磷酸酶抑制剂（Solarbio，Cat# P1260）从培养细胞和大鼠肾外髓质组织中制备总蛋白提取物。确定蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE（Seven，Cat# SW143-02）分离等量的蛋白质。然后将蛋白质转移到预先用甲醇活化的PVDF膜（Millipore，Cat# IPVH00010）上。封闭和洗涤后，膜在4°C下与针对IL-6、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK、OPN、CD44和GAPDH的一抗孵育过夜（表2）。用TBST洗涤六次后，膜与适当的二抗孵育1小时。后续洗涤共进行了六次，然后使用Meilunbio试剂盒（目录号MA0186-1）进行化学发光检测，并在Tanon红外成像系统（中国制造）上进行可视化。蛋白质条带的强度使用ImageJ软件进行量化，以GAPDH作为内部对照进行标准化。
**免疫组化（IHC）**
肾脏组织标本先用福尔马林固定，然后进行石蜡包埋并切片。切片经过三次蒸馏水洗涤，随后进行抗原修复和封闭处理。它们在4°C下过夜孵育（≥12小时）以与p38 MAPK和OPN的初级抗体结合（表2）。洗涤后，加入适当的二级抗体。切片随后进行显色、复染、分化、脱水并装片。阳性染色区域在光学显微镜下使用ImageJ软件进行量化。
**免疫荧光（IF）**
对于免疫荧光分析，石蜡包埋的切片依次进行切片、脱蜡，并进行抗原修复和封闭处理。切片在室温下过夜孵育与p38 MAPK和OPN的初级抗体结合（表2）。经过充分洗涤后，在37°C下加入相应的二级抗体。切片用PBS冲洗，用DAPI复染，然后装片。荧光图像使用荧光显微镜获取，平均荧光强度使用ImageJ软件进行量化。
**细胞活力**
细胞活力使用CCK-8试剂盒（Biosharp，目录号BS350B）进行评估。处理后，移除培养基，并向每个孔中加入预先准备好的CCK-8溶液。孵育1小时后，使用微孔板读数仪测量450nm处的吸光度。细胞活力计算公式为：（处理组的吸光度 - 空白的吸光度）/（对照组的吸光度 - 空白的吸光度）。
**酶联免疫吸附测定（ELISA）**
IL-6浓度通过ELISA（JONLNBIO，目录号JL14113）进行测定。样品和标准品与试剂混合物孵育后，使用微孔板读数仪在450nm处测量吸光度。
**统计分析**
所有统计分析均使用GraphPad Prism（版本9.0.0）进行。数据以平均值±SEM表示。两组之间的比较使用Student’s t检验进行，而多组比较则使用单因素方差分析（ANOVA）。p值<0.05被认为具有统计学意义，其中*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示不同的显著性水平。
**表1** 用于逆转录聚合酶链反应的引物对
**表2** 本研究中使用的抗体
**结果**
在CaOx肾结石（CaOx KS）中，IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的表达水平显著升高。
为了研究这些分子变化及其调控机制，首先建立了一个稳定的大鼠模型。SD大鼠被给予含有1% EG的饮用水28天，以建立CaOx肾结石模型。Von Kossa染色显示模型组的肾组织中有明显的CaOx晶体沉积（图1A、C）。Western blot（WB）和qPCR分析显示模型组中IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的蛋白质（图1B、D-H）和mRNA（图1I-L）水平显著升高。这些结果证实了在CaOx结石形成过程中这些分子的同时上调。
**补充的体外实验**
为了验证这些发现并优化条件，HK-2细胞暴露于COM（一种化合物）24小时。IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的表达随着COM浓度的增加而逐渐升高，在1.0 mM时达到峰值，然后在更高剂量下下降。1.0 mM的浓度在蛋白质（图1M-R）和mRNA水平（图1S-V）上显示出最高且最稳定的表达。因此，选择1.0 mM的COM作为后续体外机制研究的最佳浓度。
**图1**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**图1的全尺寸图像**
含有CaOx结石的肾组织中IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的表达水平升高。A、C：Von Kossa染色的代表性图像（A）和定量数据（C）显示对照组和EG组肾脏中的钙沉积。B、D-H：Western blot（B）和定量分析（D-H）显示IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的蛋白质表达。I-L：qPCR分析显示IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的mRNA表达。M-R：Western blot（M）和定量数据（N-R）显示HK-2细胞在逐渐增加的COM浓度下的蛋白质表达水平。S-V：qPCR结果显示HK-2细胞在不同COM浓度下的mRNA表达水平。
**在细胞水平上，IL-6通过p38 MAPK途径正向调节OPN和CD44的表达**
为了阐明IL-6对p38 MAPK途径及其下游效应分子OPN和CD44的调控机制，将重组大鼠IL-6蛋白、p38 MAPK抑制剂（SB203580）或两者腹腔注射给SPF级Sprague-Dawley大鼠。WB和qPCR分析（图2A-J）显示EG模型组和IL-6处理组的IL-6表达增加。这些观察结果证实了结石形成过程中的强烈炎症反应，表明IL-6是肾结石中的关键炎症介质。
**进一步分析显示**
IL-6处理显著上调了EG组中IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的表达。单独使用IL-6处理显著增加了p-p38 MAPK、OPN和CD44的表达，表明IL-6有效激活了p38 MAPK途径及其下游的结石相关分子。相反，SB203580处理显著抑制了p38 MAPK和p-p38 MAPK的表达，并降低了OPN和CD44的水平，表明有效抑制了该途径。
**IHC和IF染色在肾组织中证实了这些关系**
OPN和p38 MAPK的表达水平在EG组中最高，在IL-6组中较低，而SB203580处理后显著降低。IL-6和SB203580联合处理进一步降低了OPN和p38 MAPK的水平（图2K-P）。这些组织水平的结果与蛋白质和mRNA的发现一致，加强了IL-6/p38 MAPK/OPN/CD44轴在CaOx KS形成中的作用。总体而言，这些发现表明IL-6激活了p38 MAPK途径，增加了磷酸化，并上调了OPN和CD44的表达，突显了其在肾结石发病机制中的关键调控作用。这项研究为结石形成的炎症机制提供了新的见解。
**图2**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**图2的全尺寸图像**
IL-6通过p38 MAPK依赖的机制上调OPN和CD44的表达。A-F：RC、EG、RI、RS和R+I+S组肾组织中IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的代表性免疫印迹（A）和定量数据（B-F）。G-J：通过qPCR量化肾组织中的mRNA表达水平。K-M：肾组织中OPN（L）和p38 MAPK（M）的代表性IHC图像（K）和定量分析（L, M）。N-P：IF图像（N）显示各组中的肾OPN（O）和p38 MAPK（P）表达。
**IL-6敲低抑制了COM干预后RTECs中的p38 MAPK途径激活并减少了OPN和CD44的表达**
为了阐明IL-6对CaOx肾结石形成的贡献，通过siRNA转染在HK-2细胞中沉默IL-6的表达。暴露于COM晶体后，评估了关键p38 MAPK途径蛋白的磷酸化和下游粘附分子OPN和CD44的表达。定量PCR显示IL-6敲低有效降低了培养上清液中的IL-6 mRNA水平和蛋白质分泌（图3A-E）。晶体粘附实验表明IL-6敲低显著减少了COM晶体对HK-2细胞的粘附（图3F-G）。从机制上讲，IL-6敲低减弱了p38 MAPK途径组分的磷酸化，并在转录和翻译水平上下调了OPN和CD44的表达（图3H-M）。这些发现表明IL-6通过激活p38 MAPK途径促进了CaOx结石的形成，从而增强了COM晶体在RTECs上的粘附和聚集。
**图3**
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**图3的全尺寸图像**
IL-6缺乏抑制了RTECs的粘附和细胞-晶体相互作用。A-D：siRNA介导的IL-6敲低后HK-2细胞中IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44 mRNA的表达的qPCR分析。E：HK-2细胞培养基中IL-6水平的ELISA测定（y=0.0136x+0.0757，R2=0.993）。F-G：HK-2细胞-晶体粘附的代表性图像（G）和定量分析（F）。H-M：IL-6敲低后IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的代表性免疫印迹（H）和相应定量分析（I-M）。
**基于体内发现，直接研究了IL-6与p38 MAPK途径之间的调控关系**
在HK-2细胞模型中检验了IL-6与p38 MAPK途径之间的直接调控关系。细胞暴露于1.0 mM的COM晶体以模拟肾结石微环境。WB分析（图4A-F）显示COM刺激后IL-6、总p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的蛋白质水平显著升高。在CI实验组中，重组人IL-6蛋白单独使用显著增加了p-p38 MAPK的水平，同时伴有OPN和CD44的表达升高。这些结果表明IL-6是p38 MAPK途径的上游激活剂，足以触发下游信号传导。相比之下，p38 MAPK抑制剂SB203580（CS组）有效抑制了p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的表达。值得注意的是，SB203580和IL-6联合处理显著逆转了IL-6诱导的p-p38 MAPK、OPN和CD44的增加。qPCR结果与这些蛋白质水平的变化一致（图4G-J）。总之，这些数据强烈表明IL-6激活了p38 MAPK途径，促进了CaOx KS形成中OPN和CD44的下游表达。
**图4**
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**图4的全尺寸图像**
IL-6过表达促进了CaOx晶体的沉积和肾结石的形成。A-F：RC、EG、RI、RS和R+I+S组肾组织中IL-6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、OPN和CD44的代表性Western blot（A）和相应定量数据（B-F）。G-J：通过qPCR量化肾组织中的mRNA表达水平。
**IL-6通过p38 MAPK途径诱导OPN和CD44的表达**
为了进一步阐明IL-6/p38 MAPK途径在CaOx KS发病机制中的作用，我们研究了药物抑制IL-6或p38 MAPK（SB203580）是否影响HK-2细胞在CaOx暴露下的炎症反应和晶体粘附。细胞-晶体粘附实验表明，COM单独使用导致明显的晶体粘附（图5A-B）。外源性重组人IL-6蛋白的补充显著增强了细胞表面的晶体聚集。相反，p38 MAPK信号传导的药物治疗显著减少了晶体粘附。重要的是，COM+IL-6+SB203580联合处理显著减少了晶体粘附。这些发现表明IL-6通过激活p38 MAPK途径促进了晶体沉积。
**细胞活力评估**
在各个实验组中评估了细胞活力（图5C）。ELISA分析显示COM+I组中的IL-6蛋白浓度增加。COM+I组中的IL-6水平中等，而COM+I+S组中的IL-6浓度最高（图5D）。这种现象可能是由于持续的p38 MAPK激活引发了负反馈机制来限制炎症。然而，SB203580的抑制消除了这种反馈控制，可能激活了额外的促炎途径，从而提高了IL-6的水平。
**WB和qPCR分析进一步支持了p38 MAPK信号通路在COM诱导的HK-2细胞炎症反应中的关键作用**
具体来说，暴露于1.0 mM的COM 24小时后，IL-6处理增加了IL-6表达和p38 MAPK激活（p-p38 MAPK升高）。IL-6处理（COM+I组）进一步增强了p-p38 MAPK的水平，表明IL-6正向调节p38 MAPK信号传导。相应地，下游蛋白OPN和CD44的表达也增加。p38 MAPK抑制剂（SB203580）的处理有效阻断了这一信号通路。在COM+I+S组中，SB203580强烈抑制了COM诱导的p38 MAPK磷酸化和OPN及CD44的表达。这些数据强烈表明IL-6通过p38 MAPK途径调节OPN和CD44的表达。他们的形成是一个多因素过程，涉及尿液过饱和、晶体成核、生长、聚集以及在肾脏组织中的滞留。最近的研究强调了炎症和氧化应激（OS）在结石形成中的关键作用[17, 18]。此外，细胞-晶体粘附被认为是CaOx结石形成的一个重要因素[19]。细胞-晶体粘附促进了分散的CaOx晶体在肾小管上皮细胞（RTECs）表面的聚集，这些晶体簇随后成为结石形成的核心。相反，研究表明，靶向抑制如CDH4[20]和硫氧还蛋白相互作用蛋白[21]等分子，或过表达HIBADH[22]，可以抑制细胞-晶体粘附，从而减少CaOx结石的形成。
CaOx肾结石是一种慢性病理状况。在早期阶段，大多数患者的CaOx晶体通常缺乏稳定的聚集和滞留能力，并通过尿液排出[23]。然而，残留的晶体可以损伤RTECs并破坏粘附分子的稳态。受损的上皮细胞会获得增强的粘附特性，促进更多的CaOx晶体在肾小管内滞留，并促进Randall斑块的形成[24]。Randall斑块是CaOx结石形成的理想成核位点，它们促进晶体粘附和逐渐聚集，最终导致结石形成[25, 26]。本研究表明，IL-6激活了p38 MAPK通路，从而上调了OPN和粘附分子CD44的表达。这一过程不仅加剧了炎症，还增强了晶体对RTECs的粘附，为CaOx肾结石提供了重要的分子机制见解。
通过体内和体外互补方法，我们观察到CaOx晶体沉积与IL-6表达升高、p38 MAPK通路激活以及OPN和CD44水平增加密切相关。这些因素的协调上调表明可能存在因果关系。作为多效细胞因子，IL-6在调节急性期反应和慢性炎症中起着核心作用[6, 27]。在多种肾脏疾病中都报告了IL-6表达升高，包括多囊肾病[28]、慢性肾病[29]和糖尿病肾病[30]。IL-6水平升高会激活NF-κB和PI3K/Akt通路，从而加剧炎症和氧化应激，加重肾脏损伤。相反，抑制IL-6的分泌可以缓解这些病理变化。IL-6介导的Wnt/β-连环蛋白通路的激活与炎症和肾小管间质损伤的严重程度相关[31]。此外，IL-6还通过AKT/ERK通路调节缺血/再灌注引起的肾脏损伤[32]。在酸性条件下，IL-6还与成纤维细胞相互作用。先前的研究表明，IL-6是肾小管间质-成纤维细胞相互作用的关键介质，从而促进炎症反应[33]。间充质细胞在组织修复和纤维化重塑中起着重要作用。同时，CaOx晶体沉积已被确定为肾间质纤维化的重要诱导因素[34,35,36]。这些发现表明IL-6介导的炎症、CaOx肾结石和肾纤维化之间可能存在潜在联系，需要进一步研究。
有趣的是，IL-6的作用可能取决于CaOx肾结石的不同阶段。IL-6/JAK/STAT3通路的激活会在D-氨基酸氧化酶（DAO）基因的启动子区域诱导DNA甲基化，从而通过表观遗传调控抑制其转录。DAO表达减少会降低内源性草酸的合成，降低高草酸尿的风险[27]。基于这些发现，我们提出CaOx晶体作为外部刺激物，可能会增加炎症介质如IL-6的表达，并激活先天免疫反应以维持组织稳态。如果刺激有限，身体的调节机制可能会进一步抑制草酸前体的产生并减少内源性草酸的合成。然而，IL-6显然作为炎症信号的关键启动因子，在炎症性疾病进展中起着重要的调节作用。在CaOx肾结石中，RTECs不仅是晶体诱导损伤的目标，也是炎症介质的主要来源。在本研究中，EG诱导的大鼠肾结石和暴露于CaOx晶体的HK-2细胞中，IL-6表达显著升高，这与临床观察和先前的报告一致。这些发现支持CaOx晶体作为“危险信号”的观点，激活RTECs上的模式识别受体，从而引发包括NLRP3炎性小体在内的先天免疫途径，导致促炎细胞因子如IL-1β和IL-6的分泌[36, 37]。这种晶体诱导的炎症微环境为晶体滞留和随后的结石生长提供了有利条件。
本研究的一个关键结果是确定了p38 MAPK通路作为IL-6下游的中心介质。该通路是细胞应激反应的多功能调节器，影响炎症、凋亡、自噬和纤维化等过程[7, 8, 38]。我们的研究表明，在CaOx肾结石模型中，p38 MAPK的磷酸化水平升高。值得注意的是，单独给予重组IL-6蛋白即可激活p38 MAPK并增加OPN和CD44的表达，这种效应在COM暴露下进一步增强。相反，使用特定抑制剂SB203580药理学抑制p38 MAPK，或通过siRNA基因敲低IL-6，可以有效逆转这些分子的上调，无论基线条件或结石形成刺激如何。这些结果表明，IL-6是p38 MAPK的关键上游激活因子，而p38 MAPK的激活对于OPN和CD44的表达是不可或缺的。这一信号通路具有重要的生物学意义，因为它建立了IL-6介导的炎症信号与涉及OPN和CD44的细胞粘附事件之间的直接分子联系。传统上，炎症和晶体粘附被认为是结石形成中相对独立的因素。然而，我们的发现表明，IL-6通过p38 MAPK通路将这两个过程功能性地耦合在一起，将它们整合到一个连贯的病理级联中。
OPN和CD44作为该通路下游效应物的作用值得进一步研究。已知OPN在肾脏炎症中具有双重功能，既具有促炎作用也具有保护作用。系统性的OPN通过抑制炎症和氧化应激来保护肾脏，而巨噬细胞来源的OPN则会促进组织损伤[39]。一项使用OPN敲除小鼠的研究表明，OPN介导了醛固酮引起的肾脏损伤，OPN缺乏可提供显著的保护[40]。在肾结石中，OPN同样表现出双重作用：一些研究表明OPN抑制晶体生长和聚集，具有保护作用[41]，而更多证据支持其促结石形成的作用[42,43,44,45]。这种差异可能是由于翻译后修饰和局部微环境等因素造成的。CD44是一种公认的关键粘附分子。其在炎症或氧化应激期间表达显著增加，增强细胞粘附。被CaOx晶体损伤的RTECs也表现出异常的CD44表达。值得注意的是，抑制CD44可以减少晶体粘附并抑制晶体聚集形成结石[46,47,48,49]。此外，miR-34a在HK-2细胞中靶向CD44，无论是在体外还是体内都能减少晶体粘附，表明IL-6和microRNAs在肾结石形成中的调节相互作用[12]。本研究表明，IL-6/p38 MAPK信号通路增加了OPN和CD44的表达。细胞-晶体粘附实验表明，IL-6刺激显著增强了CaOx晶体的粘附，而p38 MAPK抑制则减少了这种效应。总体而言，这些发现表明IL-6/p38 MAPK/OPN/CD44轴放大了炎症损伤，促进了晶体对肾上皮细胞的粘附，并阻止了晶体通过尿液流动清除。因此，这种机制促进了晶体在管腔内的滞留和生长，有助于结石的形成。持续的p38 MAPK激活还可能诱导肾小管细胞的上皮-间充质转化（EMT），促进细胞外基质的积累并损害基底膜完整性，从而促进晶体侵入肾间质[50]。此外，IL-6还促进了炎症细胞（包括中性粒细胞和巨噬细胞）的招募和激活，放大了局部促炎细胞因子环境。这种级联反应加剧了氧化损伤和纤维化，形成了与肾结石相关的慢性肾脏微环境，可能解释了高临床复发率[51, 52]。使用SB203580药理学抑制这一通路可以减少炎症和晶体粘附，突显了其在预防结石复发方面的治疗潜力。然而，考虑到p38 MAPK的广泛生理作用，需要针对肾脏的局部治疗来最小化临床应用中的脱靶效应。
本研究存在一些局限性。我们的研究主要集中在IL-6/p38 MAPK/OPN/CD44轴上。尽管使用了SB203580，但在体内和体外模型中IL-6表达仍然部分升高。对此有两种可能的解释：p38 MAPK的负反馈调节，或由于持续存在的炎症刺激（如CaOx晶体）导致p38 MAPK抑制后激活补偿通路。这些发现表明，肾结石涉及一个复杂的调节网络，NF-κB、NLRP3炎性小体和活性氧信号可能参与相互作用。需要进一步研究以阐明这些通路在本研究中确定的机制中的整合。此外，实验模型本身也存在局限性。EG诱导的模型主要导致皮质小管内的高草酸尿和晶体沉积，这种情况更接近肾钙质沉着症而非肾结石的自然进展。在人类中，结石通常与乳头导管相关，要么附着在Randall斑块上，要么附着在Randall栓子上。因此，人体肾脏中的晶体最初会接触集合管细胞。相比之下，HK-2细胞来源于近端小管，而人类结石形成发生在集合管中。来自不同小管段的细胞可能对晶体刺激和IL-6信号有不同的反应。为了更好地模拟人类结石的生理环境，应使用生理相关的动物模型或特定肾单位段的原代培养物（如人类肾集合管细胞或基于组织的Randall斑块模型）来验证这些发现。这些局限性指出了未来研究的重要方向。IL-6在CaOx肾结石不同阶段的潜在差异功能值得进一步探索。此类研究可能使用不同持续时间的动物模型进行外源性刺激，以模拟早期和晚期疾病阶段。此外，关于OPN双重作用的持续争议强调了澄清该通路中不同剪接变体或翻译后修饰的功能和调节机制的必要性。
本研究确定了一个机制途径，通过该途径CaOx晶体促进肾结石的形成。晶体沉积刺激RTECs分泌IL-6，加剧局部炎症并激活p38 MAPK信号通路。这导致OPN和粘附分子CD44的表达增加，增强了晶体对肾小管上皮的粘附，从而促进了晶体滞留和结石形成。这些发现加深了我们对炎症-粘附关系在结石形成中的理解。此外，该通路将细胞因子信号、激酶激活和粘附分子表达整合到一个连贯的病理框架中。重要的是，IL-6和p38 MAPK成为潜在的治疗靶点。未来针对高风险患者的预防策略可能包括抗IL-6抗体、IL-6受体拮抗剂或选择性p38 MAPK抑制剂。通过破坏这种炎症和粘附级联反应，这些干预措施可以有效减少CaOx结石的发生和复发。
结论
本研究首次提供了证据，表明在CaOx肾结石期间IL-6表达升高不仅加剧了RTECs中的晶体诱导炎症损伤，还促进了晶体滞留和结石形成。这些效应是通过激活p38 MAPK通路和随后OPN和CD44表达的上调来实现的，从而增强了晶体粘附和聚集。因此，IL-6和p38 MAPK是治疗或诊断CaOx结石的有希望的目标。
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