草酸钙（CaOx）是肾结石的主要成分，它以多种水合物形式存在，其中草酸钙三水合物（COT）是一种罕见且不稳定的相，据信它是热力学稳定的单水合物的过渡前体。在这项研究中，响应面方法（RSM）被应用于定量评估和预测温度、pH值和离子强度对COT形成的影响。响应面方法是一种结合了特定实验设计和数学建模的统计数据分析方法。通过光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和粉末X射线衍射（PXRD）对生成的沉淀物进行了表征。结果表明，在中等温度下COT的形成更为有利，而较高温度则促进草酸钙单水合物（COM）的形成；在所研究的条件下，离子强度没有显著影响。总体而言，温度被确定为控制CaOx水合物相选择的主要参数。
1. 引言
本研究的主要目的是探讨关键过程参数（特别是温度、pH值和离子强度）如何影响草酸钙水合物的结晶行为。通过系统地调节这些条件，我们评估了它们各自的效应以及它们对最终晶体相和形态的相互作用。利用响应面方法（RSM），我们确定了有利于两种主要水合物形成的条件：草酸钙单水合物（COM）和三水合物（COT）。对获得的晶体进行详细的形态和化学分析，有助于深入了解促进特定水合物形成的条件以及物理化学参数如何控制其生长和结构演变。生物矿化是一种普遍存在的自然过程，通过这一过程，生物体能够控制无机矿物的形成。这种能力早在35亿年前地球历史上就已出现，当时生物体发展出了受基因调控的矿化途径，以支持代谢功能并帮助适应环境压力。虽然不同物种的生物矿化过程存在差异，但它遵循一些共同的原则，例如生物大分子的作用、空间调控的成核过程以及前体相的频繁使用。在健康的系统中，矿物沉积受到严格控制，仅发生在特定的生理部位；而在心血管系统等软组织中则被抑制。相反，病理性矿化发生在通常不会钙化的组织中，这可能发生在疾病、受伤、炎症或衰老过程中。尽管对病理性矿化的研究较少，但它与生理性矿化具有重要的机制相似性，许多方面（包括矿物组成、细胞参与和调控途径）仍然是 active research 的主题。肾结石通常由大约90%的矿物物质和10%的有机成分组成。矿物部分包括草酸钙（CaOx）和磷酸钙（CaP）等含钙结石，以及鸟粪石、尿酸、胱氨酸、蛋白质结石以及通过药物结晶形成的结石。大多数结石的成分是异质的；对于混合结石，大约80%含有不同比例的CaOx和CaP，而由单一罕见化合物组成的结石相对较少。至少有1.7%到14.8%的人在其一生中会经历至少一次肾结石，五年内的复发率估计约为40%。草酸钙结石占诊断病例的80%以上。尿液中草酸钙的过饱和是结石形成的主要驱动力，这突显了理解结晶机制和抑制剂在预防策略中的重要性。草酸钙有四种伪多晶型：无水相、草酸钙单水合物（COM，即白 waiterite）、草酸钙二水合物（COD，即weddellite）和草酸钙三水合物（COT，即caoxite）。COM和COD是肾结石中最常见的相，而COT则较为少见。在尿液中，COM是热力学稳定的相，而COD是不稳定的，具有更高的溶解度。Caoxite与高草酸尿症相关，但其罕见的发生表明其形成可能涉及其他因素。从热力学角度看，COT非常不稳定，在体外条件下会在几小时内自发转变为COM。因此，在尿液结石中检测到COT意味着特定的尿液环境可能暂时稳定了这种本来不稳定的相。在大多数报道的案例中，COT与COM同时出现，表明其快速转变使得纯COT相的临床观察变得复杂。先前的研究表明，CaOx相的形成主要受pH值和过饱和度的控制，而温度通常保持恒定，离子强度则由溶液组成隐含决定。高过饱和度和升高的pH值有利于不稳定水合物（如COD）的形成，在极少数情况下还会形成COT。相反，低pH值、较低的过饱和度和长时间的陈化则促进热力学稳定的COM的形成。晶体大小、形态和相分布受到这些变量以及外部能量输入的强烈影响。这些发现强调了在研究CaOx结晶时仔细控制物理化学参数的必要性。像COD和COT这样的不稳定二水合物相可以作为COM的前体，它们的转变受到温度、pH值和离子组成的影响。理解这些转变至关重要，因为它们影响晶体形态和潜在的临床行为。草酸钙结晶主要产生COM和COD，其稳定性受环境条件的影响。温度起着特别重要的作用，因为在37°C的水介质中COD会通过明确的动力学途径转变为COM。许多实验在pH值约为6的条件下进行，表明pH值在CaOx沉淀中的重要性，尽管其具体贡献并未总是得到系统研究。离子组成进一步影响相的稳定性，因为结晶抑制剂（如柠檬酸和焦磷酸盐）可以通过与钙离子和特定晶面的相互作用来稳定COD并减缓其向COM的转变。水化过程也有贡献：COD含有弱结合的沸石水，可以与周围介质交换，触发结构重排，从而导致COM的形成。这些观察结果共同强调了温度、水化状态和离子相互作用在决定CaOx相行为中的综合重要性。热力学和动力学因素都影响CaOx结晶的抑制。羟基柠檬酸通过结合游离钙离子来降低过饱和度，这是一种热力学机制，而植酸则通过结合晶体表面来减缓成核和晶体生长，这是一种动力学效应。将抑制剂与不同的机制相结合可能会增强对结石形成的整体抑制效果。理解草酸钙相的形成和转变对于解释它们在生物和环境水系统中的存在至关重要。详细的结构和机制研究提供了不同水合物之间稳定性关系的见解，以及它们相互转化的途径。这些知识对于识别控制成核、生长和转变的物理化学条件至关重要，最终提高了我们在不同水条件下预测CaOx行为的能力。尽管取得了显著进展，但仍存在重要的知识空白。许多研究聚焦于在严格控制条件下孤立的参数，而温度、离子强度和溶液组成的综合效应则较少被系统探索。特别是温度和离子强度对CaOx形成的同时影响，以及它们与有机成分和络合配体的相互作用，包括对COT稳定性的影响，仍不够充分理解。解决这些空白对于弥合受控实验室实验与实际水环境之间的差距至关重要，在实际水环境中，多个参数相互作用以控制草酸钙的相行为。在这方面，本研究采用响应面方法（RSM）系统地评估关键物理化学参数的综合效应，并确定能够形成草酸钙三水合物（COT）的条件。重要的是，这种方法允许在不使用添加剂的情况下有针对性地合成纯相COT，这与大多数先前报道的系统不同，并为理解内在的形成途径提供了更清晰的框架。
2. 材料与方法
2.1 材料
本研究中使用的所有化学品均为分析级。沉淀实验的储备溶液使用从Gram-mol购买的盐酸（HCl）和氢氧化钠（NaOH）制备，草酸钠（Na2C2O4）和二水合氯化钙（CaCl2 × 2H2O）来自BDH Prolabo，氯化钠（NaCl）来自Kemika。通过用超纯去离子水（电导率< 0.055 μS cm−1）稀释CaCl2储备溶液来制备钙离子的工作溶液。每次实验都重新制备草酸根离子溶液，精确称量固体Na2C2O4并将其溶解在超纯去离子水中以达到所需浓度。通过添加适当的NaOH或HCl储备溶液来调整反应系统的pH值。所有储备溶液都使用常规分析技术进行标准化：CaCl2通过EDTA的复杂ometric滴定进行标准化，NaOH和HCl的标准溶液也相应进行了标准化。
2.2 沉淀实验
草酸钙的实验合成基于一种自发的沉淀方法，并对先前建立的协议进行了修改。每个反应系统都包含预定义浓度的钙离子（Ca2+，4.0 × 10−3 mol dm−3）和草酸根离子（C2O42−，0.7 × 10−3 mol dm−3）。溶液的pH值被调整到5.6到7.5的范围内。沉淀实验在三个控制的温度下进行：25 °C、36.5 °C和48 °C。反应在一个双夹套玻璃反应器中进行，并连接到恒温水浴以保持恒定温度。在混合之前，单独的钙和草酸溶液被平衡到目标温度并调整到所需的pH值。通过使用特氟龙涂层的磁力搅拌棒在恒定搅拌下快速混合等体积（200 cm3）的两种溶液来启动反应。使用连接数字pH计（HANNA HI 5522）的组合玻璃电极实时监测反应进程（pH值随时间的变化）。搅拌持续45分钟，以允许有足够的时间形成晶体。实验结束后，使用0.22 μm的Millipore膜过滤器过滤悬浮液。收集到的固体用少量去离子水冲洗，然后在真空干燥器中干燥。所有实验都进行了三次重复，以确保可重复性，结果报告了平均值。
2.3 数据分析
沉淀系统的初始过饱和度使用Visual MINTEQ 3.1软件计算（可在https://vminteq.com/免费获取）。过饱和度表示为饱和比S，定义为离子活度积Π = a(Ca2+)·a(C2O42−)与草酸钙单水合物（COM）或三水合物（COT）的热力学平衡常数Ksp的比值的平方根：SCOM或COT = (Π/Ksp)1/2。计算考虑了初始反应物浓度（ci）、温度（t）和初始pH值。为了保持恒定的离子强度（Ic），根据VMINTEQ模拟得到的值向系统中添加NaCl。如表S1所示，COM的计算初始饱和比范围为11.228 ± 1.970，而COT的值为6.799 ± 1.246。在给定的实验条件下，所有系统的初始过饱和度可以被认为是中等至高的。鉴于沉淀过程的性质，不同系统之间的数值变化被认为是微小的，因此认为过饱和度在所有实验中几乎是均匀的。
2.4 样品表征
为了识别水合物相并确定合成的草酸钙晶体的矿物组成，使用了多种分析技术，包括粉末X射线衍射（PXRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和显微镜。傅里叶变换红外光谱用于分析晶体结构的振动特性。每个干燥样品大约1–3毫克与IR级溴化钾（KBr）混合均匀。使用FTIR 8400S光谱仪（Shimadzu，京都，日本）在400–4000 cm−1的光谱范围内记录光谱。每个光谱代表20次扫描的平均值，光谱分辨率为4 cm−1。仪器配备了DRS 8000漫反射附件，数据处理使用IRsolution 1.30软件包进行。粉末X射线衍射图案使用PANalytical Aeris衍射仪（Malvern PANalytical，英国）在Cu Kα辐射（λ = 1.5418 Å）下获得，操作条件为40 kV和15 mA。数据在2θ范围10–60°内收集，步长为0.02°，发散狭缝为1°。相位鉴定是通过将衍射图案与晶体学开放数据库（COD）中的条目进行匹配来完成的，定量相位分析则是使用Rietveld精修方法和HighScore Plus软件（版本3.0）进行的。晶体形态和大致粒径是通过光学显微镜和扫描电子显微镜来观察的。光学观察是使用Motic B1光学显微镜（西班牙巴塞罗那）和Moticam 2数码相机进行的。扫描电子显微镜（SEM）是使用Thermo Fisher Scientific Apreo C SEM系统（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行的。对于SEM成像，少量样品使用碳胶带固定在铝制支架上。通过温和的氮气流去除松散的颗粒，以最小化背景干扰。
2.5. 钙草酸酯形成的响应面方法论和过程优化
为了确定最大化特定钙草酸酯水合物相（COM和COT）形成的最佳条件，应用了Box–Behnken实验设计方法的响应面方法论（RSM）。统计建模和分析是使用Design-Expert®软件（版本9，Stat-Ease Inc.，美国明尼阿波利斯）进行的。通过将二阶多项式模型（二次形式）拟合到实验数据上，评估了实验变量温度（X1）、pH值（X2）和离子强度（X3）与各个水合物相含量之间的关系。在模型拟合过程中没有应用数据转换。模型的适当性和显著性是通过方差分析（ANOVA）来评估的。所使用的回归模型的一般形式表示为方程（1）：
（1）
其中y代表预测响应（COM或COT的相对含量），β0是截距项，βi、βii和βij分别对应线性效应、二次效应和交互效应，Xi和Xj表示独立变量的编码水平（−1、0、+1）（如表1所定义）。表1
使用未编码和编码水平的独立变量进行RSM设计，以制备各个钙草酸酯水合物相（因变量；y）
独立变量
符号
水平
低（−1）
中心（0）
高（+1）
温度（°C）
X1
25
36.5
48
系统pH值
X2
5.60
6.55
7.50
离子强度（mol dm−3）
X3
0.01
0.05
0.10
这种建模方法不仅能够评估各个因素效应及其交互作用，还能够识别出提高所需水合物相产量的最佳实验条件。
3. 结果与讨论
3.1. 结构分析
表2总结了实验条件，每个条件都标记为一个单独的“运行”。为了清晰地展示结果，并增强结果的呈现，选择了一些代表性的运行（具体来说是运行1、3、9、11和13）进行详细讨论。表2
Box–Behnken实验设计和通过XRD分析识别钙草酸酯水合物相（响应变量y，通过XRD量化）。选定进行详细表征的样品用粗体标出。通过计算五个中心点重复实验（运行1、6、7、10和16）的标准偏差（SD）来确定相位量化的实验误差。计算出的SD分别为COT和COM的0.26。
运行
操作参数
响应
温度
系统pH值
离子强度
COT
COM
°C
mol dm−3
%
1
36.5
6.55
0.055
100
2
36.5
5.60
0.01
44.6
55.4
3
36.5
5.60
0.1
41.2
58.8
4
36.5
7.50
0.1
100
5
48.0
5.60
0.055
0
100
6
36.5
6.55
0.055
99.4
0
7
36.5
6.55
0.055
100
0
8
48.0
6.55
0.01
0
100
9
25.0
6.55
0.1
100
10
36.5
6.55
0.055
100
11
48.0
6.55
0.1
0
100
12
48.0
7.5
0.055
0
100
13
25.0
7.5
0.055
100
14
36.5
7.5
0.01
98.8
15
25.0
6.55
0.01
98.8
16
36.5
6.55
0.055
100
17
25.0
5.6
0.055
100
在这项工作中，FTIR光谱主要被用作定性分析技术，用于识别和区分钙草酸酯的不同水合物相。样品（运行1、运行3、运行9、运行11和运行13）的FTIR光谱（图1）清楚地证明了COT和COM的存在。被鉴定为纯COT的样品（运行1、运行9和运行13）展示了三水合物结构的FTIR特征（图1），主要表现在3600 cm−1到3000 cm−1之间的宽且复杂的O–H伸缩区域。这种复杂性源于COT中存在三个晶体学上不同的水分子，每个水分子参与了不同的氢键相互作用，正如Conti等人之前所描述的那样，他们强调了多种氢键环境在塑造caoxite（COT）振动光谱中的作用。此外，1600–1300 cm−1区域内带状的增强分裂，对应于草酸酯基团的不对称和对称伸缩模式，以及800 cm−1到600 cm−1指纹区域内的多个带状特征，都与已发表的钙草酸酯三水合物的振动分配非常吻合。相比之下，被鉴定为纯COM的运行11显示出截然不同的FTIR模式。O–H伸缩区域在3000 cm−1以上有五个峰，这与whewellite（COM）中存在单个结构水分子一致。运行11中观察到的1620 cm−1附近的特征性强带对应于COM的νas(COO−)模式，而783 cm−1附近的尖锐强烈吸收是广泛用于区分COM和其他水合物的关键诊断特征。这些光谱特征证实了COM样品的高相纯度。运行3的光谱显示了COM和COT振动特征的结合，证实该样品含有单水合物和三水合物相的混合物。宽的O–H伸缩带（典型的COT）与更明确的COM吸收之间的重叠，特别是783 cm−1的峰，为这两种水合物的共存提供了强有力的证据。FTIR在这项研究中被用于定性分析。图1
图1显示了沉淀系统的FTIR光谱：运行1、运行9、运行13、运行11和运行3。为了比较，标出了COT（运行9）和COM（运行11）的一些标准振动带。图2中呈现的合成样品（运行1、运行3、运行9、运行11和运行13）的PXRD衍射图谱证实了FTIR推断的相组成，并提供了额外的结构证据来识别COT和COM。图2底部包含的纯COT和COM的参考衍射图允许直接比较峰位置和相对强度，从而实现明确的相位识别。样品（运行1、运行9和运行13）展示的衍射图谱与纯COT的图谱相匹配。相比之下，运行11的衍射最大值与COM的图谱完全一致。COM已知结晶在单斜晶格中，产生更尖锐、更简单的衍射图谱，并具有明确的 dominant 反射。这些结构特征与Petit等人之前的详细分析结果一致，他们强调了晶格几何和 hydrated 程度之间的差异，这些差异区分了COM和更高阶的水合物。最显著的例子是运行3，Rietveld精修表明其由41%的COT和58%的COM组成的双相结构。钙草酸酯水合物的相组成（wt%）以及每个实验运行的相应Rietveld精修指标（Re、Rp、Rwp、GoF）在表S3中呈现。这个定量结果与相应的衍射图谱紧密一致，后者显示了可归因于两种水合物的峰集。COM的特征性反射群与COT的更宽、更多的反射的叠加证实了样品的混合性质。图2
3.2. 钙草酸酯晶体的形态
合成的晶体的形态和大小是使用光学显微镜（图S1）和SEM来表征的。图3展示了选定样品的SEM图像（运行1 – A，运行9 – B，运行13 – C，运行11 – D，运行3 – E）。在只有COT沉淀的图像中（图3：A、B和C），COT晶体显得相对较大，并呈现出细长的剑状形态。在图3E中，可以在COT晶体表面观察到更小且聚集更多的COM晶体。此外，一些COT晶体呈现出六边形的扁平形状。COM晶体大多形状不规则，有明显的聚集和形成更大的簇。在图3D中，可以看见定义明确的COM晶体，表现出文献中先前报道过的典型的船形/棺材形或细长的六边形形态。COM晶体也有显著的聚集和生长。可以观察到图3D和图3E中的晶体比图3A–C中的要小得多。所识别的形态特征与其他方法学得到的结果非常吻合。图3
扫描电子显微镜图像展示了在不同实验运行中获得的钙草酸酯晶体的形态多样性：（A）运行1，（B）运行9，（C）运行13，（D）运行11，（E）运行3。尽管图3显示了COT晶体在位置A、B和C的形态，但图4中更高倍率的SEM图像揭示了晶体表面的差异。图4
更高倍率的SEM图像展示了实验运行中获得的COT的形态多样性：（A）运行1，（B）运行9和（C）运行13。COT晶体表面形态的差异可能是由于合成条件的变化。图4A（运行1）显示，更高的温度（36.5 °C）促进了更均匀的晶体生长，导致晶体表面更平滑，这与Tomazic和Nancollas的发现一致，他们报告说COT的生长和转变对温度和离子强度非常敏感。图4B（运行9）显示，提高的离子强度（0.10 mol dm−3）导致表面缺陷和裂纹的增加。图4C（运行13）显示，更高的pH值（7.5）可以改变水合相的相对稳定性，并产生异质层状结构，这与Thomas等人的仿生学研究结果一致。
3.3. 影响钙草酸酯水合物相形成的过程参数的建模和优化
三因素独立二次Box–Behnken设计（BBD）以及通过17次实验获得的钙草酸酯水合物形成的预测数据和结果在表2中呈现。实验和预测响应的COT范围分别在（0–100)%和（−14.10–114.10)%之间。预测响应值略微超出理论范围（0–100%）是由于二次多项式回归模型的数学性质造成的。这些值代表了模型为了适应响应曲线的整体曲率而进行的外推。出于物理解释和优化的目的，预测值低于0%或高于100%的分别被视为0%和100%，代表绝对的相纯度边界。BBD被用来开发一个二次多项式回归模型（方程（1）和（2），其中X1代表温度，X2代表pH值，X3代表离子强度。给定的方程代表了COM和COT含量作为因变量与形成条件作为自变量之间的经验关系。模型方程的显著性是通过方差分析（ANOVA）和F检验（Fisher的检验）来确定的（表S4）。值得注意的是，所有影响COM产生的变量都被发现具有统计学意义（p值 < 0.05），模型整体显著，且拟合效果不显著（表S4）。所得到的决定系数R2 = 0.9402。同样，COT确定的模型适用性也通过p值低于0.05得到确认，表明具有统计学意义，同时拟合效果不显著（p值 > 0.05）（表S4）。在这种情况下，所有输入变量也都是显著的，得到的R2值为0.9372。研究结果表明，数据符合一个二次模型，该模型由以下代码方程式表示，用于COT（2）和COM（3）：
COT = 96.4 − 4.85X1 + 14.25X2 − 0.25X3 − 34.05X12 − 12.35X22 − 12.65X32
(2)
COM = 3 + 49.97X1 + 14.25X2 − 0.375X3 − 34.22X12 − 12.77X22 − 12.83X32
(3)
在Box–Behnken（BBD）中结合了三个影响因素，即温度、pH值和离子强度，以最小化实验次数，并考察所选参数及其交互作用对COM和COT生成的影响。响应表面回归结果见表S5。表格提供了系数及其标准误差、F值和p值。p值表示最小显著性水平，这可能导致零假设的拒绝。根据表S5，温度和pH值的线性系数以及温度的二次系数对COM和COT的产率有显著影响（p ≤ 0.05）。RSM分析结果表明，较低的温度、离子强度和较高的pH值促进了高COT含量，而COM值则相反。相反，二次系数对COT产率有负面影响，对COM产率有正面影响。这表明，例如，随着温度的升高，COT产率最初会增加，在实验范围内达到最大值，然后开始下降。如图5A和B（以及图S2A）所示，COT在25°C到36.5°C之间以100%的产率沉淀。然而，在实验范围内进一步升高温度（高达48°C）会导致COT产率显著下降。pH值（图5A和C以及S2A）和离子强度（图5B和C以及S2A）的影响表明，pH值高于6.36会导致COT沉淀。所有实验中的离子强度保持在0.01 mol dm−3到0.10 mol dm−3之间，这通常被认为是较低的。因此，可以得出结论，在所研究的条件下，测试的离子强度对COT沉淀没有显著影响。图5
3D图显示了单个参数及其交互作用对COT含量（y）的影响：(A) 温度（X1）和系统pH（X2），(B) 温度（X1）和离子强度（X3），以及(C) 系统pH（X2）和离子强度（X3），这些数据来自用于RSM模型的XRD数据的定量相位分析。同样，如图6所示，COM的产率在25°C到38°C之间逐渐增加，然后在温度继续升高时明显上升。pH值（图6A和C以及S2A）和离子强度（图6B和C以及S2A）的影响表明，COM在pH值低于6.5时发生沉淀。此外，与COT沉淀观察到的情况类似，离子强度对COM的形成没有显著影响。图6
3D图显示了单个参数及其交互作用对COM含量（y）的影响：(A) 温度（X1）和系统pH（X2），(B) 温度（X1）和离子强度（X3），以及(C) 系统pH（X2）和离子强度（X3），这是基于XRD分析得到的定量相位分数。所提出模型的统计稳健性通过R²值反映出来，COT的R²值为0.9372，COM的R²值为0.9402和0.9043。这些值表明拟合优度可以接受，预测数据和实验数据显示出明显且强烈的相关性。所得到的拟合方程（2）和（3）成功描述了水合物产率对独立变量（R²adj、pH值和离子强度）的依赖性。通过应用最优性函数方法来最大化COT产率同时最小化COM的形成，确定了最佳条件（表3）为34.25°C、pH 7.35和Ic = 0.093 mol dm−3。实验验证这些条件得到的结果与理论预测相差在5%以内，证实了模型对COT形成过程具有很高的预测能力。鉴于COM形成的机制在文献中已经确立，后续讨论将专门关注控制COT形成和稳定的因素。表3
COT合成的最佳条件
最佳条件
预测的COT值（%）
实际获得的COT值（%）
预测的COM值（%）
实际获得的COM值（%）
温度（°C）
系统pH值
离子强度（mol dm−3）
34.25
7.35
0.093
98.91
100
1.00
0
在最佳实验条件下获得的COT晶体的表征如图7所示。一张代表性的显微镜图像（图7A）在10倍放大下提供了晶体形态的初步概览。为了确认相纯度（图S3和表S6），进行了XRD分析（图7B）。优化样品的衍射图（黑线）与标准COT参考谱线（红线）非常吻合。通过SEM获得了更详细的形态学见解，如图7C和D所示。图7
在京京条件下获得的COT；(A) 显微镜图像（×10），(B) 优化样品的COT XRD衍射图（黑色）和标准COT衍射谱（红色），(C) 和 (D) SEM图像。本研究观察到的温度影响与先前的研究结果一致，即更高的结晶温度通常有利于更热力学稳定的COM，而较低的温度增加了像COT或COD这样的水合相的比例。具体来说，我们观察到尽管从25°C升高到27°C可能会提高COT的产率，但进一步升高到48°C会导致显著下降。这种温度依赖性与亚稳相的动力学窗口密切相关。正如Brečević和Kralj所展示的，COT在动力学控制的条件下优先形成，尤其是在大约25°C的中等温度下，并且在37°C以上的沉淀物中不再出现。我们的实验窗口（25–36.5°C）和相对较短的45分钟反应时间正好有利于COT的成核，同时防止其迅速转化为更稳定的COM。温度的强烈影响表明，COT的形成是由动力学驱动的，而不是热力学上更受青睐的。更高的温度增加了离子迁移性和过饱和动态，可能促进了不太稳定的水合相的快速成核，然后转化为更稳定的形式，如COM。这支持了COT是在特定动力学条件下稳定的瞬态结晶相的假设。此外，溶液化学性质，特别是pH值和离子强度，在引导系统形成COT方面发挥了决定性作用。我们的数据表明，pH值超过6.36必然会导致COT的沉淀，这与Manissorn等人的报告相一致，他们关于在较低pH值（pH 4.0）下COM结晶效率的研究结果相符。在较低离子强度（0.01 mol dm−3–0.1 mol dm−3）下观察到COT形成的促进可能是由于静电屏蔽作用减弱和离子-离子相互作用增强，这加速了成核动态。这一点还得到了我们研究中使用的磁力搅拌的支持；文献一致报告说，这种流体力学条件促进了快速的异质成核，有利于COT作为初始主导相。
在特定实验中（例如，实验1、9和13）中纯COT的独有形成可以通过现代表面能模型和局部浓度模型来解释。根据Debroise等人的研究，CaOx多水合物的稳定性受水合依赖的表面能控制。在中等温度和高水活性下，COT暴露出的晶体表面的能量低于脱水相的表面能量，从而稳定了溶液中的晶格。在SEM图像中观察到的板状、层状晶体是这种动力学上受青睐相的典型特征。这进一步得到了Wang等人提出的局部浓度模型的解释，该模型表明，当混合过程中的局部离子浓度保持在较低水平（<1.25 mM）时，COT会优先成核。在我们的系统中，高Ca:Ox摩尔比（5.7:1），结合中等的混合和低离子强度，有效地降低了初始接触时的局部过饱和度，使系统正好处于COT相比COM或COD更受青睐的范围。
总之，我们在实验中观察到的COT的主导地位源于多种因素的协同作用：温度控制的动力学窗口、pH调节的草酸根离子的可用性，以及表面能的稳定作用，所有这些都在抑制向更稳定的草酸钙水合物转变的局部浓度范围内发挥作用。成功制备出纯相COT为研究水合-脱水路径、溶剂介导的相转变和草酸钙材料的结晶动力学提供了一个明确的亚稳态参考系统。它的可用性使得未来的研究能够系统地探讨控制其稳定性和向更稳定水合物转变的因素，这对生物矿化过程、抑制剂设计和先进分析方法的发展具有潜在意义。结论
本研究表明，响应表面方法结合Box–Behnken实验设计是控制和优化草酸钙水合物形成的有效方法，特别强调了亚稳态COT相。纯COT的形成受限于一个狭窄的动力学窗口，该窗口由中等温度（25–36.5°C）、pH值高于6.36和低离子强度定义。优化策略确定了一组稳健的条件（34.25°C、pH 7.35、Ic = 0.093 mol dm−3），这些条件始终能产生纯相COT，同时揭示了在密切相关的条件下仍然可能发生显著的形态变化。总体而言，这项工作为COT的控制合成提供了一个可重复的实验框架，并有助于更深入地理解控制草酸钙水合物形成的物理化学因素。作者贡献
A. H.和N. M. M.进行了化合物的合成和表征，并进行了光学分析和数据解释。N. M. M.和A. S.使用VMINTEQ 3.1计算了初始过饱和度、饱和比和离子强度，并进行了数据分析和解释。I. S.和J. B. K.进行了SEM分析和解释。A. H.、N. M. M.、N. F.和J. B. K.分析了FTIR和PXRD结果并准备了可视化结果。M. B.进行了三因子独立二次Box–Behnken设计（BBD），包括数据分析、解释和可视化展示。A. H.、N. M. M.、N. F.、J. B. K.和A. S.撰写了原始手稿草稿。N. M. M.、N. F.、J. B. K.、A. S.和M. B.准备了手稿的修订版本。A. S.构思了该项目，并监督和指导了实验设计、数据分析和解释，并参与了方法论开发、项目管理和资金获取。所有作者都阅读并同意了发表的手稿版本。利益冲突
作者声明没有利益冲突。数据可用性
支持本研究结果的数据包含在文章及其补充信息（SI）中。补充信息可获取。请参见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ce00201c。致谢
本研究得到了欧盟-NextGenerationEU项目“先进跨学科环境化学方法：从材料到可持续污染解决方案”（项目编号：581-UNIOS-101）的资助。我们感谢B. Marković教授和Á. Kukovecz教授在数据解释方面提供的专业建议，以及他们为促进国际合作所做的努力，这使得这项工作成为可能。参考文献
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