摘要
利用环境核酸的方法在监测水生生物多样性方面已经变得非常有效，适用于多种场景，包括渔业评估的指标测量。传统的鱼类种群评估方法通常依赖于侵入性技术，这些方法在空间和时间上的覆盖范围有限。环境DNA（eDNA）通过非侵入性和间接的方式促进了物种检测和数量估计，彻底改变了生物监测评估。环境RNA（eRNA）通过捕获生物体的转录活动，提供了有前景的补充。此外，对eDNA甲基化的研究可能为检测目标基因的表达调控提供途径。本文综述了利用eDNA和eRNA的潜力，通过提供非侵入性的、替代性的和互补的方法来支持可持续渔业评估，这些方法可用于年龄评估、性别鉴定、生殖阶段、生理和健康状态、遗传结构以及种群识别。通过将这些创新方法与传统方法相结合，可以更全面地了解水生生态系统，最终有助于改善渔业保护和管理决策。
1 引言
全球范围内，水生生物群落是重要的食物来源。为了满足不断增长的人口需求，同时确保渔业的可持续性和公平性，必须实施有效的政策来应对过度捕捞和不可持续或非法的捕鱼行为。据估计，2012年有80%的渔业资源缺乏用于资源评估的高质量数据（Costello等人，2012年）。到2021年，可持续水平的海洋鱼类资源下降了62%，自20世纪70年代以来，全球迁徙性淡水鱼类的数量减少了81%（Deinet等人，2024年；FAO，2024年）。然而，也有一些正式的鱼类资源研究为制定捕捞配额提供了依据，并已被证明对这类渔业的可持续管理非常有用。例如，七种主要的商业金枪鱼物种受到了密切监测，其中87%的资源被可持续地捕捞（FAO，2024年）。支持渔业管理的技术创新已经成熟，并可以应用于更多的渔业中，以加速渔业资源的保护并扭转下降趋势。大多数渔业资源的数据可用性取决于其分布范围和多样性以及调查的成本。然而，管理者需要指标来记录、监测、跟踪和理解鱼类及其相关生物多样性的模式和趋势。除了由区域政府或国际联盟进行的渔业调查（这些调查包括专用的研究船只和商业船上的观察员）外，还有其他数据来源，如航海日志和登陆评估。目前，生物量估计依赖于：（1）通过捕鱼、空中调查、视觉计数、电捕鱼、遥测获得的单位捕捞量（CPUE）；（2）通过回声探测器进行的声学拖网调查以及用于校准数据的捕鱼；（3）通过平台发射终端（PTT）标签或通过生物标志物或鳍片剪辑进行的近亲标记重捕获（CKMR）。虽然从环境中移除或捕获鱼类可以提供丰富的信息（如年龄、性别、发育阶段、饮食、病原体、健康状况、激素水平、污染物等），但这不仅具有侵入性，而且费时费力，并且只能提供有限数量样本的参数快照。研究分布范围广泛的物种或种群可能需要时间和资源，因此可能会变得非常昂贵，同时一次只能提供一两种物种的大空间网格分辨率信息。近年来，越来越多的国家、区域和国际指令、政策和战略呼吁对环境指标进行生物监测和评估，以保护和维护自然环境，例如《联合国海洋法公约》（UNCLOS）、《昆明-蒙特利尔全球生物多样性框架》（GBF）的生物多样性计划、欧盟《水框架指令》（2000年）、美国《国家环境政策法》（NEPA）以及自1983年以来的欧盟共同渔业政策（法规EU 2023/2842），这些政策都倡导健康和可持续的鱼类资源。此外，美国《国家水生环境DNA战略》（Goodwin等人，2024年）呼吁美国政府机构建立协调的方法，将环境DNA的应用从监测和监管扩展到生物多样性和渔业调查。在渔业评估中依赖遗传方法已成为常见做法。可以通过遗传物质解决的重要指标包括：鱼类资源结构和管理单元、混合种群渔业的区分、食物链或营养级动态的种群评估（例如，研究鱼类的猎物以及鱼类本身）、年龄估计和结构、生态系统结构监测、捕捞率和数量估算、杂交、遗传多样性和种群规模、对捕捞的进化响应和适应、表观遗传响应和适应、基因表达、病原体传播的监测、疾病和健康状况的检测、入侵物种的检测、产品来源和饮食（Bernatchez等人，2017年；Friedman等人，2022年；Minamoto，2022年；Ovenden等人，2015年）。与繁琐和专门的传统调查相比，基于环境核酸的方法具有多个优势：覆盖更广泛的范围和深度，潜在成本效益更高，信息量更大，因为它们可以提供多物种数据（Guri等人，2025年）。环境DNA（eDNA）这一术语最早由Ogram等人（1987年）提出，指的是可以从环境样本中提取的DNA（本研究中的沉积物微生物DNA）。直到21世纪初，eDNA才开始在微生物学领域之外使用，例如线虫、牛蛙、植物（Bhadury等人，2006年；Ficetola等人，2008年；Willerslev等人，2003年）。大规模并行测序能力的提升使得这些混合DNA样本的表征成为可能（Taberlet等人，2012年）。环境DNA（eDNA）和环境RNA（eRNA）都归于环境核酸（eNA）范畴，目前定义为从环境样本（空气、水、土壤、生物膜）中获得的DNA和RNA，这些样本可能来自活体生物（包括释放的细胞如黏液、配子、粪便等）、脱落的细胞（腐烂或死亡的细胞、蜕皮等）、死亡的生物，甚至是游离的DNA/RNA（Cristescu，2019年；Pawlowski等人，2020年；Taberlet等人，2012年）。eDNA的主要优势在于其本质上是非侵入性的（即能够在不观察和伤害生物的情况下进行研究）、能够发现隐秘或难以发现的物种、能够针对多个物种并覆盖更大的或难以到达的研究区域、能够更频繁地取样以及适合样本存档。在过去的15年里，研究重点从微生物eDNA转向了宏生物eDNA方法（Pawlowski等人，2020年）。这一转变体现在样本收集、引物开发、定量、eDNA运输和降解评估方面的重大进展上。这些进展加上必要的遗传参考数据库的显著扩展，使得eDNA可以作为生物多样性指标用于指导保护管理工作（参见Blackman等人，2024年的综述）。通过“eDNA宏条形码”对水生系统群落的特征进行分析，利用靶向定量PCR（qPCR）或数字PCR（dPCR）可以检测物种的存在/缺失。eDNA研究的进步对生态学、生物地理学和保护生物学领域产生了深远影响，以至于许多区域和国际eDNA组织、协会及私营咨询公司提供专业的商业eDNA服务。通常认为eDNA方法比传统调查方法更具成本效益，但很少有研究彻底证明这一点（Rodríguez-Rodríguez等人，2022年）。尽管eDNA是一种成熟的分子生物标志物，但目前eRNA正受到越来越多的关注（Cristescu，2019年）。尽管十多年来eDNA方法得到了广泛应用，但其潜力尚未得到充分利用，仍处于验证和实施阶段，尽管人们迫切希望将eDNA方法应用于渔业和分子生态学的各种问题（Bernatchez等人，2017年；Casey等人，2016年；FAO，2019a，2019b）。基于eDNA的渔业研究旨在进行物种检测和定量，或进行群落特征分析，甚至模拟生物量并预测在气候或海洋参数变化下的未来种群趋势（Guri等人，2025年；Salter等人，2019年；Shelton等人，2022年）。我们尚未看到基于eNA的可扩展、非侵入性方法，这些方法能够提供传统方法提供的一些必要的人口统计信息，如种群边界、年龄、性别、发育阶段、健康状况、对压力源或其他环境因素的响应（Minamoto，2022年；Rodríguez-Rodríguez等人，2022年）。本文将回顾eNA在协助渔业管理方面的潜在应用，确定实施这些应用的下一步措施并扩大其应用范围。基于水生eNA的研究基本上采用相同的协议：水样采集、过滤、核酸提取、测序或检测与分析。然而，本文重点关注利用这些分子的序列、构象、类型或功能来获得水生系统的新生物学和生态学见解的应用扩展，而不是完善一般的工作流程。我们探讨了当前技术和方法论进步在eNA和基因组学背景下的机会，并提出了成功研究这些目标的方法。eNA的主要障碍在于其复杂性，因为这些分子来自不同的个体和物种；因此，所有的优化努力都将致力于区分个体/物种。正在进行的投资和创新旨在解决剩余的技术限制和概念挑战，进一步消除在渔业评估中采用eNA方法的障碍（Cordier等人，2021年）。本文概述了潜在的进步，确定了渔业背景下用于解决这一迫切需求的技术方法和实验，即开发可扩展的、非侵入性的、成本效益高的基于eNA的方法，以提供关键的人口统计信息（图1）。
2 环境核酸（eDNA和eRNA）研究的最新进展
渔业研究领域可以利用eNA领域的进展。目前有很多关于水生环境中eDNA命运、单一物种检测、群落特征描述以及濒危、入侵、难以采样类群的检测的文献和研究。还有持续的分类学工作以及不断增长的公共遗传数据库，用于将eDNA读段与匹配数据关联起来。最近，eRNA相关的出版物激增，表明基于eRNA的方法也有望用于监测，并能提供关于生理反应的见解（Ahi & Schenekar，2025年；Veilleux等人，2021年）。尽管下面讨论的大多数前沿进展适用于eNA和eRNA，但eRNA的独特性质和研究增长要求单独设立一个专门的章节。涉及过去工作和eDNA在淡水和海洋渔业中应用的综述包括：Bernos等人（2023年）、Ramírez-Amaro等人（2022年）和Yao等人（2022年）。这些研究获得的知识可以直接应用于渔业评估和保护。特别相关或进展显著的方面包括以下内容。
2.1 收集和远程取样的仪器
监测大型或难以到达区域的挑战一直是传统渔业调查的主要障碍。最近在eNA仪器方面的进展，从经济实惠的设备到自主水下车辆，为在广阔和偏远地区进行常规的非侵入性取样提供了解决方案。采样设备的例子包括：开源且价格实惠的小型DIY便携式采样设备，专为地表水设计（DeHart等人，2023年）；eDNA采样背包（Smith-Root）；无人机（Doi等人，2017年）；以及用于从小型船只深处采集样本的便携式Niskin瓶子，以提高采样效率；还有更复杂的设备，如配备Niskin瓶子的CTD采水器、遥控潜水器（ROV）、自主水下航行器（AUV）、远程原位采样器（如底栖着陆器）、无人采样器、底部固定的自主设备（McLane Environmental Sample Processor和Particle and Phytoplankton Sampler）（Aguzzi等人，2019年；Govindarajan等人，2022年、2023年；Preston等人，2024年；Sepulveda等人，2020年；Thomas等人，2018年；Yamahara等人，2019年）。有关详细综述，请参阅Yamahara等人（2025年）的研究。一种低成本的eNA收集方法是使用被动采样方法，无论是天然的还是人工的，这种方法无需使用泵送设备，同时更加节省时间。尽管这些方法对 biodiversity 监测非常有用，但由于无法控制采样的水量，其用于定量分析的适用性仍需通过流量计进行验证。已经研究了各种材料在水生环境中捕获eDNA的能力，其中一些材料在eDNA保留方面表现出很高的效率（Bessey等人，2021年、2022年；Chen等人，2024年；Kirtane等人，2020年）。被动eDNA采样器已成功应用于渔网中，通过在渔网上附加一个带有纱布的球形空心探头，这种设计是公开可获取的（https://github.com/GiuliaMaiello/Metaprobe-2.0）。
2.2 自然采样器
在底层渔业中，底拖网捕鱼不仅具有侵入性，而且具有破坏性。得益于上述技术，现在可以非侵入性地采样难以到达或难以进入的区域，例如深海，特别是借助ROV的帮助，可以超越视觉观察范围进行采样。视觉计数虽然可以提供大量信息，但可能只代表了一小部分生物群落，并且可能会受到干扰车辆的影响，而且分类分辨率可能不足（Everett & Park，2018年；Iguchi等人，2024年）。这种方法在后勤和技术上仍然成本较高，因此在深海中必须最大化采样效率。可以采集水样并分析其中的eDNA。随着深度的增加，需要采集更多的水样才能获得可检测的DNA量，但这可能难以实现。在这种情况下，海绵作为自然采样器具有最大的潜力，因为它们能过滤包含eDNA的大量水，从而揭示周围生物群落的组成（Gallego等人，2024年；Iguchi等人，2024年；Jeunen等人，2024年；Mariani等人，2019年；Neave等人，2023年）。事实上，在底栖生物群落组成研究中，使用海绵的结果优于传统的水样采样方法（Cai等人，2024年）。从深海海绵中提取少量组织样本可以补充视觉或声学观察结果，但需要注意的是，某些物种保留DNA的时间比其他物种更长（Neave等人，2023年）。此外，还可以通过从拖网或生物污损中发现的海绵来机会性地确定鱼类群落组成（Cai等人，2024年）。未来的研究和方法优化需要解决以下问题：（1）通过最小化代谢条形码分析中的海绵信号来提高被检测生物的潜力，因为宿主DNA的比例更大（见第4节）；（2）确定进行稳健的群落特征分析和季节性区分所需的采样努力；（3）了解该方法的量化能力。
2.3 占据模型
利用eDNA来检测目标物种（包括入侵物种）可以及时发现这些物种，为适当的的管理决策提供依据（Morisette等人，2021年；Sepulveda等人，2023年）。然而，像所有调查方法一样，eDNA调查也会受到检测误差的影响。采样间隙、重复性、假阳性结果、eDNA的传输、降解、PCR偏差以及将eDNA浓度与丰度联系起来的挑战都可能影响对空间分布的准确评估。因此，可以将eDNA检测与占据模型结合起来，用于估计物种的占据历史和扩张动态（Carraro & Altermatt，2024年；Dorazio & Erickson，2018年；Keller等人，2022年；Martel等人，2021年；Shelton等人，2022年）。这些模型考虑了物种在特定位置实际存在的概率、其eDNA出现在给定样本中的概率以及成功进行基因检测的概率（Dorazio & Erickson，2018年）。重要的是，它们应评估调查的可检测性，这对稳健的监测具有重要意义。由于这些模型在统计上可能较为复杂，并需要对分层统计和贝叶斯统计有更深入的理解，这对一些从业者来说可能是一个障碍，因此已经开发了几种eDNA占据模型软件包（Dorazio & Erickson，2018年；Keller & Kelly，2025年；Macé等人，2025年）。有关入侵物种特异性检测方法的全面验证，请参阅Kronenberger等人（2024年）的研究。
2.4 运输和降解
eNA的降解和传输模式对于监测调查尤为重要，因为它们会影响这些痕迹的可检测性。在内陆淡水系统中，eDNA可以从源头传播数公里远，随着时间的推移，河流中游的eDNA往往会在河岸边积累（Brantschen等人，2024年；Deiner等人，2016年；Wood等人，2021年）。Xiong等人（2025年）发现，潮汐阶段以及有利的风况对受潮汐影响较大的峡湾中eDNA的传播有显著影响。可以使用像Telemac（https://www.opentelemac.org/）这样的软件或R包SSN2进行空间流网络建模，以设计更有效的采样策略（Dumelle等人，2024年）。在海洋环境中，水平水流和潮汐主导eDNA的传输，而海洋中eDNA的垂直扩散受限于强烈的分层现象（Allan等人，2021年；Andruszkiewicz等人，2019年；Canals等人，2021年）。通过在含有受不同生物和非生物因素影响鱼类的控制水族箱中研究，分析了遗传物质在水生环境中的分解情况。通常，eDNA在低温、光照限制、缺氧和碱性条件下表现出更好的稳定性，其中温度是最重要的物理因素。影响eDNA降解速率的生物因素包括微生物负荷、营养级和滤食性生物的存在（Yao等人，2022年的综述）。
2.5 环境RNA
需要注意的是，这里的eRNA缩写不要与增强子RNA（enhancer RNA）的缩写混淆，后者是一类参与基因转录调控的非编码RNA分子，属于不同的生物学和医学领域。根据表达水平的不同，转录本的浓度可能高于其DNA模板。Marshall等人（2021年）在受控条件下发现，斑马贻贝（Dreissena polymorpha）的线粒体和核糖体RNA（rRNA）浓度是eDNA的1000倍。他们还发现，线粒体信使RNA（mRNA）的浓度是eDNA对应基因的30倍。eRNA潜在的更高可检测性，加上它能够揭示关于基因表达水平的大量信息，使其成为值得探索和利用的目标。值得注意的是，mRNA仅占总RNA的约5%，这意味着目标基因的表达水平较低，因此需要对其进行富集（甚至可能是扩增）和深度测序。改进现有的参考数据库对于找到生态学问题的特定标记或提高环境样本中目标物种的特异性至关重要（Tsuri等人，2021年；Yates等人，2021年）。到目前为止，大多数eRNA研究都集中在使用中型生态系统或受控环境的概念验证实验上（Brandão-Dias等人，2025年；Giroux等人，2022年；Parsley & Goldberg，2024年；Veilleux等人，2021年）。在实际监测研究中，它主要被用作实时代谢条形码数据的代理（Littlefair等人，2022年；Pochon等人，2017年）。这是因为它提供了某个环境中活生物的快照，而不是该环境的“遗产”，因为死亡生物中不存在转录过程，而且RNA会迅速降解（Miyata等人，2021年）。在想要区分活生物群落和死亡、被消灭或遗留生物的信号时，这些考虑因素非常重要（Marshall等人，2021年；Miyata等人，2021年；Pochon等人，2017年；Wood等人，2020年）。很少有研究在野外宏观生物中使用eRNA进行代谢条形码分析（Broman等人，2021年；Littlefair等人，2022年；Miyata等人，2022年）。Laroche等人（2017年）发现使用eRNA能够检测到比eDNA更多的分类单元，并认为将RNA逆转录为互补DNA（cDNA）可能会导致eRNA测序中的假阳性结果，因为逆转录酶缺乏校对能力，从而产生点突变，生成异构体cDNA和片段缩短。与eDNA相比，使用eRNA进行代谢条形码分析需要额外的步骤（例如DNA去除和互补DNA合成），这使得每个样本的处理时间更长、成本更高（Littlefair等人，2022年）。此外，RNA比DNA更容易降解，这可能解释了eRNA代谢条形码分析的滞后现象。然而，Kong等人（2023年）证明，在北极海洋的恶劣环境条件下，使用eRNA代谢条形码分析更能准确反映不同的水生栖息地。有许多因素需要考虑，以理解eRNA在环境研究中的信息价值。来自水生样本的eRNA在细胞死亡或生物体被移除后降解得更快，mRNA在开放环境中可持续<4小时，在网状围栏中可持续>24小时（Brandão-Dias等人，2025年；Jo等人，2022年；Marshall等人，2021年）。实际上，eRNA在高温（>20°C）和碱性pH值条件下降解得更快。在酸性条件下（pH 4），无论水温度如何，降解可忽略不计（Jo等人，2022年）。一些研究表明，在从样本提取到检测的过程中，大量eRNA会丢失（Jo等人，2022年；Wood等人，2020年），因此需要采用简单直接的方法。上述发现说明了eRNA在野外条件下的命运，但也可以为eRNA的保存条件提供参考。理想情况下，样本应在收集后立即以实用和可行的方式进行保存，以便于后续的RNA提取步骤。不同生命阶段或条件下的个体脱落率可能与eDNA不同（例如，活跃的鱼类预计会释放更多的eRNA）（Glover等人，2024年）。所有这些因素都不可避免地会影响eRNA的可检测性，可能需要过滤更多的水或进行更多的重复采样（Tsuri等人，2021年；Yates等人，2021年）。
2.6 法医应用
环境DNA在野生动物法医学中也具有潜在应用，可以为非法野生动物贸易的调查提供新的证据。通过非破坏性样本检测濒危或受保护物种的DNA，对于开发有价值的物种检测测试非常有潜力。将这些数据与包含各种物种序列数据和相关元数据的基因数据库结合使用，可以应用于多种场景。例如，它可以帮助确定样本的来源，或识别鱼类是否来自受保护或禁止捕捞的物种或种群（Lewis等人，2024年；Prasetyo等人，2024年）。在这种情况下，存档的eDNA样本不仅可以用于法医学，还可以用于重建过去的种群并了解其趋势。执法部门还可以利用从鱼舱中的融水中或与动物接触过的表面中发现的eDNA。一个显著的例子是“鲨鱼灰尘”方法，该方法利用处理鱼鳍时留在表面和空气中的DNA残留物来打击非法贸易（Prasetyo等人，2023年）。
2.7 机器学习
在环境样本中应用eNA代谢条形码分析会产生大量复杂的数据集，其中包含大量尚未进行分类的序列。这种情况通常不适用于商业鱼类，但其他鱼类或其环境中的生物则可能有所不同。这一特定限制可能会妨碍全面的生物评估，并降低eNA在海洋和淡水监测中的效率。尽管如此，将机器学习引入分析框架是一个有前景的解决方案。监督式机器学习方法可以用来建立强大的预测模型，这些模型无需完整的分类系统（Cordier等人，2017年，2018年）。监督式机器学习可以绕过环境DNA（eNA）分析中的一个关键瓶颈，并利用分子数据作为生物指数，充分利用数据集中包含的广泛生态信息。这种“无需分类”的方法已被证明可以生成比传统基于分类的宏条形码技术更精确的预测模型，从而实现对环境条件的准确可靠评估（Li等人，2023年）。在渔业资源评估领域，这代表着显著的进步，因为机器学习可以促进对鱼类生态位进行更高效、更经济且更精确的生物监测。
3 环境DNA（eNA）及其在表征种群生物和遗传组成中的潜在用途
3.1 年龄评估
年龄结构、补充率和生长率是进行准确资源评估建模的关键指标。可以通过测量鱼的长度或计算鱼类和鱿鱼的耳石、鱼鳞和刺以及软骨鱼的脊椎上的生长痕迹来估计年龄和生长率。然而，这些方法非常费力，并且具有侵入性或致命性。对于某些鱼类，特别是年轻、年老或热带鱼类，耳石的分辨率并不理想（Campana，2001年）。此外，鱼的长度受到水温的影响，因此可能导致误差（Anastasiadi & Piferrer，2019年）。还可以通过分析分子生物标志物（如DNA甲基化）的变化来推断实际年龄，以建立年龄预测模型（Jarman等人，2015年）。随着年龄的增长，基因组的整体甲基化程度降低，这种现象被称为表观遗传漂变。然而，由DNMT3b调节的位点特异性甲基化变化在个体生命过程中以一致的速度增加或减少，这被称为表观遗传钟（Anastasiadi & Piferrer，2020年；Horvath，2013年；Jarman等人，2015年；Lopatina等人，2002年；Lu等人，2023年）。在过去十年中，人们付出了巨大努力来验证在不同分类群中高度保守的位点上的年龄相关甲基化特征，以便准确估计年龄，例如在齿鲸类（Parsons等人，2023年；Robeck等人，2021年）或哺乳动物物种中（Lu等人，2023年）中。哺乳动物甲基化联盟（clockfoundation.org）维护了一个按物种和组织分类的保守位点数据库，这些数据库已被用于表观遗传老化钟的构建以及其他用途。基于甲基化的表观遗传钟现已应用于人类、其他哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行动物甚至软体动物（Balard等人，2024年；De Paoli-Iseppi等人，2017年；Horvath，2013年）。随着跨物种高度相关的表观基因组数据库的发展，以及即使在少量DNA样本（如法医样本）中也能进行准确分析，这为渔业环境DNA甲基化（eDNAm）分析的方法开发提供了指导。到目前为止，只有两项研究考察了来自水生样本的表观遗传钟（一项来自粪便样本，一项来自环境样本）（Yagi等人，2024年；Zhao等人，2023年）。Zhao等人（2023年）在受控环境中使用eDNA作为起始材料，非侵入性地应用了这种分子钟。实际环境样本的挑战在于找到不受组织类型影响的标记物，并测试它们的敏感性和物种特异性（Li，Haghani等人，2024年）。使用eDNA甲基化（eDNAm）作为表观遗传钟的主要限制是起始材料的目标DNA具有固有的高变异性，这会导致误差，如在宽吻海豚（Tursiops truncatus）的粪便样本研究中所见（Yagi等人，2024年）。因此，需要一个管家基因来关联浓度。Zhao等人（2023年）推测，结合eDNA丰度，eDNAm可以校正生物量数据，因为不同生命阶段的脱落率不同。我们假设eDNA甲基化率可能对单峰或双峰年龄的鱼群更有用。传统上，甲基化检测（主要是胞嘧啶的5′碳或5-甲基胞嘧啶或5mC的修饰）是通过亚硫酸盐转化非甲基化胞嘧啶，然后进行扩增和检测来完成的。其他用于研究甲基化位点的 方法包括减少代表序列的亚硫酸盐测序（RRBS）、bis-RADseq、亚硫酸盐扩增子测序（BSAS）、微阵列或靶向测序（GTseq）（Piferrer & Anastasiadi，2023年；Zhao等人，2023年）。或者，可以使用Oxford Nanopore的自适应采样技术进行减少代表序列的甲基化测序（RRMS）（Yuen等人，2024年）。这种方法允许直接测序整个基因组，并同时寻找长片段的多个甲基化区域。由于这种方法使用的是原始DNA，因此可以量化甲基化水平，从而在时钟校准良好的情况下推断年龄。此外，可以分析长片段，从而获得比使用亚硫酸盐转化短片段的先前分析更多的CpG位点。第三代测序平台（PacBio和Oxford Nanopore）大大降低了基于位点特异性甲基化标记物搜索的成本。使用CRISPR-Cas9进行目标富集也可以实现感兴趣区域的富集（第4节）。未来使用eDNA的表观遗传钟的工作将集中在：（1）找到与年龄和甲基化率有显著相关性的物种特异性和/或全鱼类表观遗传位点集，这些位点与组织来源、个体大小和环境条件无关；（2）确定表观遗传钟的稳健性和准确性所需的标记物数量；（3）使用大量样本（约70-130个个体，以获得80%-95%的置信区间）从不同个体（如果是全鱼类时钟，则包括不同物种）中校准稳健的表观遗传钟，这些个体的年龄分布均匀，以避免种群变异；（4）确定分析eDNA样本的最佳分子程序（高分辨率熔解-qPCR目标基因、使用第三代测序平台进行靶向测序以及长片段原始DNA测序、减少代表序列的甲基化测序）；（5）确定如何在eDNA样本中富集这些生物标志物（Piferrer & Anastasiadi，2023年）。Piferrer和Anastasiadi（2023年）提供了一个使用组织开发新的鱼类表观遗传钟的总体框架。对于来自自然水生系统的eDNA样本，还需要仔细考虑其他复杂因素，包括混合物种群体的混淆效应以及没有先前年龄数据（来自耳石或长度测量）可用于校准表观遗传钟的野生物种。
3.2 性别比例和繁殖
识别性别比例、繁殖种群、区分产卵区和觅食区，以及对种群生命周期的深入理解，最终可以推断其长期生存能力（Cheng等人，2025年）。例如，某些物种的生长率因性别而异，太平洋比目鱼就是一个显著的例子，雌性在年龄上比雄性更大，这导致捕捞偏向于雌性（Drinan等人，2018年）。由于不平衡的性别比例会影响繁殖能力，因此评估这一参数对于识别由于大小选择性渔具造成的潜在捕鱼偏差以及确保健康的繁殖种群至关重要（Kendall & Quinn，2013年）。鱼类的性别发育可能很复杂；一些鱼类具有性染色体、多基因性别发育系统，一些具有温度依赖的性别决定机制，或者上述机制的结合，甚至可能由种群密度或环境pH值决定（Anastasiadi等人，2018年；Balard等人，2024年；Valdivieso等人，2023年）。无论其性别发育机制如何（雌雄异体物种和雌雄同体物种），多种基因参与卵巢和睾丸的发育。对于那些没有描述性别基因的鱼类，需要更好地理解性别发育，可以通过从头基因组组装和转录组学来寻找性别发育的遗传标记，使用eDNA或eRNA甚至是eDNAm。然而，无论鱼类在何种环境条件下发育，都发现了能够准确识别性别的信息性甲基化水平。这些基因包括cyp19a1a（雄性的最高甲基化）和dmrt1（雌性的最高甲基化），以及其他基因（cyp19a1a代表细胞色素P450家族19亚家族A成员1，dmrt1代表doublesex和mab-3相关转录因子1，两者都参与生殖腺发育）（Anastasiadi等人，2018年；Valdivieso等人，2023年）。这使得使用eDNA研究鱼类的生殖腺表型成为可能，前提是在eDNA中发现相同的差异甲基化比率，因为上述研究是使用生殖腺组织进行的。关于繁殖状态，先前的工作使用核与线粒体eDNA比率来检测产卵事件，因为精子与体细胞的比率更高（Bylemans等人，2017年；Wu等人，2022年）。特别值得关注的是体细胞与生殖细胞之间的甲基化水平差异（Jabbari等人，1997年）。Hirayama等人（2024年）在受控条件下（水箱）同时观察到生殖细胞中未甲基化DNA的水平很高以及物种特异性eDNA浓度的增加，这将是区分野外高丰度和产卵事件的关键。这些发现非常有前景，但需要注意的是，如果使用甲基化富集来增强鱼类信号（见第4.4节），则会错过生殖细胞的未甲基化DNA。Hirayama等人（2024年）使用了斑马鱼中的18S rRNA基因，该基因具有19个CpG位点，足以区分体细胞和卵细胞的甲基化水平，而eDNA和gDNA水平之间没有显著差异。如果也能通过靶向18SrRNA基因在其他鱼类物种中检测到不同的甲基化状态，那么这可能同时具有双重目的：发现繁殖活动并识别物种。理想情况下，需要开发一个包含性别、年龄和繁殖状态位点的基于甲基化的面板，以适用于渔业目的。下一步包括：（1）建立鱼类18SrRNA、cyp19a1a和dmrt1的基因数据库；（2）确定这些基因在生殖腺和eDNA上是否有相同的甲基化水平；（3）设计一种可量化的方法来测试eDNA，以提供性别和产卵的比率。
3.3 生理和健康状态
与DNA不同，RNA转录本在整个生物体的生命过程中拷贝数相对恒定，但其表达水平会根据生理状态和条件而变化。例如，与压力或感染相关的基因或幼体发育基因的高表达水平可能反映了鱼类的健康或生理状态（Glover等人，2024年；Salisbury等人，2024年）。初步的水箱实验成功鉴定了斑马鱼中表达的基因的信使RNA（mRNA）（Tsuri等人，2021年）。Hechler等人（2023年）通过分析水样中的eRNA，展示了环境转录组学可以通过寻找标记基因（如热应激相关基因）来突出应激反应。微RNA（miRNA）是21-23 bp的单链RNA分子，参与基因表达的调节。它们是很有前途的eRNA目标，因为它们比mRNA更稳定，可以在所有鱼类来源中找到，如配子、尿液、粪便、黏液和上皮组织，并且被认为会通过囊泡或外泌体排出（Ikert等人，2021年；Veilleux等人，2021年）。应该注意的是，miRNA在不同分类群中高度保守，这可能会混淆从eRNA样本中得出物种特异性推断的能力，但在存在压力源（如热浪、缺氧、污染物等）的情况下，miRNA可能有助于推断鱼类的健康状况或整个脊椎动物群落的健康状况。尽管在细菌和病毒中只鉴定出了少数miRNA（Cardin & Borchert，2017年），但在水样中检测到的miRNA主要来自真核生物。Ikert等人（2021年）使用qPCR测量了水箱中在压力源作用前后 Rainbow鳟鱼的miRNA水平，发现miRNA浓度在压力源作用下增加。由于miRNA长度较短，因此它们是难以处理的靶标，但有一些策略可以使用qPCR来分析miRNA：茎环法、多聚腺苷酸化或连接适配器后再进行逆转录等（Forero等人，2019年）。挑战在于从整个生态群落中获得的混合eRNA样本中找到“针尖在草堆中”的特定物种转录组信息（即物种特异性的转录组数据）。目前尚不清楚相近物种之间的区别是否明显。然而，我们的目标是在具有高度多样性和混合信号的真实-world样本中研究一两个感兴趣的物种，这在检测能力、读取深度、基因参考数据库和特异性方面都是一个重要的进步。例如，在一项关于中型生态系统的研究中，仅有0.5%的环境mRNA读段被映射到目标物种的基因组上（Hechler等人，2023年），但该研究并未进行poly(A)富集操作。真核生物的mRNA可以通过与真核生物mRNA的poly(A)尾部结合的寡(dT)磁珠来轻松富集。宏转录组学可用于监测生态系统层面的响应和条件（Semmouri等人，2020年；Yates等人，2021年），但预计eRNA会受到微生物RNA的干扰，就像eDNA一样（Hiki，2025年）。另一种方法是使用DNA甲基化来识别海洋酸化效应、污染物的存在或热应力，这已在珊瑚物种Pocillopora damicornis（Sogin等人，2016年）和Stylophora pistillata（Liew等人，2018年）以及鸡（Pértille等人，2020年）的研究中得到验证。据我们所知，目前还没有利用宏转录组学来研究野生鱼类健康状况或生理状态的研究，无论是基于mRNA、eRNA中的miRNA还是甲基化eDNA。
接下来的步骤包括：（1）优化从总RNA中富集mRNA或miRNA的方法；（2）寻找特异性标记物；（3）验证eRNA与组织特异性mRNA信号之间的关系；（4）开发分析方法。
3.4 丰度（生物量估计）
关于鱼类丰度的数据和趋势有助于确定鱼类资源是过度捕捞、捕捞不足还是处于最佳水平。这对于设定捕捞限额和制定可持续渔业管理的有效策略至关重要。鱼类eDNA生物量估计的基本原理是水样中存在的鱼类DNA数量与该水域中鱼类种群生物量之间的直接相关性（Baetscher等人，2025年；Maes等人，2024年）。然而，准确估计的障碍包括生物和技术重复实验之间的高度变异性（Maes等人，2024年）、不同水温下DNA释放率的变化（Jo等人，2019年），以及鱼类的大小、代谢活动和发育阶段，还有水体条件（如静水、流水、水流）以及其他生物和非生物因素（Yates等人，2019年）。eDNA的定量通常使用物种特异性的杂交探针（TaqMan探针）和引物来进行，通过定量PCR（qPCR）或数字PCR（dPCR）仪器上的荧光信号来测量目标分子的扩增情况。这就是所谓的靶向DNA方法。qPCR分析依赖于生成标准曲线来关联并推断未知样本中的目标eDNA数量。与qPCR不同，dPCR将样本分成数千个单独的反应，可以使用微流控芯片、滴液或纳米孔，产生阳性（目标序列扩增）或阴性（无扩增）结果的数字读数。计数阳性分区的数量，并使用统计泊松分析来确定原始样本中目标分子的初始拷贝数，因此不需要构建标准曲线，这可能会因实验而异，需要特别注意。这两种方法都非常敏感和准确，前提是检测过程高效且设计合理；不过，dPCR在检测限的低端具有更高的检测概率（Guri，2024年）。尽管dPCR有这些优势，但由于仪器成本较高，试剂成本也相对较高，这限制了该技术的普及。目前已有多项研究表明，通过qPCR或dPCR测量的目标eDNA浓度与拖网、刺网或声纳拖网调查估计的生物量之间存在高度相关性，即使是在广泛的地理分布范围内也是如此（例如，湖鳟Salvelinus namaycush、大西洋鳕鱼Gadus morhua、普通鳎鱼Solea solea和欧洲 plaice Pleuronectes platessa、太平洋鳕鱼Merluccius productus以及瓦利鱼Sander vitreus）（Lacoursière-Roussel等人，2016年；Maes等人，2024年；Salter等人，2019年；Shelton等人，2022年；Spear等人，2021年）。有关如何将eDNA指标整合到渔业资源评估中的路线图，可以参考Baetscher等人（2025年的研究；关于多年数据整合的案例，可参考Johnson等人（2025年的研究）。虽然可以在多重PCR反应中同时进行三个或四个物种的靶向DNA定量，但理想情况下，多物种定量会更省力、成本更低，并且使用的珍贵DNA量也更少。介于qPCR/dPCR和宏条形码之间的中间方法是高通量qPCR（HT-qPCR）（Wilcox等人，2020年）。这种方法允许在HT-qPCR平台上使用微流控技术和低体积反应并行分析大约20个目标（即分类单元）（van der Pouw Kraan等人，2024年；Wilcox等人，2020年）。然而，这种方法需要预扩增，并且还需要进一步的工作来证明其定量能力。来自eDNA宏条形码的扩增子读数可以同时提供许多物种的丰度信息，显示出eDNA与拖网数据之间的正相关（Afzali等人，2021年；Stoeckle等人，2021年；Thomsen等人，2016年）。不过，宏条形码数据集的组成特性使得它们仅在比例空间内具有信息价值（Shelton等人，2023年），除非能够解释DNA扩增方法中的偏差。这是因为在混合样本中，某些物种在使用通用标记时扩增效率更高，从而导致原始数量和比例的误表示（Kelly等人，2019年；Shelton等人，2023年）。因此，除非用目标物种的定量数据进行校准，否则宏条形码方法不能直接提供环境DNA的绝对数量，特别是对于数量较少的鱼类（Rund等人，2024年）。在DNA池中添加已知浓度的内部标准可以在一定程度上帮助模型化定量宏条形码（Wu等人，2024年）。为了进一步提高定量宏条形码的可靠性，可以通过对代表宏条形码研究中最常见的物种的已知DNA浓度进行测序模拟社区来校准模型（Ledger等人，2024年；Shelton等人，2023年）。另一种校准宏条形码数据的方法是将其与传统的采样观察（例如，拖网捕获）或来自dPCR或qPCR的一个或多个物种的定量数据结合，或者使用模拟社区的数据来校准影响eDNA信号的过程，以便在统计贝叶斯框架中考虑PCR偏差，并将宏条形码数据与多个物种的丰度相关联（Guri等人，2025年；Guri，Shelton等人，2024年）。与总丰度指标同样重要的是捕捞率，也可以评估从环境中提取的资源的价值。船上观察员、日志和捕捞记录通常可以提供这方面的信息。一种新的方法是利用来自鱼缸中的残余（或盐water）eDNA来评估不同鱼类的捕捞比例和评估大型商业渔船的副渔获物（Green等人，2024年；Urban等人，2022年）。在这种情况下，与常规的eDNA研究不同，目标捕捞物种的浓度较高，而副渔获物的浓度较低。这种信息来源有可能提供捕捞量的生物量估计，因为我们可以获得eDNA浓度、鱼缸体积和一些鱼类的测量数据。还有潜力利用qPCR、宏条形码、原生DNA测序等方法获得用于种群遗传学和其他生物指标的种内数据，如手稿中其他地方所解释的。正如第4.3节后面提到的，副渔获物的组成可能包含濒危物种，这也具有法医意义。如后文所述，RNA中的核糖体组分（rRNA）在eRNA样本中以分离和扩增的核糖体亚基的形式富集，而相应的基因在基因组中则呈簇状排列（例如：线粒体中的12S和16S以及不同染色体中的28S、5.8S和18S）。这些片段可以从其余的转录组中选择出来，然后使用Oxford Nanopore测序进行直接测序（Semmouri等人，2020年）。需要注意的是，在使用Oxford Nanopore直接测序的情况下，不会对cDNA链进行测序，只是合成为测序过程中RNA的线性结构，以避免纳米孔堵塞。然而，据撰写本文时所知，直接RNA测序套件（SQK-RNA004）的准确性估计为98.9%（使用Dorado sup v5.2进行碱基调用）。据我们所知，目前还没有关于从eRNA样本中定量分析鱼类核糖体亚单位的研究，但已在浮游动物样本上进行了相关研究。宏转录组学可以有两个目的：一方面是研究生物过程的基因转录，从而了解生理状态；另一方面是描述整个群落（Semmouri等人，2020年）。软件metaxa2（Bengtsson-Palme等人，2015年）可用于从宏基因组数据中识别和分类小核糖体亚单位和大核糖体亚单位rRNA。下一步的工作包括：（1）优化进行eRNA直接宏条形码的协议；（2）建立更完整的rRNA数据库，包括18S、部分28S（在不同动物中长度不同）以及少量的线粒体亚单位（12S、16S）的片段；（3）理解多拷贝转录基因与生物量之间的关系，因为RNA的数量会随着细胞周期和生长阶段而大幅变化（Delgado等人，2013年）；（4）减少eRNA中的细菌比例，最大化真核生物的比例，理想情况下是鱼类比例。
3.5 种群基因组学
在渔业中，种群基因组学方法可用于建模亲缘关系和/或贡献个体的数量，以估计种群的规模和变化（Waples & Feutry，2022年）。它还可以提供有关种群遗传结构、种群动态、连通性、种群识别以及种群分布范围的信息（Bravington等人，2016年），以及海鲜的可追溯性。来自科学调查和商业渔业的样本的遗传数据可以显示不同种群之间的混合（Rodríguez-Ezpeleta等人，2019年）。历史上，种群基因组学方法主要使用有限的标记物来进行研究，但最近通过测序基因分型（如SNP基因型）、减少表示的基因组测序（如RADseq）以及低覆盖度的全基因组测序（Díaz-Arce等人，2024年；Mastrochirico-Filho等人，2021年）得到了发展。这些研究中最常用的DNA来源是来自被捕捞标本的鳍片段或用于招募监测的野生鱼类基因标记，但基于eDNA的分析也可能对这些问题有潜力。然而，eDNA是一个多物种和多个个体的混合样本，与鳍片段或组织相比，获取类似的种群基因组指标会面临挑战（Adams等人，2019年）。有许多源于种群基因组学方法的种群诊断测试可以适应于使用eDNA样本的研究。例如，对pantophysin（Pan I）基因的一个位点进行简单的qPCR诊断测试，能够在确定捕获物中一个种群比另一个种群更丰富后快速评估挪威的混合鳕鱼种群（Dahle等人，2018年）。这有可能用于捕捞前的实时定量分析。几项研究集中在mtDNA D-loop区域这一变量上，发现其单倍型与从组织样本中生成的单倍型在序列和相对频率上相匹配（例如，鲸鲨[Rhincodon typus]、河鲉[Cottus nozawae]、雀鳝[Plecoglossus altivelis]）（Nakajima & Tsuri, 2024; Parsons et al., 2018; Sigsgaard et al., 2016; Tsuji et al., 2020）。此外，Nakajima和Tsuri（2024）扩增了D-loop的一个400-bp片段，并发现单倍型的eDNA空间分布与河流系统中通过距离隔离和遗传屏障模式的结果一致。只要所选的标记具有足够的单倍型分辨率，系统地理学方法就提供了机会（Riley et al., 2025）。即使是针对圆鳍鰕虎鱼(Neogobius melanostomus)的核微卫星标记（长度为410–440 bp），也通过大规模并行测序方法从eDNA样本中进行了研究（Andres et al., 2021）。为混合DNA研究开发的工具，如法医学、饮食研究甚至eDNA研究，可以基于种群等位基因频率以及鉴定的独特等位基因数量来估计独特遗传贡献者的数量，从而可用于估计有效种群规模和种群结构（Andres et al., 2023; Brandão-Dias, Guri et al., 2025; Sethi et al., 2019; Weir et al., 1997）。这需要预先了解种群等位基因频率，对于一些商业物种来说这是可行的；然而，转向多等位基因微单倍型（即一个DNA片段中的多个SNP和等位基因组合）将有助于基因型的个体化，并为那些特性不明显的类群提供了一条途径。尽管eDNA的混合来源可能使得区分个体和物种变得更加困难，但它也可以实现更富有信息量和成本效益的监测计划，同时研究多个物种。来自eNA的种群遗传学研究可以用于调查无法用拖网捕捞的物种以及通过深海海绵研究的深海生物。下一步包括：（1）富集目标多等位基因标记，以便能够检测低频等位基因；（2）针对感兴趣的特定物种或多物种；（3）基于模型优化的DNA混合物估计（假等位基因和等位基因丢失对贡献者估计的影响）。另一种可行的方法是将多个体样本转化为一系列单细胞样本。来自非裂解水样的细胞分选结合单细胞测序可能有助于确认遗传谱型的独特来源并确定鱼类杂交情况。通过在采样的步骤中使用宽孔径过滤器来优先收集脊椎动物细胞，或在细胞分选器上设置更宽的选择参数（约10–20 μm），可以收集到更多的脊椎动物细胞，但也会收集到许多其他动物的配子。对于环境水样，使用荧光激活细胞分选器（FACS）来区分组织特异性和物种特异性细胞可能会很有挑战性，因为FACS在活细胞上更有效，因为荧光标记需要结合在可能随时间在环境中降解的细胞外蛋白质上。细胞分选器正变得越来越经济实惠，未来可能会用于鱼类的单细胞测序。
4. 方法学解决方案：复杂环境样本的处理：eNA的富集和去除
环境样本的固有性质使它们成为来自不同分类群的分子的混合物。尽管这是一种获取广泛生物多样信息的强大资源，且非侵入性高、收集相对容易，但难点在于找到合适的方法，因为起始材料中非目标分子含量丰富。在大多数情况下，将整个环境样本作为一个整体来分析是不切实际的，因为由于其他目标和非目标分子的干扰，稀有目标可能会被忽略。因此，需要找到一种方法来选择或富集核酸中的感兴趣的类群或区域，尽管这可能会影响结果。在渔业采样活动中获得的环境样本中，这些非目标物种主要是微生物（主要是细菌），而在少量的真核DNA中，浮游植物是最丰富的DNA来源（Bar-On et al., 2018; Stat et al., 2017）。靶向测序可以通过两种方式增强：富集感兴趣的类群或去除非目标类群。在这方面，可以利用核酸的核苷酸结构、表观遗传特征或分子的长度和性质等特点（表1）。
表1. 用于渔业种群评估的环境核酸方法的工具箱列表。
| 目的 | 起始材料 | 目标 | 方法 | 发展 | 基础参考文献 |
|-------|---------|------|------|---------|
| 年龄和年龄结构 | eDNA | eDNA甲基化 | 测序 | 表观遗传钟 | Piferrer and Anastasiadi (2023)b |
| 性别鉴定 | eDNA | eDNA甲基化 | qPCR | cyp19a1a, dmrt1 | Valdivieso et al. (2023)b |
| 繁殖状态 | eDNA | eDNA甲基化 | 测序 | 18SrRNA基因的CpG位点 | Hirayama et al. (2024)c |
| 生理状态 | eRNA | mRNA | 测序、qPCR | 差异表达 | Hechler et al. (2023)c |
| 测序 | 成熟转录组学 | Semmouri et al. (2020)b | miRNA | qPCR | Ikert et al. (2021)c |
| eDNA | eDNA甲基化 | 测序 | 标记面板 | - | -
| 定量 | eDNA | 线粒体DNA | qPCR | Shelton et al. (2022)c |
| 核DNA | 基因分型 | 微卫星 | Andres et al. (2021)c | SNP分型 | 微单倍型面板 | - |
| 杂交 | 悬浮细胞 | 单细胞测序FACS | - | -
缩写说明：eDNA，环境DNA；eRNA，环境RNA；FACS，荧光激活细胞分选器；mRNA，信使RNA；miRNA，微RNA；qPCR，定量PCR；SNP，单核苷酸多态性。
a 提供的参考文献主要强调了这些技术的基础概念验证，这些技术需要进行适应。
b 本研究中使用了组织样本。
c 研究中使用了环境核酸。
d Green等人（2024）进行了代谢组学测试，但为了使其可量化，我们提出了一种qPCR方法。迄今为止，只有两项研究在微宇宙实验中使用了环境DNA（eDNA）的甲基化水平，一项是关于淡水蜗牛（Lymnaea stagnalis）（Zhao等人，2023年），另一项是关于斑马鱼（Danio rerio）（Hirayama等人，2024年）。值得注意的是，研究发现eDNA的甲基化状态在从个体释放时是稳定的或固定的，即使经过数月的不同防腐处理也不会发生降解（脱甲基化），因此假设不需要使用特殊的或专门的保存或提取方法，这使得eDNA成为一种可靠的甲基化DNA来源（Hirayama等人，2024年；Zhao等人，2023年）。如第3.1节所解释的，这种表观遗传特征有可能成为渔业研究中的非常有用的生物标志物。通过利用脊椎动物较高的甲基化率，可以富集脊椎动物DNA以减少eDNA中的细菌成分（Chiou & Bergey，2018年）。这种方法使用结合了IgG1抗体Fc片段的甲基-CpG结合域蛋白。这种蛋白-Fc复合物可以与顺磁性蛋白A珠或蛋白G/A-琼脂糖试剂结合，用于免疫沉淀，这两种试剂都可以在市场上买到。这种低成本的方法与其他下游文库制备程序兼容，可以选择性分离出高甲基化比例的基因组，其中最具吸引力的是能够对富甲基化样本进行鸟枪法测序（详见Chiou和Bergey（2018年）以及NEBNext Microbiome DNA Enrichment的协议）。我们假设应该寻找有利于保存高分子量DNA的提取方法，以避免片段化，从而避免丢失感兴趣的低甲基化区域。
4.5 使用CRISPR-Cas9进行靶向序列选择
CRISPR-Cas9内切酶可以通过导向RNA切割双链DNA，这些RNA通过互补性指导其特异性搜索。这种能力可以用来实现目标基因的无扩增增强或去除不需要的目标，例如年龄和性别标记，或者在宏条形码研究中分解不需要的扩增子（例如，自然样本中的宿主）。已经开发出了通用的鱼类线粒体导向RNA（Ramón-Laca等人，2023年）。选择可以通过使用之前附有测序适配器的eDNA切割非目标区域来实现，从而保留两端都有适配器的片段，这些适配器在某些测序平台上是必需的。另一种方法是将所有eDNA去磷酸化，仅在切割位点重新磷酸化，从而允许适配器仅在这些特定位置附着，并随后对所需的片段进行测序（Kardailsky等人，2025年）。然而，虽然无法进行测序，但非目标DNA仍然存在于样本中，并且在Oxford Nanopore方法中会干扰测序步骤，导致纳米孔堵塞和“死亡”（Ramón-Laca等人，2023年）。因此需要后续处理来纯化目标DNA片段。这可以通过CRISPR-Cas9目标捕获来实现，用DNA聚合酶和ddNTPs封闭DNA的3′末端，然后用Cas9和gRNA复合物切割经过ddNTP处理的DNA（Slesarev等人，2019年）。目标序列的新钝端可以通过dUTP-生物素或带有生物素化5′末端的双链适配器进行标记，该适配器还包含一个罕见的切割限制性酶位点（AsiSI），并通过链霉亲和素包被的磁珠从其余DNA中分离出来（Slesarev等人，2019年）。另一种策略是使用失活的Cas9蛋白（EnGen® Spy dCas9，New England Biolabs），该蛋白通过gRNA与目标结合，并可以用生物素标记，然后用磁珠选择目标片段，随后进行蛋白酶K处理以释放双链DNA（Liu等人，2017年；Slesarev等人，2019年）。此外，还需要进一步开发多重测序能力。这可以通过在切割后为新生成的末端附上唯一的条形码来实现。无论如何，在处理DNA时应特别小心，以免在选择性处理后进一步破坏DNA，从而避免产生新的非特异性断裂，增加非目标DNA测序的可能性。
4.6 使用CRISPR-Cas9进行靶向测序
CRISPR-Cas9内切酶可以通过导向RNA切割双链DNA，这些RNA通过互补性指导其特异性搜索。这种能力可以用来实现目标基因的无扩增增强或去除不需要的目标，例如年龄和性别标记，或者在宏条形码研究中分解不需要的扩增子（例如，自然样本中的宿主）。已经开发出了通用的鱼类线粒体导向RNA（Ramón-Laca等人，2023年）。选择可以通过用之前附有测序适配器的eDNA切割非目标区域来实现，从而保留两端都有适配器的片段，这些适配器在某些测序平台上是必需的。或者，可以通过将所有eDNA去磷酸化，并仅在切割位点重新磷酸化末端，从而允许适配器仅在这些特定位置附着，并随后对所需的片段进行测序（Kardailsky等人，2025年）。然而，虽然这些eDNA无法用于测序，但非目标DNA仍然存在于样本中，并且在Oxford Nanopore方法中会干扰测序步骤，导致纳米孔堵塞和“死亡”（Ramón-Laca等人，2023年）。因此需要后续处理来纯化目标DNA片段。这可以通过CRISPR-Cas9目标捕获来实现，用DNA聚合酶和ddNTPs封闭DNA的3′末端，然后用Cas9和gRNA复合物切割经过ddNTP处理的DNA（Slesarev等人，2019年）。目标序列的新钝端可以用dUTP-生物素或带有生物素化5′末端的双链适配器进行标记，该适配器还包含一个罕见的切割限制性酶位点（AsiSI），并通过链霉亲和素包被的磁珠从其余DNA中分离出来（Slesarev等人，2019年）。另一种策略是使用失活的Cas9蛋白（EnGen® Spy dCas9，New England Biolabs），该蛋白通过gRNA与目标结合，并可以用生物素标记，然后用磁珠选择目标片段，随后进行蛋白酶K处理以释放双链DNA（Liu等人，2017年；Slesarev等人，2019年）。此外，还需要进一步开发多重测序能力。这可以通过在切割后为新生成的末端附上唯一的条形码来实现。无论如何，在处理DNA时应特别小心，以免在选择性处理后进一步破坏DNA，从而避免产生新的非特异性断裂，增加非目标DNA测序的可能性。原则上，如果eDNA是高分子量并且得到了良好的保存和提取，那么使用Cas9进行靶向测序的方法允许长片段测序（Ramón-Laca等人，2023年）。到目前为止，CRISPR Cas12或Cas13酶仅用于物种特异性超灵敏检测实验，其中切割产生荧光，而尚未用于宏基因组或鸟枪法测序。虽然还没有使用CRISPR Cas9来富集或去除eDNA的研究，但这种方法在物种鉴定和宏条形码方面具有巨大潜力；然而，需要先开发和优化纯化的目标eDNA片段，使其成为更经济高效和实用的渔业方法。
4.6 选择性测序
选择性测序提供了一种方法，在测序步骤中富集感兴趣的区域或去除非目标区域，仅适用于Oxford Nanopore测序仪中的所谓“自适应采样”方法。这种方法基于与参考序列数据库或基因组的匹配，使用Oxford Nanopore测序平台进行实时碱基调用（ pubblications.nanoporetech.com）。这种方法需要强大的计算能力来解释（碱基调用）遗传信号并实时做出决策。这种方法可以与其他富集方法结合使用，如上所述。
5. 结论性评论
我们生活在一个渔业资源评估现代化的重大机遇时代。虽然遗传和基因组方法已经使用组织样本改变了渔业科学领域，但向环境核酸（eNA）的转变提供了可扩展的替代方案。从样本到环境样本的转变带来了挑战，但也为研究复杂的人口统计和生理指标开辟了新的途径，而无需采用侵入性和致命性的策略，如电捕鱼、活检、陷阱捕鱼或常规捕鱼，只需进行水样采集。在这里，我们提供了关于eNA的技术进步和实验前景的广泛框架（总结在表1中），重点在于缩小差距并提供见解，以便广泛应用并改进、优化和加速渔业管理的数据收集。由于这里讨论的基于eNA的方法仍在开发中，它们的未来应用的潜在限制尚未详细说明。这些限制在很大程度上仍然是不可预见的，只有随着方法的成熟和在多种渔业评估环境中的广泛应用才会显现出来。特别是某些方法（如机器学习）的全部潜力尚未预料到。尽管存在技术能力来识别必要的标记并增强其在渔业资源评估领域的适用性，但仍需要努力以释放这些能力，尤其是在多样化和混合来源的样本（如eDNA或eRNA）中。基因组测序的不断进步加上日益增加的费用可行性提供了丰富的资源。事实上，大多数对渔业和水产养殖最重要的物种的基因组已经可用（Lu & Luo，2020年）。国际上正在进行的努力包括脊椎动物基因组项目（https://vertebrategenomesproject.org/）、欧洲参考基因组图谱（https://www.erga-biodiversity.eu/）或地球生物基因组项目（https://www.earthbiogenome.org/）。然而，这些基因组发展在渔业评估中尚未得到充分利用（Bernatchez等人，2017年）。挑战在于开发和优化这些方法，以充分利用eNA，这并非易事。根据取得的进展和所涉及的渔业类型，eNA方法可以补充或至少扩展当前的监测方法。与传统方法相比，它们可能带来巨大的成本效益，因为它们可以更广泛地应用，并且在野外需要的设备和人员更少。然而，应该努力优化方法、验证和开发协议，以确保数据的可比性和可靠性。然而，应该注意的是，采样后的步骤（实验室和分析）可能非常繁琐。将基于组织的方法的分子技术转移到环境样本中，尤其是在目标浓度较低的情况下，可能不可行。结合使用eDNA和eRNA提供了更全面和强大的渔业评估方法。eRNA可以通过提供有关鱼类种群及其环境的额外信息来补充eDNA，提供当前水生环境中鱼类种群的快照，提供关于鱼类种群及其生态相互作用的即时见解。它还可以提供有关鱼类生理状态的信息，如应激水平、繁殖状况、性成熟度、生活阶段和疾病易感性。eRNA分析仍存在方法学限制，例如在野外防止降解的保存方法以及从环境样本中合适的提取方法，以加速其适用性。需要进一步研究定量eRNA宏条形码。对于寿命较长的商业重要鱼类（如金枪鱼、大西洋鳕鱼、欧洲和亚洲海鲈以及大西洋鲑鱼等），年龄评估至关重要。确定产卵和育苗场对于确保鱼类繁殖和帮助建立海洋保护区或禁渔区也非常重要。年龄评估还有助于测量招募、生长和死亡率，从而获得更准确的生物量估计。鉴于已经为许多脊椎动物开发了表观遗传时钟，开发适用于鱼类的表观遗传时钟似乎很有前景。对于短寿命和长寿命鱼类，表观遗传时钟都是关键，因为商业上重要的鱼类具有广泛的寿命范围。鼓励在可能的情况下（Cordier等人，2021年）定期收集成对的eDNA和eRNA生物重复样本，进行长期监测，以检测生物多样性、栖息地破坏和生物量的变化。此外，eDNA和eRNA还可以提供更全面的水生生态系统图景，因为它们与渔业无关，即样本不与捕获前后相关联。一旦这些方法得到开发并随后通过传统方法验证和校准，它们将理想地提高多物种方法的生物监测能力，具有更精细的空间尺度分辨率。朝着详细的采样和实验室协议及技术以及开源设备的方向发展是必要的，以使工作流程民主化。研究人员、政策制定者和行业利益相关者之间的合作也是必要的，以确保基因组方法成为渔业评估的组成部分。此外，许多分析设备（如qPCR、测序）都有便携版本，如果在现场研究中获得，可以加速数据生成并加快管理决策。重要的是要有良好的采样策略，考虑到时间和空间尺度以及生命周期的变化。此外，还需要考虑季节性迁移和昼夜垂直迁移（Canals等人，2021年；Easson等人，2020年；Jensen等人，2022年；Shelton等人，2022年）的采样时间和地点，以及如何最大化采样效率，以减少工作和成本，同时获得和保留生态信息。此外，还需要鼓励建立共享的遗传参考数据库及其相关的元数据（Bertola等人，2024年；Wilkinson等人，2016年），以促进跨边界的 数据整合。像全球生物多样性信息设施（GBIF，gbif.org）或OBIS（obis.org）这样的倡议有助于共享有关所有生命形式的信息。为了将来自eNA的信息整合到资源评估框架中，管理者和资源评估人员需要与调查技术人员、遗传学家和建模人员密切合作，确保调查符合标准和要求（Baetscher等人，2025年）。本综述全面评估了eNA研究的当前状态，并确定了未来发展的关键领域。本文列出的潜在进展以及其他可能随着技术进步而出现的进展，可以带来变革性的 improvements，并为渔业资源评估提供更多支持。利用环境核酸产生的数据的真正价值将取决于其是否独立于渔业活动、其多物种定量能力，以及能否覆盖更广泛的分布范围，包括产卵场——这些通常是基于渔业的传统方法所忽略的区域，或者那些无法进行拖网捕捞或受到保护的区域。政府和区域联盟可以从使用环境核酸中受益，因为这种方法能够以较低的成本在全球范围内定期进行常规采样，而且是非致命、非侵入性的。
**作者贡献**
ARL构思了这项研究并撰写了初稿，KMN、KMP、RG、DRV、ID和AR对稿件提出了意见并参与了修改工作。
**致谢**
我们衷心感谢西班牙国家自然科学博物馆（CSIC）的分子系统学与种群遗传学实验室提供的宝贵建议，同时也感谢两位内部审稿人、一位匿名审稿人以及编辑对稿件的精心修改，这些工作极大地提高了稿件的质量。
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