综述：Ca2+激活的Cl–通道：Bestrophins与TMEM16A是否相互作用？

目的：Ca2+激活的Cl–电导存在于多种细胞类型，对调节膜电位及其他细胞功能十分重要。跨膜蛋白16A（TMEM16A）被广泛认为是Ca2+激活的Cl–电导的主要分子基础，但Bestrophin家族成员也可能对某些Ca2+激活的Cl–电导很重要。 方法：在这篇综述中，研究人员讨论了Bestrophin和TMEM16A两个家族的成员可能发生相互作用的可能性。 结果：在心血管系统中，证据最为充分。在此系统中，(1) TMEM16A和Bestrophin-3在膜上紧密定位；(2) TMEM16A可能调节Bestrophin-3的表达；以及(3)一种cGMP依赖的Ca2+激活的Cl–电导同时依赖于TMEM16A和Bestrophin-3。在心血管系统之外，TMEM16A和Bestrophins均与不依赖于膜电位的细胞钙（Ca2+）调节有关，并且两种蛋白均与炎症和疼痛传递密切相关。然而，似乎很少有关于TMEM16A和Bestrophins直接相互作用的测试被发表。 结论：研究人员得出结论，在心血管系统中有证据表明TMEM16A和Bestrophins之间存在直接相互作用，而确定类似的相互作用是否延伸到其他组织将是很重要的。

1 Bestrophins与TMEM16A之间直接相互作用的证据

在血管平滑肌细胞中存在两种不同的Ca²⁺激活的Cl^–电导。一种是具有电压和时间依赖性的常规电导。另一种是严格依赖于cGMP，通过蛋白激酶G（PKG）介导的机制，无电压和时间依赖性，可被10 µM Zn²⁺抑制，且对常规氯通道阻断剂（如尼氟酸、IAA-94和DIDS）相对不敏感。该cGMP依赖性电流依赖于钙调蛋白，但独立于钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）。有趣的是，在血管平滑肌细胞中通常与超极化和细胞内Ca²⁺降低相关的cGMP，却能激活一种去极化的Cl^–电导。这两种电流存在于几乎所有被研究的血管床的平滑肌细胞中，但在肺动脉平滑肌细胞中仅存在经典电流，且两种电流的相对大小在不同血管床平滑肌细胞间差异很大。

基因敲低实验表明，敲低TMEM16A会抑制两种Ca²⁺激活的Cl^–电导类型。相反，敲低Bestrophin-3仅消除了由膜片钳内高Ca²⁺诱导的cGMP依赖性电流，而经典电流不受影响。这一发现得到了证实，即抗Bestrophin-3抗体在单通道记录中抑制cGMP依赖性电流，但不抑制经典电流。肺动脉平滑肌细胞缺乏cGMP依赖性电流，在转录和蛋白水平上均不表达Bestrophin-3，这为Bestrophin-3是该电流所必需提供了额外支持。cGMP依赖性电流同时依赖于Bestrophin和TMEM16A的存在，意味着这两种分子以某种方式相互作用。有以下几种可能性：

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  Bestrophin-3可能作为TMEM16A的一个亚基发挥作用。支持这种可能性的证据来自研究人员实验室获得的初步共定位证据，其中邻近连接分析（PLA）实验和单次免疫共沉淀实验强烈表明平滑肌细胞中TMEM16A和Bestrophin-3之间存在邻近性。在犬心室心肌细胞中也报告了Bestrophin-3和TMEM16A的共定位。
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  TMEM16A可能调节Bestrophin-3的表达。这种可能性通过下调TMEM16A导致血管平滑肌细胞中Bestrophin-3 mRNA（以及Bestrophin-1和-2）的下调来证明。TMEM16A也可能调节平滑肌细胞中其他重要分子的表达。
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  电流可能由Bestrophin-3介导，而TMEM16A调节Bestrophin-3的表达。cGMP依赖性电流对两种蛋白的依赖性可能反映了：(1) Bestrophin-3作为TMEM16A的亚基起作用；(2) TMEM16A调节Bestrophin的表达；或(3) 两种机制的组合。

总之，在血管平滑肌细胞中，有强有力的证据表明Bestrophins和TMEM16A在调节水平、共定位形式以及关于cGMP依赖性Cl^–电导方面存在直接相互作用。这种相互作用对血管功能有影响。血管舒缩振荡（即血管舒缩运动）是大多数血管床的常见现象，它依赖于Ca²⁺激活的cGMP依赖性Cl^–电导，并可通过Bestrophin-3敲低和TMEM16A敲低来抑制，这证明在组织水平上也存在Bestrophin-3和TMEM16A之间的相互作用。

2 Bestrophin和TMEM16A在控制细胞钙（Ca²⁺）中的作用

2.1 L型钙（Ca²⁺）通道

Bestrophins和TMEM16A可能通过其作为Cl^–通道的功能影响细胞膜电位，进而影响细胞内Ca²⁺。然而，也有证据表明它们可能通过与钙通道的其他类型相互作用来控制细胞内Ca²⁺。对于Bestrophin-1，有强有力的证据表明其在视网膜色素上皮细胞中与L型钙通道（Ca_v1.3）相互作用。因此，钙通道对眼电图的“光峰”至关重要，而“光峰”依赖于Bestrophin-1。在视网膜色素细胞中表达Bestrophin-1会改变L型钙通道活动的特性，包括将电压依赖性激活转移到更负的值和更快的激活动力学。在另外的实验中，在Bestrophin-1被删除的细胞中，ATP刺激后的细胞内Ca²⁺增加显著增强。后来研究表明，突变的Bestrophin-1通过物理相互作用与钙通道相关的β4辅助亚基，差异性地修改了Ca_v1.3的活性以及这些通道向细胞膜的运输。

在肺动脉平滑肌细胞中，TMEM16A与L型钙通道（Ca_v1.2）和IP₃受体共定位。这个结论基于在TMEM16A敲除小鼠中进行的免疫共沉淀实验、共聚焦和超分辨率显微镜观察。虽然这个簇中的所有三个通道对于对血清素的正常收缩反应是必需的，但结论是来自IP₃敏感池释放的Ca²⁺是收缩的主要驱动因素，而TMEM16A和L型钙通道通过释放Ca²⁺后重新填充肌浆网来发挥作用。该研究表明，L型钙通道和TMEM16A之间的简单相互作用远不能完整说明TMEM16A在平滑肌细胞兴奋-收缩耦合中的作用。

在心肌细胞中，存在Bestrophin-1、-2和-3，其中Bestrophin-3在mRNA水平上表达最丰富，其Ca²⁺激活的Cl^–电流可能在心肌细胞动作电位的1期复极中起作用。在犬和人类心脏心肌细胞中证实了Bestrophin-3的表达，并且TMEM16A存在于小鼠、犬和人类心脏中。犬和人类心肌细胞的免疫组织化学显示Bestrophin-3和TMEM16A共定位，但作者并未考虑这种共定位的功能后果。

总的来说，这些发现表明，Bestrophins和TMEM16A都参与调节Ca²⁺进入和释放的多蛋白信号复合体。

3 Bestrophin和TMEM16A可能调节钙（Ca²⁺）从内质网的释放

在Bestrophin-1敲除小鼠中，低ATP浓度下气管上皮ATP诱导的Cl^–分泌减少。在较高的ATP浓度下，野生型和敲除小鼠之间没有功能差异。对这一发现的解释是，Bestrophin-1可能是调节Cl^–分泌，而不是作为质膜中的实际通道。这些作者进一步提出，Bestrophin-1可能通过调节人支气管上皮细胞和小鼠视网膜色素上皮细胞内质网的Ca²⁺释放来调节包括TMEM16A在内的其他通道，在这些细胞中大部分Bestrophin-1似乎位于内质网。与这个位置一致，敲低Bestrophin-1减少了由SERCA泵抑制剂毒胡萝卜素诱导的内质网Ca²⁺释放，这表明Bestrophin-1可能作为Ca²⁺穿过内质网膜转移的反离子，从而有助于控制胞质Ca²⁺瞬变。也有证据表明，在Bestrophin-1敲除小鼠的视网膜色素上皮细胞中，静息胞质Ca²⁺浓度高于野生型小鼠的细胞，并且在Bestrophin-1突变小鼠的视网膜色素细胞中，Ca²⁺信号被抑制。然而，也有证据表明，Bestrophin-1可能位于视网膜色素上皮细胞的基底外侧，与TMEM16A一起提供Cl^–电导。目前没有信息表明这两种Cl^–电导是否有不同的作用，或者它们是否相互补充。

有趣的是，也有研究表明TMEM16A可能控制内质网的Ca²⁺释放。与Bestrophin类似，TMEM16A可能靠近内质网膜，并且TMEM16A似乎将IP₃受体束缚在细胞膜上。最后，在肠上皮细胞中敲除TMEM16A导致氨甲酰胆碱诱导的Ca²⁺瞬变减少。

总之，研究表明Bestrophins和TMEM16A都可能与IP₃受体相关，并且两者都有助于控制内质网的Ca²⁺释放。然而，没有直接证据表明Bestrophins和TMEM16A在这些功能方面存在相互作用。

4 Bestrophin和TMEM16A在疼痛感知中的作用

疼痛感知关键取决于去极化的阳离子电导，包括在背根神经节（DRG）神经元中表达的酸敏感离子通道3（ASIC3）和瞬时受体电位香草素1（TRPV1）通道。除了阳离子内流，Cl^–电导也有助于疼痛信号传导。在DRG神经元中，细胞内Cl^–通过Na、K、2Cl协同转运蛋白（NKCC1）积累。当Cl^–通道打开时，Cl^–外流发生，导致膜去极化并加剧疼痛反应。虽然GABA_A受体介导这些神经元中主要的Cl^–电流，但已显示Ca²⁺激活的Cl^–通道、Bestrophin-1和TMEM16A起重要的调节作用。这些通道可能在TRPV1介导的Ca²⁺内流的下游被激活，从而将阳离子进入与继发性Cl^–依赖性去极化机制联系起来。Bestrophin-1和TMEM16A都在脊髓和背根神经节（疼痛处理的关键部位）表达。在快速眼动睡眠剥夺诱导的触觉异常性疼痛中，背根神经节细胞中Bestrophin-1的表达增加，而脊髓背角细胞中Bestrophin-1的表达没有变化。相比之下，背根神经节细胞中TMEM16A的表达没有变化，而脊髓背角细胞中TMEM16A的表达减少。在同一项研究中，显示抑制Bestrophin-1和TMEM16A均能产生抗异常性疼痛效应。因此，尽管这两种蛋白对于疼痛感觉向大脑的传递很重要，但它们受到不同的调节，并且可能通过不同的机制起作用。

总之，Bestrophin和TMEM16A对于处理疼痛很重要，但其潜在机制和它们差异调节的功能后果仍不清楚。

5 Bestrophin和TMEM16A在炎症中的作用

有充分证据表明TMEM16A在炎症中起重要作用。TMEM16A在炎症中的作用清楚地反映在其发现历史中。在2008年被定义为Cl^–通道之前，TMEM16A被用作胃肠道癌症严重程度的标志物，而定义TMEM16A作为Cl^–通道作用的重要论文之一是基于促炎性白细胞介素4对Ca²⁺依赖性Cl^–电导的增强。来自多种组织的充分证据表明TMEM16A在炎症中起重要作用：TMEM16A对许多促炎信号的产生很重要，特别是NF-κB、几种白细胞介素、ERK1/2和Ca²⁺。有趣的是，TMEM16A的表达也受到几种炎症因子的调节，包括几种白细胞介素、组胺和缓激肽。因此，TMEM16A是炎症正反馈回路的一部分。在气道分化细胞中，敲低TMEM16A减少了细胞因子的释放，而抗寄生虫药物氯硝柳胺减少了气道细胞的炎症并抑制TMEM16A，这表明氯硝柳胺的部分抗炎反应是由对TMEM16A的作用引起的。

有趣的是，Bestrophin-1也被证明在炎症方面具有预测能力，例如在胆管癌中，而抑制Bestrophin-1功能可能导致视网膜炎症增强。此外，用脂多糖（LPS）诱导炎症会导致小胶质细胞中Bestrophin-1 mRNA和蛋白的表达增强，在培养的肾集合管细胞中，LPS会导致Bestrophin-1蛋白的短暂增加。总之，Bestrophin与炎症之间存在关系，尽管是复杂的关系。

这种复杂性在结肠炎中也很明显。在远端结肠上皮中，Bestrophin-2和TMEM16A均有表达，在化学诱导的结肠炎中，Bestrophin-2和TMEM16A的转录本均减少。然而，只有TMEM16A在蛋白水平降低，而Bestrophin-2蛋白没有变化。这种复杂调节的背景及其后果仍然未知。

血管炎症似乎也涉及Bestrophins和TMEM16A。血管壁的内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞表达Bestrophin-3。Bestrophin-1和Bestrophin-2在血管壁的表达相对较低，但有证据表明它们存在。Bestrophin-3是培养内皮细胞炎症反应的重要调节因子。在人脐静脉内皮细胞中上调和下调Bestrophin-3表明，Bestrophin-3抑制肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导的NF-κB激活，从而导致内皮细胞在体外释放细胞黏附分子受到抑制。这些发现在体内通过显示腺病毒感染Bestrophin-3可防止TNFα诱导的炎症而得到进一步证实。此外，TNFα诱导的炎症导致内皮细胞在体外和体内Bestrophin-3的表达降低。因此，Bestrophin-3和TNFα诱导的炎症之间存在相互作用。

与Bestrophin-3在由内皮介导的血管炎症中的“保护”作用一致，在血管平滑肌细胞中过表达Bestrophin-3会增加细胞活力并防止凋亡，而下调Bestrophin-3会增强过氧化氢（H₂O₂）诱导的凋亡并降低细胞活力。

巨噬细胞存在于健康的血管壁中：在动脉粥样硬化血管中，巨噬细胞数量增加、发生修饰，并有助于动脉粥样硬化斑块的发展。巨噬细胞表达Bestrophin-1，当比较动脉粥样硬化斑块巨噬细胞与正常组织驻留巨噬细胞的转录组时，发现许多差异表达基因。主成分分析和随后的蛋白质-蛋白质相互作用分析指出Bestrophin-1很重要，作者得出结论，Bestrophin-1可能参与动脉粥样硬化血管的炎症进展。

TMEM16A也与血管壁的炎症变化相关。这种关联从高血压、免疫调节和TMEM16A之间的关系中可以明显看出。高血压与动脉低度慢性炎症相关，这对高血压中小动脉的重塑很重要。血管紧张素II是一种已知的促炎物质，也会在小动脉中诱发低度炎症。最后，已知免疫系统在血压调节中有多种不同的作用。因此，有趣的是，在自发性高血压大鼠的肠系膜动脉和冠状动脉以及高NaCl饮食联合L-NAME（L-精氨酸甲酯）治疗诱导的高血压小鼠的主动脉中，TMEM16A表达增加，并且似乎对血管病理有作用。

在平滑肌细胞和周细胞中敲除TMEM16A可降低血压和对血管紧张素II的血压升高反应。这些对血压的影响是由外周阻力降低介导的，并且与平滑肌细胞和周细胞中Ca²⁺激活的Cl^–电流的去极化作用缺失相一致。然而，不能排除敲除TMEM16A的其他抗高血压作用。

内皮细胞特异性敲除TMEM16A也能降低血压。这种效应依赖于TMEM16A诱导的内皮细胞中产生活性氧（ROS）的NADPH氧化酶活性的稳定。TMEM16A在内皮功能中的这种作用转化为血压和对血管紧张素II输注的血压升高反应，这在内皮细胞特异性TMEM16A敲除小鼠的动脉中被减弱。

Zeng及其同事探讨了TMEM16A对血管炎症的具体作用。这些作者从观察牛蒡苷元（Arctigenin）降低自发性高血压大鼠动脉血压和超氧阴离子产生出发。在高NaCl/L-NAME诱导的高血压小鼠中，TMEM16A以及炎症标志物血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达增加。用牛蒡苷元治疗可降低血压，重要的是，也降低了TMEM16A、VCAM-1和ICAM-1的表达。这些效应在培养于高NaCl（169 mM）培养基中的小鼠主动脉平滑肌细胞中得到证实，导致TMEM16A、VCAM-1和ICAM-1高表达。作者提供了进一步的证据，表明TMEM16A下游的两个基因——内皮细胞特异性分子1（ESM1）和CXC趋化因子配体16（CXCL16）——对TMEM16A对VCAM-1和ICAM-1的作用很重要。因此，这项研究为TMEM16A在血压调节和血管炎症中的作用提供了直接证据。重要的是要了解TMEM16A对血压和炎症的影响在多大程度上是因果相关的。

实验性诱导的肺动脉高压也与肺动脉平滑肌细胞中Ca²⁺激活的Cl^–电流和TMEM16A表达的上调相关。相应地，在特发性肺动脉高压患者中，肺动脉平滑肌细胞中的Ca²⁺激活的Cl^–电流和TMEM16A表达强烈上调。这些研究没有涉及TMEM16A上调的机制。此外，在两种肺动脉高压模型中，用TMEM16A抑制剂苯溴马隆治疗降低了肺动脉压力并限制了血管重塑，而沉默TMEM16A表达则逆转了来自肺动脉高压患者的肺动脉平滑肌细胞的增强去极化和减少增殖。TMEM16A在肺动脉高压中上调的机制可能与相关的肺部炎症或内皮素（在肺动脉高压患者中增加）的作用有关。重要的是，在这些研究中观察到的内皮素诱导的TMEM16A上调可以通过应用抗炎脂质二十二碳六烯酸单酰甘油（MAG-DHA）或消退素D1（Resolvin D1）来预防。TMEM16A表达调节的另一个可能介质是缺氧，缺氧已被证明可增加小鼠冠状动脉内皮细胞中的Ca²⁺激活的Cl^–电流（很可能是由TMEM16A介导）。TMEM16A在肺动脉高压肺动脉中的存在及其功能作用的证据是强有力的，相关的血管炎症的作用可能很重要。

与高血压中TMEM16A表达增加相反，肾性高血压大鼠（2肾2夹高血压）基底动脉平滑肌细胞的Ca²⁺激活的Cl^–电导表达降低，TMEM16A表达减少。这与炎症与TMEM16A表达增加相关的普遍观点相反。然而，尽管作者认识到了这一点，但他们没有讨论。此外，在基底动脉平滑肌细胞中，血管紧张素II诱导的增殖通过敲低TMEM16A促进，并通过过表达TMEM16A抑制。TMEM16A的这种作用是通过抑制细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E的表达，从而导致细胞周期停滞在G0/G1期。了解这些效应是由TMEM16A作为Cl^–通道的作用介导的，还是由TMEM16A的不相关效应介导的，具有相当大的意义。阐明TMEM16A在血管重塑和收缩性方面的作用的这种差异是反映了血管床之间的差异（即肺与脑动脉），还是实验条件的结果，也很重要。总之，TMEM16A和Bestrophins都与炎症过程有关；但它们之间的任何相互作用是否对炎症反应很重要，目前尚不清楚。

总之，Bestrophins和TMEM16A广泛共表达，并经常影响重叠的生理过程。在血管平滑肌中，证据支持功能协作、共定位和调节串扰。然而，这种相互作用的分子基础仍未解决。令人惊讶的是，人们对Cl^–电导本身或细胞内Cl^–浓度在Bestrophins和TMEM16A多种功能中的作用知之甚少。对于TMEM16A表现出的许多转录和翻译效应尤其如此。未来的研究应澄清归因于TMEM16A（以及潜在的Bestrophins）的转录和翻译效应是由细胞内Cl^–浓度的变化、不依赖于通道的信号功能，还是蛋白质-蛋白质相互作用介导的。