大分子治疗药物在治疗多种疾病方面展现出显著优势与潜力。然而，其固有的理化性质往往阻碍了高效细胞内递送所需合适载体的选择。在此，研究人员开发了通过寡肽与DNA的液-液相分离（LLPS）形成的凝聚层，作为细胞膜转运的大分子载体。这些材料能够高效募集并释放包括蛋白质和酶在内的生物大分子。值得注意的是，实验数据表明，其细胞摄取途径可能不完全等同于经典的内吞途径，而是涉及胆固醇依赖性的脂筏相互作用，这提示其机制可能区别于经典的网格蛋白介导的内吞作用。在进入细胞质后，凝聚层的DNA组分被细胞内DNA处理酶降解，导致凝聚层解体并随后释放治疗性大分子。综上，这些凝聚层建立了一个可推广的大分子治疗药物细胞内递送平台，整合了膜转运与可编程的胞质释放功能。
一、 研究背景与目的
随着生物医学的发展，以核酸、蛋白质、多肽等为代表的大分子治疗药物已成为治疗癌症、心血管与代谢疾病、自身免疫性疾病及遗传异常的有力手段。然而，其临床应用常因递送挑战而受限。这类药物具有亲水性和大分子尺寸的特性，限制了其穿透质膜屏障的能力和体内生物利用度。此外，通过内吞作用摄取的药物若未能有效实现内体逃逸，其胞内有效浓度将大幅降低。现有细胞内递送策略主要包括物理穿透法和纳米载体介导的穿透法（如脂质体、二氧化硅纳米颗粒、工程化外泌体等）。然而，这些方法存在局限性：机械方法（如流体剪切力）存在不可逆膜损伤风险，而某些纳米载体的合成制备过程复杂，且可能引发细胞毒性反应。因此，开发兼具无创性、易于制备且生物相容性良好的新型递送系统至关重要。
液-液相分离形成的凝聚层，以其制备简易、全水性环境带来的良好生物相容性，以及能够选择性地分配并精确保护生物大分子固有生物活性的特点，成为有前景的药物递送平台。先前研究表明，凝聚层可通过脂筏介导的途径被内化，有助于绕过传统的内体捕获与逃逸问题，实现高效的胞质递送。细胞内吞后，可利用凝聚层固有的可编程性，通过设计能响应胞内普遍酶或氧化还原剂等信号的构建模块，触发靶向降解，实现包载药物的精确时空释放。
在此背景下，本研究旨在构建一种基于凝聚层的大分子递送微载体。研究人员利用细胞中专用于降解外源DNA的酶，设计了一种以DNA为支架分子的凝聚层递送系统。通过筛选一系列阳离子寡肽（K10, R10, RA1, RA2）与带负电的DNA形成凝聚层，并对形成的材料进行全面表征，以评估其作为细胞内大分子载体的潜力，并深入探究其与细胞相互作用的机制。该研究发表在《Advanced Science》期刊。
二、 关键技术方法
为开展研究，研究人员主要运用了以下几类关键技术方法：
- 1.
材料构建与表征：通过将不同阳离子寡肽（K10, R10, RA1, RA2）与鲑鱼精DNA在缓冲液中等比例混合，诱导形成复合凝聚层液滴。通过光学显微镜观察、测定不同组分浓度与混合比例下的状态图、测量浊度和Zeta电位，系统地表征了凝聚层的形成条件、稳定性及电荷特性。
- 2.
凝聚层动态性质与分子相互作用分析：利用荧光漂白恢复（FRAP）技术结合荧光标记寡肽，分析了R10/DNA、RA1/DNA和RA2/DNA三种凝聚体系的内部流动性（扩散系数）。同时，通过全原子分子动力学（AA-MD）模拟，在原子水平上分析了寡肽与DNA之间的氢键数量、接触点数及结合能，从分子机制上解释了不同凝聚层流体性质的差异。
- 3.
细胞摄取效率与机制探究：以负载荧光标记牛血清白蛋白（FITC-BSA）的凝聚层为模型，通过流式细胞术（FACS）和共聚焦荧光显微镜，定量和定性地评估了不同凝聚层系统在多种细胞系（如HeLa, HEK-293T, A549, OC-1, HepG2, NIH-3T3）中的递送效率。为了阐明内化机制，使用了特异性抑制剂：网格蛋白介导的内吞作用抑制剂氯丙嗪（CPM）和脂筏破坏剂甲基-β-环糊精（MβCD）进行预处理，并通过FACS和荧光成像比较抑制效果。同时，利用溶酶体追踪染料（LysoTracker）评估凝聚层与溶酶体的共定位情况。
- 4.
生物大分子递送与功能验证：将凝聚层负载不同的功能性蛋白（如增强型绿色荧光蛋白EGFP、R-藻红蛋白R-PE、核糖体失活蛋白皂草素Saporin、大分子酶β-半乳糖苷酶β-gal）递送至细胞。通过共聚焦成像观察荧光蛋白的细胞内分布与释放动态，通过细胞活力（CCK-8）实验评估皂草素的毒性效应，通过X-Gal染色检测β-半乳糖苷酶的酶活性，以验证递送系统的有效性和对生物大分子活性的保护能力。此外，还通过体外DNA酶（DNase I）降解实验和时间推移活细胞成像，探究了凝聚层在细胞内基于DNA支架降解的释放机制。
三、 研究结果
2.1 寡肽/DNA基凝聚层液滴的形成与表征
研究筛选了四种寡肽（K10, R10, RA1, RA2）与DNA形成复合凝聚层的能力。状态图显示，R10、RA1和RA2能在更宽的浓度范围内（0.1–5 mg/mL）与DNA形成凝聚层液滴，而K10的有效相分离浓度窗口较窄。浊度测量表明，四种寡肽在特定质量比下达到最大浊度。Zeta电位测量显示，所有凝聚层悬浮液在所有测试质量比下均带负电，且随着正电组分相对浓度的增加，Zeta电位负值减小。
2.2 凝聚层液滴动态性质的表征
通过FRAP实验和AA-MD模拟研究了三种肽/DNA凝聚系统的动态特性。FRAP显示所有系统均具有荧光恢复能力，表明其具有液体样性质和持续的分子交换能力。其中，R10/DNA凝聚层的恢复动力学最慢，扩散系数最低（0.009077 µm2/s），表明其内部流动性较低，R10与DNA间的分子相互作用最强。MD模拟定量分析（氢键数量、接触点数、结合能）结果与之一致，证实R10与DNA之间形成了最稳定、最强的相互作用网络。
2.3 凝聚层递送效率评估与内化机制研究
基于负载FITC-BSA的凝聚层进行细胞摄取实验。流式细胞术定量显示，R10/DNA系统在HeLa细胞中的递送效率最高（92.3%），显著高于RA2/DNA（68.5%）和RA1/DNA（45.2%）系统，表明R10/DNA是最有潜力的递送候选。在多种难转染细胞系中也表现出广泛的转染能力。机制研究表明，R10/DNA凝聚层与溶酶体仅部分共定位。使用抑制剂CPM和MβCD预处理细胞后发现，MβCD（脂筏破坏剂）引起的摄取抑制远强于CPM（网格蛋白内吞抑制剂），且酸性内体样条件不会立即破坏凝聚层结构。这些结果表明，R10/DNA凝聚层的摄取涉及脂筏和胆固醇敏感途径，与经典的网格蛋白介导的内吞作用不完全一致。
2.4 生物大分子的递送与释放
研究人员利用细胞固有的DNA感应与处理系统（如cGAS/STING通路和核酸外切酶TREX1）来触发凝聚层的胞内降解与药物释放。体外实验证实，DNA酶I可有效降解凝聚层的DNA支架。活细胞时间推移成像显示，凝聚层在孵育早期（4小时）被细胞摄取，随后（16-28小时）荧光液滴显著减少，伴随荧光信号在细胞内均匀分布，表明凝聚层在胞内逐渐降解并释放内容物。功能蛋白递送实验表明，R10/DNA凝聚层成功将EGFP、R-PE、具有细胞毒性的皂草素（Saporin）以及大分子酶β-半乳糖苷酶（β-gal，~464 kDa）递送至多种细胞系内部，并保持了这些生物大分子的活性。细胞相容性评估（CCK-8和Calcein-AM/PI双染）显示，R10/DNA凝聚层在测试浓度下具有良好的生物相容性。
四、 讨论与结论
在讨论部分，研究人员总结指出，阳离子肽（RA1, RA2, R10）与DNA可通过液-液相分离形成在较宽质量比范围内稳定的凝聚层液滴。这些凝聚层能通过亲和分配高效包封生物大分子，其致密微环境可保护大分子的生物活性。其中，R10/DNA凝聚层在多种细胞系（包括对传统转染方法有抗性的细胞）中表现出高内化效率。机制上，其细胞摄取似乎涉及脂筏/胆固醇敏感机制，不能完全用传统的网格蛋白依赖性内吞作用来解释。与溶酶体的部分共定位表明，传统的内吞运输和内体成熟过程在一定程度上仍然参与。因此，当前数据支持R10/DNA凝聚层通过一种非经典、但并非完全独特的途径进入细胞的可能性。内化后，凝聚层在细胞内环境中逐渐解离，实现包载货物的可控释放。这种混合摄取机制与细胞内触发的解体相结合，为生物大分子的时空可控递送提供了一种策略。
研究也指出了当前系统的几点局限：首先，在此系统中共同递送核酸分子存在技术瓶颈，因为DNA是凝聚层的组分之一，引入外源核酸可能导致相分离临界浓度改变并损害液滴稳定性。其次，跨膜转运的分子机制尚未完全阐明，特别是脂筏介导的摄取、常规内吞作用及后续细胞内运输的定量贡献。此外，凝聚层内化后的命运，包括其胞内加工和降解途径，仍有待阐明。第三，基于肽/DNA凝聚层的递送需考虑细胞外培养基对凝聚层完整性的影响。血清蛋白、盐分等可能改变凝聚层内的分子间相互作用，导致其在被细胞摄取前部分或完全解体。未来研究应致力于增强凝聚层在含血清条件下的稳定性，例如通过调整肽序列、电荷平衡或引入额外的稳定相互作用，以扩展该平台在更生理相关环境中的应用。
研究结论翻译：本研究展示，DNA与阳离子肽（RA1, RA2和R10）通过液-液相分离形成在较宽质量比范围内稳定的凝聚层液滴。这些凝聚层能通过亲和分配高效地封装生物大分子（包括肽和蛋白质），同时其致密的微环境可保护生物大分子的活性。其中，R10/DNA凝聚层在多种细胞系（包括对常规转染方法有抗性的细胞系）中表现出高内化效率。从机制上讲，R10/DNA凝聚层的细胞摄取似乎涉及一种脂筏/胆固醇敏感机制，可能无法完全用传统的网格蛋白依赖性内吞作用来解释。内化后，凝聚层在细胞内环境中逐渐解离，从而实现所封装货物的可控释放。综上所述，这种混合摄取机制与细胞内触发的解组装相结合，为生物大分子的时空可控递送提供了一种策略。尽管取得了这些进展，仍需解决几个局限性。首先，在该系统中共同递送核酸分子存在技术瓶颈。其次，跨膜转运的分子机制尚未完全阐明。第三，基于肽/DNA凝聚层的递送需考虑细胞外培养基对凝聚层完整性的重要影响。总之，所提出的R10/DNA凝聚层代表了一种有前景的仿生递送平台，它结合了优异的生物相容性与创新的大分子运输能力。其跨膜摄取机制和可控释放特性为细胞运输过程提供了有价值的见解，并有可能指导下一代智能递送系统的设计。
