光门控阴离子通道视紫红质 (Anion Channelrhodopsins, ACRs) 被广泛用作光遗传学沉默子，但其门控开启和关闭的分子事件仍不清楚。本研究揭示，Guillardia theta阴离子通道视紫红质1 (Guillardia thetaanion channelrhodopsin 1, GtACR1) 的门控关闭与协同的质子转移反应紧密耦合。时间分辨光谱和电化学分析表明，控制门关闭的M中间体的形成不仅涉及视网膜希夫碱 (retinal Schiff base, RSB) 的去质子化，还包括Asp234 (天冬氨酸234) 向胞外侧的质子释放。研究人员进一步证明，Tyr207 (酪氨酸207) 和Cys237 (半胱氨酸237) 参与调节视网膜希夫碱去质子化的氢键网络，其中Cys237在M中间体形成过程中发生去质子化。此外，对暗状态的分析为GtACR1中功能重要残基的质子化状态提供了新的实验证据，而对L中间体的表征揭示了与通道激活相关的氢键重排。总之，这些发现支持了一个机制模型，其中涉及Asp234、Tyr207和Cys237的质子转移反应协调了视网膜希夫碱的去质子化，从而驱动了GtACR1的门控关闭。
研究背景
膜转运蛋白通过在细胞膜上选择性运输离子和小分子，在生命体中发挥重要作用。光门控阴离子通道视紫红质 (Anion Channelrhodopsins, ACRs) 属于微生物视紫红质家族，在光激活后可被动转运Cl-、Br-、NO3-等阴离子。自隐藻Guillardia theta的GtACR1发现以来，其门控机制，特别是与光循环中间体（K、L、M、N/O）动力学关联的门开启与关闭过程，一直是研究重点。此前研究提出，门在从K中间体向L中间体的转变中以快、慢动力学开启，而在L到M中间体的转变（快动力学）以及M到N/O中间体的转变（慢动力学）中关闭。然而，门关闭背后的精确分子事件，特别是与M中间体形成相关的质子转移反应尚不明确。已有研究就视网膜希夫碱 (RSBH+) 的质子受体是Glu68 (谷氨酸68) 还是Asp234 (天冬氨酸234) 存在争议。因此，阐明GtACR1中M中间体形成的质子转移细节，对于理解其快速门关闭的分子基础至关重要。
研究目的与技术方法概述
为阐明GtACR1中与M中间体形成相关、驱动快速门关闭的质子转移反应，研究人员综合运用了多种光谱学、电化学和分子生物学技术。研究在Pichia pastoris酵母中表达了GtACR1野生型 (WT) 及一系列点突变体，并将其纯化后重组到卵黄卵磷脂 (EggPC) 脂膜中进行功能研究。关键技术方法包括：1) 时间分辨闪光光解光谱，用于监测光循环中间体（如K、M中间体）的动力学形成与衰减；2) 时间分辨铟锡氧化物电极测量，用于在纳秒至毫秒时间尺度上直接检测蛋白与外周溶液间的瞬态质子释放/摄取反应；3) 低温傅里叶变换红外光谱，在特定温度下（如250 K、200 K）分别捕获M和L中间体，获取残基（如羧基、巯基）的质子化/去质子化状态及氢键变化信息；4) pH电极法，用于测定Cl-转运活性。此外，还利用了定点突变技术，对沿推测阴离子转运路径的特定酸性、碱性及含可解离基团的残基进行突变，以研究其功能。
研究结果
M中间体形成与瞬态质子释放的同步性
通过比较GtACR1-WT在pH 9.0下的瞬态吸收变化（监测K、M中间体）与ITO电极测量的电位变化，研究人员发现M中间体的形成和衰减在时间上与向胞外释放质子和从胞外摄取质子完全同步。针对已知的门关闭动力学突变体（慢关C102A和快关R83Q/N239Q）的测量进一步证实了这一关联：C102A的M中间体形成和质子释放均减慢，而R83Q/N239Q则均加速。这表明快速门关闭与GtACR1的瞬态质子释放紧密耦合。
Asp234是质子释放位点
研究人员检验了沿推测阴离子转运路径的几个可解离残基（Glu60, Glu68, Arg94, Glu223, Asp234）在质子释放中的作用。结果显示，E60Q、E68Q、R94Q和E223Q突变体仍表现出与WT类似的M期间质子释放信号，而D234N突变体的质子释放/摄取信号完全消失，表明Asp234是质子释放所必需的残基。pH依赖性研究估测了Asp234在M中间体（质子释放时）和后续N/O中间体（质子摄取时）的pKa值，并推算出其在暗状态下的pKa≥ 9.6，意味着它在接近天然海洋环境的弱碱性条件下是质子化的。低温FTIR光谱直接观察到了Asp234在暗状态（质子化，C=O伸缩带）和在M中间体（去质子化，羧酸盐对称伸缩带）的谱学证据，进一步确认了Asp234是M中间体形成时向胞外释放质子的位点。
Tyr207和Cys237，而非Glu68或Asp234，参与来自RSBH+的质子转移
由于E68Q/D234N双突变体仍能形成M中间体，排除了Glu68或Asp234作为RSBH+直接质子受体的可能性。通过分析M中间体积累的pH依赖性，研究人员估测质子受体的pKa约为8.2，接近Cys (半胱氨酸) 的侧链pKa。对位于RSBH+附近的Tyr207和Cys237进行突变研究（Y207F, C237S, Y207F/C237S）发现，C237S突变体显著减少了M中间体的积累，表明Cys237在质子接受中起关键作用，Tyr207也参与其中。低温FTIR光谱（250 K, M中间体）显示，WT在2585 cm-1处存在一个归属于暗状态中质子化Cys237的S-H伸缩负峰，而对应的正峰缺失，表明Cys237在M中间体中处于去质子化状态。这证实Cys237是M中间体形成时发生去质子化的位点，但其释放的质子并未排出蛋白外，而是转移给了一个尚未明确的内部受体“X”。
Cys237在L中间体中保持质子化并形成强氢键网络
在200 K捕获L中间体的FTIR光谱显示，Cys237的S-H伸缩振动从暗状态的2586 cm-1移至L中间体的2560和2533 cm-1，表明其形成更强的氢键，但并未去质子化。这提示Tyr207、Asp234和Cys237在L中间体中形成了氢键网络。Y207F/C237S双突变体完全丧失了质子释放信号，进一步支持了这一网络的存在及其对Asp234质子释放的调控作用。
Cys237介导的氢键对Cl-转运活性的影响
对Y207F、D234N和C237S突变体的Cl-转运活性测量显示，与WT相比，其活性均降低。这表明Tyr207、Asp234和Cys237之间的氢键网络不仅对快速门关闭，也对门开启过程至关重要，暗示这两个过程相互关联。
讨论与结论总结
讨论部分要点
基于上述发现，研究人员更新了GtACR1快速门关闭相关的质子转移模型。在M中间体形成过程中，发生三个协同的质子转移事件：1) Asp234向胞外释放质子；2) Cys237去质子化，质子转移给未知受体X；3) RSBH+去质子化，其质子被一个与Tyr207和Cys237相关的受体（推测可能是附近的水分子，形成H3O+）接受。这些反应在阴离子转运路径上产生了净负电荷，可能形成静电屏障抑制阴离子传导，从而实现快速门关闭。RSBH+的直接质子受体很可能不是某个氨基酸侧链，而是附近的水分子，Tyr207和去质子化的Cys237共同稳定了该水合质子。在暗状态，Asp234是质子化的，其高pKa由与Tyr207和Cys237形成的氢键网络维持。RSBH+附近存在一个Cl-以维持电荷平衡。慢门关闭过程（M中间体衰减）则涉及Asp234和RSB的再质子化。此外，研究提出M中间体（及其相关的质子转移）可能并非GtACR1阴离子转运功能所绝对必需，因为在酸性条件下，尽管M中间体积累不明显，但仍可检测到阴离子转运，提示可能存在不依赖于典型M中间体的替代转运路径。
研究结论（翻译自原文Conclusions）
瞬态质子转移反应是微生物视紫红质多样分子功能的基础。在本研究中，研究人员确定了与GtACR1快速门关闭机制相关的、具有生物学意义的质子转移过程。通过将时间分辨闪光光解和电化学测量与突变分析相结合，研究人员证明质子释放和摄取反应分别与M中间体的形成和衰减紧密同步。重要的是，研究确定Asp234是M中间体形成期间向胞外侧释放质子的残基，而Tyr207和Cys237参与接受来自RSBH+的质子。Asp234和Cys237的去质子化通过FTIR光谱得到进一步证实。与先前的假设相反，Glu68和Asp234都不是RSBH+的直接质子受体；相反，研究人员提出位于RSBH+附近的水分子扮演了这一角色。研究结果还澄清了暗状态下Asp234的质子化状态，解决了该领域长期存在的争议。Asp234在弱碱性条件下（接近G. theta的天然海洋环境）保持质子化。
