摘要
监测长半衰期（Extended Half-Life, EHL）因子（F）VIII和FIX产品是复杂的，因为不同的实验室检测会得出不一致的结果。
目的
旨在通过重新评估先前发表的数据以及特定因子测定和凝血酶生成（Thrombin Generation, TG）的EHL加样实验的实验室结果，就检测准确性提供一个概览。
方法
对先前发表的关于特定EHL-检测组合准确性的数据进行了重新评估，应用了在特定因子活性水平下统一的允许偏倚截断值。对加样的艾芙莫罗可塔可格α（efmoroctocog alfa）和鲁利罗可塔可格α聚乙二醇（rurioctocog alfa pegol），评估了六种常规使用的FVIII检测的准确性；对加样的艾芙曲那诺可格α（eftrenonacog alfa）、阿尔布曲潘诺可格α（albutrepenonacog alfa）和非那可格β聚乙二醇（nonacog bèta pegol），评估了四种FIX检测的准确性。对这些样本进行了TG以评估止血潜力。
结果
对先前发表数据的重新评估显示，许多EHL-检测组合的准确性不足。九个先前未描述的EHL-检测组合的测量结果未满足整个测试因子活性范围内的准确性标准；其他EHL-检测组合的结果在许多情况下与之前的报告相当。与稀释的正常混合血浆（Normal Pool Plasma, NPP）FVIII相比，在较高因子活性水平下，加样的艾芙莫罗可塔可格α和鲁利罗可塔可格α聚乙二醇的TG显示峰值高度（Peak Height, PH）和曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）增加。艾芙曲那诺可格α的TG与稀释的NPP FIX相当，但阿尔布曲潘诺可格α和非那可格β聚乙二醇的TG则增加。
结论
许多常规FVIII或FIX检测的准确性不足，选择正确的检测对于得出可靠结果至关重要。根据TG结果，EHL的止血潜力可能与其标记的效价存在偏差。
论文主体内容总结
1 引言
血友病A或B分别由凝血因子VIII（FVIII）或因子IX（FIX）的功能缺陷引起。因子替代疗法是血友病患者预防和治疗出血的主要选择之一。自长半衰期（EHL）因子替代产品问世以来，治疗方案对患者越来越友好和高效。这些产品的EHL特性减少给药频率，特别是FIX EHL，从而减轻了患者的治疗负担。延长这些产品半衰期的修饰包括聚乙二醇化（PEGylation）、稳定蛋白质（结构域）或肽融合、重组FVIII（具有修饰或删除的B域）或FIX的单链表达，或它们的组合。最新的FVIII替代疗法例子是依凡诺司可塔可格α（efanesoctocog alfa），它经过广泛修饰，使其独立于血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）的稳定性，从而产生超长EHL浓缩制剂。
治疗监测变得日益复杂，因为应用不同试剂测量FVIII和FIX的一期法或发色底物法会得出不一致的结果。检测和因子的特性可能在其中发挥作用；例如，聚乙二醇化重组FIX可与特定APTT（活化部分凝血活酶时间）基FIX检测中的二氧化硅基激活剂相互作用，从而增强FIX活化并导致FIX活性高估，使报告的FIX结果出现大的正偏倚。此外，所用缺陷血浆的类型（免疫去除性或先天性）也可能导致异常的检测结果。然而，在大多数情况下，检测到的差异的根本原因仍然未知。诊断实验室用于常规FVIII和FIX活性检测的设备和试剂各不相同，这带来了在应用特定EHL产品治疗时，如果使用错误测量修饰FVIII/FIX的常规检测，则可能报告不正确结果的风险。当基于正偏倚的因子活性结果对EHL因子给药不足时，可能会增加出血风险。相反，当基于报告为负偏倚的因子活性水平对EHL因子过量给药时，血栓栓塞事件的风险显而易见。尽管国际指南未明确解决因子VIII和IX的目标水平，但常用的目标水平因临床背景而异，包括预防性治疗的最小谷水平大于1 IU/dL，到出血风险高的外科手术干预中峰值因子活性水平100 IU/dL。
因此，为每种处方EHL选择适当的检测对于产生准确的因子活性结果至关重要。在关于特定EHL-检测组合准确性的现有已发表数据中，应用了不同的检测可接受性截断值，并且评估了不同因子活性水平的准确性。对于特定的检测-EHL组合，数据可用性有限，有时报告的结果不一致或完全缺乏数据。
另一个复杂因素与效价标记有关。对于EHL FVIII产品，标记主要基于发色底物法检测，而对于FIX产品，则根据欧洲药品管理局（European Medicines Agency, EMA）和美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）的产品信息使用一期法凝血检测。虽然并不总是明确规定所用检测，但用于标记的检测预计可提供准确结果，而其他检测则可能不行。目前，对于因子活性标记或整体凝血潜力评估，尚不存在普遍接受的金标准。
本研究通过应用统一的准确性要求截断值以及因子活性水平范围，重新评估了先前发表的关于特定因子活性检测-EHL组合准确性的结果。通过对特定检测进行扩展可用数据。通过执行加样实验和应用多种常规使用的因子检测测量特定的EHL产品，测试了因子活性-EHL组合的准确性。为了评估EHL因子活性标记的准确性，进行了凝血酶生成检测以确定因子活性水平的凝血潜力。
2 材料与方法
2.1 重新评估先前发表的数据
研究人员在2025年10月通过PubMed进行了系统文献检索，应用搜索词“laboratory”、“assay”、“monitor”、“diagnostic ”结合“Extended Half Life Factor VIII”、“Extended Half life Factor IX”等。检索到的文章经过筛选，并在报告特定EHL-检测组合准确性结果的情况下被选中。使用统一的截断值重新评估这些结果：偏倚 ≤ 20% 被解释为正确测量，偏倚 > 20% ≤ 50% 被定义为因子活性的高估或低估，偏倚 > 50% 被定义为因子活性的强烈高估或低估。在评估中包含了因子活性的范围，其中因子活性水平 ≤ 20 IU/dL 被确定为低水平，而因子活性水平 ≤ 2 IU/dL 被确定为极低水平。在某些情况下，未报告确切的定量结果，但在图表中有所体现；经过仔细分析后，这些数据已被纳入。
2.2 EHL-检测评估
研究人员将FVIII EHL艾芙莫罗可塔可格α和鲁利罗可塔可格α聚乙二醇，以及FIX EHL阿尔布曲潘诺可格α、艾芙曲那诺可格α和非那可格β聚乙二醇按照制造商的方案稀释，并分别加入先天性FVIII缺陷血浆（HRF）或免疫去除性FIX缺陷血浆（5-Diagnostics）中，达到因子活性水平0、1、5、10、30、50、100和150 IU/dL。样本用液氮速冻，并在-80°C保存直至使用。使用一期法APTT基凝血检测HemosIL SynthAsil（于ACL TOP 550 CTS上）、aPTT FVIII检测（于t511上）、STA C.K. Prest（于STA R Max 3上）以及发色底物法检测Biophen FVIII:C（于STA R Max 3上）、Biophen FVIII:C Variant（于ACL TOP 550 CTS上）和FVIII chromogenic（Siemens）（于STA R Max 3上）测量FVIII活性。使用一期法APTT基凝血检测HemosIL SynthAsil（于ACL TOP 550 CTS上）、aPTT FIX检测（于t511上）、STA C.K. Prest（于STA R Max 3上）以及发色底物法检测Rossix FIX chromogenic（于ACL TOP 550 CTS上）测量FIX活性。从本地进行的检测验证中检索了所应用检测的精密度规格。针对不同因子活性水平计算了结果的回收率百分比（目标因子活性水平设置为100%）。检测性能的标准与前一节中重新评估先前报告数据时应用的标准一致。
2.3 应用TG评估止血潜力
为了评估止血潜力，研究人员在Ceveron S100分析仪上使用TGA RB试剂（一种含有低组织因子和磷脂浓度的出血倾向试剂）对FVIII和FIX EHL加样样本进行了TG评估。此外，还分析了从NPP中提取的FVIII和FIX与FVIII或FIX缺陷血浆混合以达到目标因子活性水平0、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、89.8（FIX）或100、117.8（FVIII）IU/dL的一系列样本。NPP包含60名选定的健康志愿者的血浆，男女比例为1:1，排除了使用口服避孕药和抗凝药物的人，并使用HemosIL SynthAsil于ACL TOP 550 CTS上确定了因子活性水平。血液采集是根据《赫尔辛基宣言》进行的，所有参与者（患者和健康对照）都提供了对其生物材料进一步使用的一般同意。该材料收集自CMO协议号2013-064下。所有TG参数（滞后时间、达峰时间、峰值高度、曲线下面积和速度指数）均获得了重复至五次的结果。PH和AUC根据NPP（运行内相对于NPP的百分比）进行了标准化。在应用格鲁布斯检验后去除了离群值。
3 结果
3.1 重新评估先前发表的数据
重新评估先前报告数据的结果显示在表中。对于某些EHL因子替代疗法，当使用20%的最大偏倚接受截断值时，许多检测被报告为产生正确结果。当所有已发表的结果对于所有报告的因子活性水平都是正确的时，EHL-检测组合用绿色表示；当一份出版物报告了正确结果，但其他出版物对任何报告的因子活性水平报告了（强烈）低估/高估时，EHL-检测组合用橙色表示；当所有已发表结果对任何报告的因子活性水平显示（强烈）高估/低估时，EHL-检测组合用红色表示。
3.2 EHL-检测评估
研究人员获得了目标因子活性水平0、1、5、10、30、50、100和150 IU/dL的EHL加样样本的不同检测结果。回收率百分比以图形形式显示。对于FVIII EHL，这些结果包括Biophen FVIII:C variant（一种使用牛源性因子X的两步发色底物法检测，用于测量鲁利罗可塔可格α聚乙二醇和艾芙莫罗可塔可格α）的新准确性数据。使用Biophen FVIII:C variant试剂导致鲁利罗可塔可格α聚乙二醇的强烈高估，在整个测试范围内的平均回收率为152%。对于艾芙莫罗可塔可格α，用此试剂测量导致正常和（极）低因子活性水平的（强烈）高估。此外，获得了应用CK prest（在（极）低因子活性水平下（强烈）高估）和Biophen FVIII试剂（强烈高估）检测艾芙莫罗可塔可格α的新颖特异性EHL-检测结果。这些新测试的试剂-FVIII EHL组合未满足在测试范围内FVIII活性回收中目标因子活性水平最大偏倚20%的要求。所测试的其他试剂的结果主要与之前报告的数据一致。通常，在许多EHL-检测组合中，在（极）低因子活性水平下观察到更高的正偏倚，导致因子活性水平的强烈高估。其中包括HemosIL SynthASil和Siemens FVIII chromogenic，因为这些试剂高估了艾芙莫罗可塔可格α。
对于FIX EHL，研究人员获得了Roche FIX（基于一期法APTT检测，用于艾芙曲那诺可格α、非那可格β聚乙二醇和阿尔布曲潘诺可格α）、CK Prest（基于一期法APTT检测，用于艾芙曲那诺可格α）和Rossix FIX chromogenic检测（用于阿尔布曲潘诺可格α）的新数据。对于艾芙曲那诺可格α，Roche FIX通常会高估因子活性水平，而CK prest通常会低估FIX活性（两种检测的最低测试因子活性水平1 IU/dL除外）。对于非那可格β聚乙二醇，Roche IX导致因子活性水平的低估，在最高测试因子活性水平100和150 IU/dL时强烈低估。对于阿尔布曲潘诺可格α，Rossix FIX chromogenic检测导致正确的因子活性水平回收，除了最低测试水平1 IU/dL和最高测试因子活性水平100和150 IU/dL，两者均显示（强烈）高估。这些新测试的试剂-FIX EHL组合未满足在测试范围内目标FIX活性回收中最大偏倚20%的要求。在FIX EHL上测试的其他试剂在很大程度上与之前报告的数据高度一致，但也发现了一些差异。例如，之前有报告称使用Rossix ROX FIX测量艾芙曲那诺可格α在低因子活性水平下存在高估和低估，但在本研究中通常发现结果正确，仅在最低测试因子活性水平1 IU/dL时低估。对于非那可格β聚乙二醇，先前报告称应用CK Prest试剂在所有水平上都强烈低估或高估。尽管研究人员确实检测到了FIX回收的低估，但这并未超过50%的偏倚。对于阿尔布曲潘诺可格α，先前报告称应用HemosIL SynthASil试剂结果正确，但在当前研究中检测到在（极）低因子活性水平下的（强烈）高估。
3.3 应用TG评估止血潜力
研究人员进行了凝血酶生成检测，以将制造商的EHL效价标记与FVIII和FIX活性水平进行比较。结果显示，除艾芙莫罗可塔可格α在5 IU/dL加样外，所有EHL均观察到剂量反应曲线。对于FVIII EHL，艾芙莫罗可塔可格α在因子活性目标水平 ≤ 50 IU/dL时显示出比鲁利罗可塔可格α聚乙二醇略高的TG。鲁利罗可塔可格α的结果与NPP FVIII非常相似，直到50 IU/dL。在最高因子活性水平100和150 IU/dL时，艾芙莫罗可塔可格α和鲁利罗可塔可格α聚乙二醇显示出可比拟的TG结果增加，超过了在约50 IU/dL FVIII活性时达到平台的NPP FVIII的止血活性。
对于FIX EHL，艾芙曲那诺可格α的TG潜力与NPP FIX活性水平相当，然而，阿尔布曲潘诺可格α和非那可格β聚乙二醇在所有测试的因子活性水平上，对于PH和AUC，均显示出比NPP FIX和艾芙曲那诺可格α更高的TG潜力。
4 讨论
目前对监测EHL浓缩制剂指导的需求很高。在这项研究中，研究人员重新评估了先前发表的关于因子活性检测-EHL组合性能的数据，应用了统一的准确性要求截断值以及因子活性水平范围。这形成了当前关于检测准确性文献的完整概览，识别出许多显示准确性不足的EHL-检测组合。此外，通过执行加样实验测试了不同检测-EHL组合的准确性。为9个EHL-检测组合生成了新的性能数据，这些组合也未满足整个因子活性范围内的准确性标准。对于之前有特定准确性评估报告的检测-EHL组合，获得了可比拟的结果，尽管在极低水平下，因子活性高估通常更为明显。研究人员通过应用TG评估了EHL在不同因子活性水平下的凝血潜力。FVIII EHL艾芙莫罗可塔可格α和鲁利罗可塔可格α聚乙二醇显示出可比拟的TG结果增加，超过了在约50 IU/dL FVIII活性时达到平台的NPP FVIII的止血活性。虽然观察到艾芙曲那诺可格α和NPP FIX的可比TG，但在所有因子活性水平上，阿尔布曲潘诺可格α和非那可格β聚乙二醇显示出更高的TG。
研究人员通过应用统一的截断值（最大偏倚20%为可接受）评估了可用数据。此外，研究人员使用 ≤ 2 IU/dL 来定义极低因子活性水平，以及2-20 IU/dL 来定义低活性水平。尽管谷水平通常在低因子活性范围内提供临床相关信息，但在围手术期或出血治疗中，较高范围内的测量准确性具有临床意义。关于偏倚，研究人员接受20%的最大偏差作为可接受的，尽管在已发表的研究中也应用了25%或30%的（同样任意的）替代方案。替代的偏倚截断值包括应用总允许误差。对于FVIII，这将导致最大误差为19.7%，而对于FIX，则允许15.2%。对于FIX，这似乎与当前最先进的方法不可行，并且为了统一，研究人员对两种因子都采用了20%的偏差。此外，在许多研究中，也评估了实验室内和实验室间的变异性。研究人员将分析限制在平均偏倚，以评估所应用检测的准确性，并未分析精密度。然而，归因于实验室内和实验室间不精密度的额外变异很可能进一步影响特定因子活性结果的质量。
通过应用这些统一的截断值，研究人员提供了一个标准化的概览，展示了当前关于在整个临床相关因子活性范围内监测EHL治疗的检测性能的可用数据。基于替代可接受性截断值得出的结论可能与此前报告的不同。例如，监测依凡诺司可塔可格α的情况，最初的出版物表明（大多数）评估的检测是可接受的。然而，应用20%的最大偏倚使得在此次评估中，只有一种一期法凝血检测在整个临床相关因子活性范围内被认为是可接受的。
在评估关于检测准确性的当前文献时，无法将所有重要的测量情况纳入数据解释中。这些包括进行测量的平台或应用的试剂批次。在评估的出版物中特别提到这些方面的情况下，在表中解决了这些问题。然而，在许多情况下，这些情况未在检测性能评估中报告，而这些因素可能发挥重要作用，并可能解释所报告性能数据之间的差异。
在评估EHL止血潜力时，研究人员观察到FVIII EHL的TG结果增加超过了NPP FVIII。FIX EHL之间也发现了差异。这表明，对于某些EHL产品，根据制造商基于特定检测的标记，报告的因子活性水平可能无法准确反映体内止血潜力。例如，基于一期法检测标记的FIX EHL可能在发色底物法检测中被低估。然而，当用TG评估时，这些EHL可能表现出更高的凝血潜力，正如本研究对阿尔布曲潘诺可格α和非那可格β聚乙二醇的观察。相反，基于发色底物法检测标记的FVIII EHL可能在一期法检测中被高估，但TG结果可能相似或甚至更高。因此，依赖不准确的常规检测进行剂量调整可能导致治疗不足或过度，分别增加出血或血栓形成的风险。TG提供了对整体凝血潜力的见解，并可能更准确地反映体内止血状态，尽管它本身不是标准化的，并且在常规临床环境中不易获得。
本研究有几个局限性。首先，文献检索可能遗漏了某些出版物，特别是非英语文献或会议摘要。其次，重新评估依赖于原始出版物的报告准确性和完整性，其中可能缺少方法论细节。第三，加样实验是在控制条件下进行的，可能无法完全反映患者样本的复杂性，例如存在抑制剂或其他影响凝血的因子。第四，TG检测本身存在变异性，并且结果可能取决于所用试剂和分析仪。最后，所评估的EHL产品列表并非详尽无遗，新的EHL产品不断进入市场，需要持续的监测评估。
总之，本研究表明，准确监测EHL因子替代疗法至关重要，但具有挑战性，因为许多常规FVIII和FIX检测的准确性不足。选择正确的检测对于每种特定的EHL产品是必要的，以防止剂量错误。重新评估先前发表的数据提供了EHL-检测组合准确性的标准化概览，强调了数据中的差距和 不 一 致 之 处
打赏
