索尼娅·斯皮内利（Sonia Spinelli）| 索菲亚·高迪亚诺（Sofia Gaudiano）| 安德烈亚·加尔巴里诺（Andrea Garbarino）| 弗朗切斯卡·卢加尼（Francesca Lugani）| 埃多阿多·拉波尔塔（Edoardo La Porta）| 安德烈亚·佩特雷托（Andrea Petretto）| 马蒂娜·巴托卢奇（Martina Bartolucci）| 奇亚拉·拉瓦雷洛（Chiara Lavarello）| 尼科尔·格林诺韦罗（Nicole Grinovero）| 伊拉里亚·穆萨恩特（Ilaria Musante）| 保罗·斯库迪埃里（Paolo Scudieri）| 安东内拉·特里韦利（Antonella Trivelli）| 乔治奥·皮亚乔（Giorgio Piaggio）| 阿尔贝托·马格纳斯科（Alberto Magnasco）| 玛丽亚·卢多维卡·德格利诺琴蒂（Maria Ludovica Degl’Innocenti）| 西蒙娜·格拉纳塔（Simona Granata）| 朱安路易吉·扎扎（Gianluigi Zaza）| 恩里科·韦里纳（Enrico Verrina）| 乔瓦尼·坎迪亚诺（Giovanni Candiano）| 莫里齐奥·布鲁斯基（Maurizio Bruschi）
意大利热那亚IRCCS吉安尼娜·加斯利尼研究所（IRCCS Istituto Giannina Gaslini）肾脏病学、透析与移植科及分子肾脏病学实验室
摘要
引言
免疫球蛋白糖基化的改变已被认为与抗体介导的足细胞病变有关；然而，IgM唾液酸化的功能相关性仍不明确。先前的证据表明，循环中的阳离子或低唾液酸化的IgM可能增加特发性肾病综合征（iNS）中足细胞的脆弱性。
方法
分析了86份来自患有足细胞病变的儿童和成人患者的血清IgM样本，包括20例膜性肾病（MN）、20例狼疮性肾炎（LN）患者和30例健康对照组。使用生物素化的凝集素通过凝集素酶联免疫吸附测定法（ELISA）评估末端N-糖链残基，包括黑接骨木凝集素（SNA）和蓖麻凝集素I（RCA-I）。同时测量了唾液酸转移酶ST6GAL1以及神经氨酸酶-1（NEU1）和神经氨酸酶-3（NEU3）的血清水平。培养的人类足细胞暴露于天然IgM、去唾液酸化IgM或再唾液酸化IgM，并通过共聚焦显微镜、定量蛋白质组学和代谢分析进行检测。
结果
iNS患者的IgM表现出较低的SNA结合能力，这与蛋白尿和循环中的NEU1/NEU3水平呈负相关。在配对样本中，SNA反应性在疾病复发期间降低，在缓解期间增加。所有组中均检测不到ST6GAL1，而PLA2R1阳性的MN患者表现出较低的RCA-I结合能力。暴露于低唾液酸化或去唾液酸化IgM的足细胞表现出肌动蛋白细胞骨架的紊乱、nephrin信号减弱、脂质过氧化增加以及ATP水平下降。再唾液酸化IgM在形态和代谢特征上与对照组无统计学差异。蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析显示MAPK、mTOR、AMPK和细胞骨架相关通路的调节。
结论
IgM的唾液酸化状态可以追踪疾病活动，并调节足细胞的结构、代谢和信号反应，支持免疫糖链重塑是iNS中足细胞脆弱性的疾病相关修饰因素。
引言
特发性肾病综合征（iNS）是一组以足细胞损伤、足突消失和蛋白尿为特征的肾小球疾病。尽管经过数十年的研究，其免疫病理机制仍不完全清楚。临床观察和实验研究表明，循环中的免疫因子可以直接改变足细胞的结构和功能，这挑战了传统上将iNS分为免疫介导型和非免疫介导型的区分。虽然IgG自身抗体在膜性肾病等抗体介导的肾小球疾病中的作用已被证实，但IgM对足细胞损伤的贡献却较少受到关注。我们小组的早期研究表明，iNS患者的阳离子IgM在体内给药时会与肾小球基底膜结合并引起蛋白尿，支持这些抗体的潜在致病作用。最近的研究发现，IgM的唾液酸化减少是儿童患者中依赖激素或频繁复发的iNS的独特生化标志，其中低唾液酸化的IgM持续存在于T细胞表面，并与对激素反应性的改变相关。这些观察结果表明，IgM的糖链重塑可能调节免疫行为和组织相互作用。
唾液酸是一种末端单糖，可赋予糖蛋白负电荷，从而调节分子相互作用、补体激活和免疫识别。在肾脏中，多项证据表明，唾液酸化受损足以破坏肾小球的通透选择性和足细胞结构。在具有唾液酸生物合成酶GNE突变的小鼠中，补充N-乙酰甘露胺可以改善肾小球损伤。类似地，足细胞足突蛋白或分泌的血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）的唾液酸化减少已被证明会改变肾小球的电荷选择性并促进蛋白尿。这些数据支持唾液酸化作为免疫调节与结构屏障功能之间足细胞完整性的调节因素。
除了唾液酸化外，其他糖链改变（如IgG的阿糖基化）最近也被发现与抗体介导的肾脏损伤有关。在携带抗nephrin抗体的iNS患者中，循环和尿液中的IgG显示出显著的阿糖基化减少，这与疾病活动和蛋白尿相关。因此，抗体糖链重塑可能代表了影响肾小球疾病中体液效应性质的更广泛机制。
在本研究中，我们调查了IgM的唾液酸化减少是否与足细胞损伤和代谢改变相关。我们结合了基于凝集素的IgM糖谱分析和对培养的人类足细胞进行的功能检测，这些足细胞暴露于天然IgM、去唾液酸化IgM或再唾液酸化IgM。我们还测量了患者血清中的唾液酸酶（NEU1/NEU3）水平，以探讨其与IgM去唾液酸化的关系。通过这种综合方法，我们测试了IgM的唾液酸化状态是否可以作为足细胞信号传导、氧化应激和细胞能量代谢的可调节决定因素。
方法
使用基于凝集素的ELISA分析了患有轻度病变肾病（MCD）、局灶性节段性肾小球硬化症（FSGS）、膜性肾病（MN）和狼疮性肾炎（LN）患者的血清IgM，以评估IgM的N-糖链组成。通过ELISA测量了参与唾液酸化和去唾液酸化的酶（ST6GAL1、NEU1和NEU3）的血清水平。从选定的患者和对照组中纯化的IgM（包括酶法去唾液酸化和再唾液酸化的IgM）用于刺激培养的人类足细胞，进行共聚焦成像、定量蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析以及氧化应激和ATP合成的代谢分析。详细的实验程序，包括患者选择标准、IgM纯化和酶修饰、基于凝集素和酶的ELISA条件、细胞培养和共聚焦显微镜技术、蛋白质组学和激酶阵列分析以及统计分析，见补充材料。
结果
研究人群的临床和生化特征
血清样本来自86名经活检证实患有足细胞病变的儿童和成人患者，包括46名轻度病变肾病（MCD）患者和40名局灶性节段性肾小球硬化症（FSGS）患者。如表1所示，患者的蛋白尿范围从正常值到明显的肾病范围不等。根据临床病史和治疗反应，患者被分为依赖激素（SDNS）、多药依赖（MDNS）和多药抵抗（MRNS）表型。与研究设计一致，所有MCD和FSGS患者均检测不到循环中的抗nephrin（NPHS1）抗体，且在诊断基因面板中未发现致病性或可能致病的变异。
表1. 研究队列的临床和人口统计特征
基于凝集素的血清IgM N-糖链残基分析
通过用N-糖苷酶F（PNGase F）预处理纯化的血清IgM来验证凝集素特异性，结果导致凝集素结合完全丧失（补充图S1A–C）。使用六种具有特定糖链特异性的生物素化凝集素（黑接骨木凝集素SNA；末端α2,6连接的唾液酸）、橙色鹅膏菌凝集素（AAL；岩藻糖）、欧洲金雀花凝集素I（UEA-I；α1,2连接的岩藻糖）、四棱豆凝集素（LTL；岩藻糖/甘露糖）、蓖麻凝集素I（RCA-I；β1,4连接的半乳糖）和Concanavalin A（ConA；甘露糖/混合型残基）通过凝集素ELISA评估血清IgM的糖基化谱型。如图1A所示，iNS患者的SNA结合能力显著降低（499 [480–527] RU/mL），而CTR为614 [554–654] RU/mL，LN为583 [555–612] RU/mL，MN为581 [568–591] RU/mL（P < 0.0001）。在iNS队列中，FSGS患者的SNA反应性低于MCD患者（479 [466–496] vs 517 [499–540] RU/mL；P < 0.0001）。按治疗反应分层时，SDNS（478 [459–504]）、MDNS（504 [480–530]）和MRNS（530 [517–551）组之间的SNA反应性也存在差异（P < 0.05）。
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图1. 基于凝集素的IgM N-糖链谱型和血清神经氨酸酶水平。(A) 盒形图显示了对照组（30 CTR；白色）、轻度病变肾病（46 MCD；洋红色）、局灶性节段性肾小球硬化症（40 FSGS；红色）或膜性肾病PLA2R1阴性（10 MN-；蓝色）和阳性（10 MN+；青色）以及狼疮性肾炎（20 LN；灰色）的IgM N-糖链残基的凝集素ELISA结果。FSGS和MCD组的SNA结合显著降低（P < 0.0001），而PLA2R1阳性的MN组的RCA-I结合最低（P < 0.0001）。(B) 在两个临床时间点（活动性疾病期间（蛋白尿 > 3.5 g/天）和完全缓解期间（蛋白尿 < 0.2 g/天）对十名足细胞病变患者的SNA反应性进行配对分析。活动期SNA结合显著低于缓解期（P < 0.01）。(C) 热图显示了SNA反应性、NEU1和NEU3血清水平以及尿蛋白与肌酐比率（UPCR）之间的皮尔逊相关系数。颜色等级表示相关性的强度和方向：红色表示强正相关，蓝色表示强负相关，白色表示无相关；颜色强度与相关系数的绝对值成正比（*** = P<0.0001；** = P<0.001；* = P<0.05）。(D) NEU1和NEU3血清浓度的箱形图显示足细胞病变组与其他组相比有显著增加（P < 0.05）。所有样本中均检测不到ST6GAL1（数据未显示）。
所有凝集素信号均归一化到总IgM水平，排除了由于IgM浓度造成的差异。在活动性疾病和完全缓解期间获得的十名iNS患者的配对样本中，活动性蛋白尿期间的SNA结合显著降低（470 [455–492] vs 534 [507–551] RU/mL；P < 0.01；图1B）。皮尔逊相关分析显示，IgM的SNA反应性与循环中的NEU1（R = −0.67，P < 0.001）、NEU3（R = −0.59，P < 0.001）和尿蛋白与肌酐比率（UPCR；R = −0.69，P < 0.0001）呈负相关（图1C）。AAL、LTL、UEA-I或ConA在各组间无显著差异。
相比之下，RCA-I结合显示出疾病特异性模式，PLA2R1阳性的MN患者显示出显著降低的反应性（1581 [1555–1594] RU/mL），而PLA2R1阴性的MN、LN、足细胞病变和CTR则没有这种差异（P < 0.0001；图1A）。
血清中唾液酸化和去唾液酸化相关酶的表达水平
为了研究IgM的唾液酸化与循环中参与唾液酸化或去唾液酸化的酶之间的关系，直接进行了ELISA，以量化所有研究组血清样本中的ST6 β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1（ST6GAL1）、神经氨酸酶1（NEU1）和神经氨酸酶3（NEU3）的水平。所有样本中的ST6GAL1水平均低于检测限（数据未显示）。
相比之下，iNS患者的NEU1和NEU3血清水平显著高于CTR（NEU1 = 0.65 [0.53–0.81]；NEU3 = 0.69 [0.59–0.85]），而CTR为NEU1 = 0.39 [0.34–0.43]；NEU3 = 0.548 [0.45–0.628]，LN为NEU1 = 0.36 [0.33–0.43]；NEU3 = 0.549 [0.44–0.66]，MN为NEU1 = 0.366 [0.32–0.41]；NEU3 = 0.569 [0.46–0.69]（两种酶均P < 0.05）。在iNS队列中，FSGS患者的NEU1和NEU3血清水平高于MCD患者（NEU1 = 0.71 [0.59–0.81] vs 0.62 [0.50–0.80]；NEU3 = 0.72 [0.63–0.88] vs 0.67 [0.58–0.81]；P < 0.05），反映了FSGS中IgM唾液酸化更明显的减少（图1D）。
在LN或MN患者与CTR受试者之间未检测到NEU1或NEU3水平的显著差异。在整个队列中，NEU1和NEU3血清浓度呈正相关（R = 0.75，P < 0.05）。
IgM的唾液酸化状态对足细胞细胞骨架组织和nephrin表达谱的影响
如补充图S1D所示，通过SNA凝集素ELISA验证了酶法去唾液酸化和再唾液酸化的效率。为了排除IgM制备物中残留的唾液酸转移酶或唾液酸酶活性，用CTR去唾液酸化和再唾液酸化的IgM进行了ST6GAL1、NEU1和NEU3的ELISA检测，未检测到信号，表明没有酶的交叉污染（补充图S1D）。
为了评估来自iNS患者的IgM是否会在足细胞中引起结构改变，条件永生化的人类足细胞与从十个独立iNS血清池或匹配的CTR池中纯化的IgM一起孵育，处理条件相同。每个iNS池包含来自八个IgM唾液酸化水平较低的患者的血清，以最小化池间差异并确保广泛的队列代表性。在选定的实验中，IgM在暴露于足细胞之前进行了酶法再唾液酸化。
初步的剂量-反应和时间过程实验显示了浓度和时间依赖的细胞骨架调节（补充图S2）。基于这些分析，选择每孔0.12 μg IgM（1:50血清稀释）和过夜孵育作为标准条件。
如图2A和2C所示，未经处理的足细胞和暴露于CTR IgM的足细胞显示出相似的形态、肌动蛋白组织和粘附性。相比之下，iNS来源的IgM引起了显著的细胞骨架重排，表现为phalloidin荧光减弱、细胞收缩和细胞数量减少（P < 0.0001）。CTR去唾液酸化的IgM再现了这种表型，而CTR再唾液酸化的IgM未引起可检测的改变，其肌动蛋白组织和细胞计数与对照组相当。在暴露于重新唾液酸化的iNS来源的IgM后，观察到了类似的细胞骨架结构的保存。下载：下载高分辨率图像（914KB）下载：下载全尺寸图像图2. 对不同唾液酸化状态的足细胞进行共聚焦免疫荧光分析。(A, B) 代表性共聚焦图像显示用phalloidin–AF488（绿色）染色的肌动蛋白细胞骨架和用anti-nephrin–AF568（红色）检测到的nephrin分布；细胞核显示为蓝色（DAPI）。未经处理的足细胞和用对照（CTR）IgM处理的足细胞显示出保持的形态、有序的肌动蛋白应力纤维和强烈的nephrin染色。相比之下，暴露于iNS来源的IgM或酶法去唾液酸化的IgM与肌动蛋白细胞骨架的紊乱、应力纤维的丢失、细胞收缩、粘附力下降以及nephrin信号强度的显著降低有关。用重新唾液酸化的IgM处理的足细胞显示出与对照条件下观察到的相似的肌动蛋白组织和nephrin定位。比例尺：10 μm；(C–D) 与图(A, B)相对应的定量分析，显示每个视野中的总phalloidin–AF488荧光（C）和nephrin–AF568荧光（D），使用EBImage在相同的采集设置下计算像素强度之和。定量数据证实，用iNS来源和去唾液酸化的IgM处理的足细胞中的肌动蛋白和nephrin荧光信号较低，而用重新唾液酸化的IgM处理的足细胞中的荧光水平与对照细胞中的相当。nephrin免疫染色也反映了这些发现。用CTR IgM或重新唾液酸化的IgM处理的足细胞显示出保持的nephrin强度和膜定位，而用iNS来源或CTR去唾液酸化的IgM处理的足细胞则导致nephrin信号显著降低（P < 0.0001；图2B, D）。IgM与足细胞的结合受唾液酸化状态的影响。为了评估IgM的唾液酸化是否影响足细胞相互作用，通过共聚焦显微镜分析了IgM的结合情况。固定的足细胞在4°C下与来自iNS患者的IgM或CTR受试者的IgM孵育，这些IgM可以是未经处理的、去唾液酸化的或重新唾液酸化的。如图3所示，CTR IgM显示出有限的、局部的结合，而iNS来源的IgM显示出明显增加的、扩散的结合。CTR IgM的去唾液酸化再现了iNS IgM观察到的结合模式，而酶法重新唾液酸化显著降低了IgM的结合，导致荧光强度和分布与CTR条件下的无统计学差异。重要的是，iNS来源的IgM的酶法重新唾液酸化同样降低了足细胞的结合，导致荧光水平与天然对照IgM观察到的无统计学差异。下载：下载高分辨率图像（339KB）下载：下载全尺寸图像图3. IgM与足细胞的结合受唾液酸化状态的影响。(A) 代表性共聚焦图像显示人类IgM与足细胞的结合。固定后，足细胞与来自CTR受试者或iNS患者的IgM孵育，这些IgM可以是未经处理的、酶法去唾液酸化的或重新唾液酸化的。来自CTR的IgM显示出有限的、离散的结合，而来自iNS患者的IgM与更强的、更扩散的足细胞信号相关。酶法去唾液酸化的CTR IgM导致的结合模式与未经处理的iNS的IgM观察到的相似。相比之下，重新唾液酸化的IgM显示出降低的结合，导致荧光强度和分布与CTR条件下的无统计学差异。使用抗人类IgM–FITC免疫荧光（绿色）检测IgM的结合；细胞核用DAPI（蓝色）复染。(B) 定量图像分析显示，与图(A, B)对应的样本中，每个视野的总phalloidin–AF488荧光（C）和nephrin–AF568荧光（D）使用EBImage在相同采集设置下计算像素强度之和。定量数据证实，用iNS来源和去唾液酸化的IgM处理的足细胞中的肌动蛋白和nephrin荧光信号较低，而用重新唾液酸化的IgM处理的足细胞中的荧光水平与对照细胞中测量的相当。nephrin免疫染色也反映了这些发现。用CTR IgM或重新唾液酸化的IgM处理的足细胞显示出保持的nephrin强度和膜定位，而用iNS来源或CTR去唾液酸化的IgM处理的足细胞则导致nephrin信号显著降低（P < 0.0001；图2B, D）。暴露于重新唾液酸化的iNS来源的IgM的足细胞中的nephrin染色与对照条件下的相当。IgM与足细胞的结合受唾液酸化状态的影响。为了评估IgM的唾液酸化是否影响足细胞相互作用，通过共聚焦显微镜分析了IgM的结合情况。固定的足细胞在4°C下与来自iNS患者的IgM或CTR受试者的IgM孵育，这些IgM可以是未经处理的、去唾液酸化的或重新唾液酸化的。如图3所示，CTR IgM显示出有限的、局部的结合，而iNS来源的IgM显示出明显增加的、扩散的结合。CTR IgM的去唾液酸化再现了iNS IgM观察到的结合模式，而酶法重新唾液酸化显著降低了IgM的结合，导致荧光强度和分布与CTR条件下的无统计学差异。重要的是，iNS来源的IgM的酶法重新唾液酸化同样降低了足细胞的结合，导致荧光水平与天然对照IgM观察到的无统计学差异。下载：下载高分辨率图像（587KB）下载：下载全尺寸图像图4. 暴露于不同唾液酸化状态的IgM的足细胞的蛋白质组分析。(A) 主成分分析（PCA）显示用CTR、iNS或CTR-Desialylated IgM处理的足细胞有明显的聚类。(B) 文氏图总结了ANOVA和未配对t检验识别的统计学显著蛋白质的重叠。数字和圆圈分别代表每次比较中的不同统计学显著蛋白质。(C–E) 火山图比较(C) iNS vs CTR、(D) CTR-Desialylated vs CTR以及(E) CTR-Desialylated vs iNS。在火山图中，x轴表示log2倍数变化，y轴表示–log10 P值。黑点表示非显著蛋白质；红色和蓝色分别表示显著上调或下调的蛋白质。每个实验条件在四个独立的生物重复中进行分析。未配对样本的ANOVA测试识别出5,250个在不同条件下显著调节的蛋白质（补充表S1，图4B）。随后的未配对t检验显示，iNS IgM处理与CTR IgM相比调节了363个蛋白质，而CTR-Desialylated IgM引起了更广泛的反应，有3,037个蛋白质与CTR IgM处理的细胞不同。直接比较CTR-Desialylated和iNS IgM识别出3,411个差异表达的蛋白质，突出了部分和完全失去IgM唾液酸化之间的显著差异（补充表S1，图4B–E）。基因本体论富集分析为了表征与观察到的蛋白质组变化相关的生物过程，对三个成对比较中的统计学显著蛋白质进行了基因本体论（GO）富集分析。这项分析识别出38个显著富集的GO术语（补充表S2），分为五个主要生物簇：MAPK信号传导和应激反应、细胞-细胞和细胞-基质相互作用、线粒体和代谢过程、氧化应激以及炎症信号传导（图5）。下载：下载高分辨率图像（440KB）下载：下载全尺寸图像图5. 不同表达蛋白质的基因本体论（GO）富集分析。每个圆圈代表一个显著富集的GO生物过程术语。x轴表示富集倍数得分；圆圈大小与相关蛋白质的数量成正比（范围：3–39），颜色强度反映统计显著性（–log10 Adj P值；白色=1.3，红色=38）。富集的功能簇包括MAPK和应激反应信号传导、细胞骨架组织、线粒体和代谢途径、氧化应激以及炎症信号传导。富集的途径包括细胞内信号传导的协调调节（MAPK、Ras、mTOR、AMPK）、细胞骨架组织和细胞粘附、线粒体和氧化还原代谢，以及多种应激反应机制，包括自噬、线粒体自噬、细胞衰老和铁死亡。免疫和炎症相关途径（例如，TNF、IL-17、Toll样受体、NOD样受体、HIF-1、TGF-β和AGE–RAGE信号传导）也有代表。重要的是，所有38个GO术语在三个比较中都被检测到，其富集程度、统计显著性和相关蛋白质的数量有所不同，表明其调节随IgM的唾液酸化状态而变化。磷酸蛋白质组学和激酶活性分析为了验证和扩展蛋白质组学发现（图6A），在暴露于CTR、iNS、CTR-Desialylated或CTR-Resialylated IgM的足细胞中进行了磷酸化途径分析。在不同条件下观察到不同的磷酸化特征，这与在总蛋白质组水平上检测到的差异一致（图6B）。下载：下载高分辨率图像（413KB）下载：下载全尺寸图像图6. 暴露于不同唾液酸化状态的IgM的足细胞的磷酸阵列和激酶活性分析。(A) 通过质谱在用iNS来源的IgM、对照（CTR）、CTR-Desialylated或CTR-Resialylated处理的足细胞中鉴定的整个激酶家族。每个彩色节点代表一个激酶，在四种条件下的表达变化要么是统计学显著的（红色），要么不是（灰色）。节点大小与−log10 P值成正比。(B) 磷酸阵列信号的热图显示了用对照（CTR）、iNS、CTR-Desialylated和CTR-Resialylated IgM处理的足细胞中的相对磷酸化水平。颜色强度代表每个磷酸位点的标准化信号强度。在热图中，行和列分别对应激酶和实验条件。每个实验条件在三个独立的生物重复中进行分析。激酶-底物富集分析（KSEA）揭示了激酶活性的差异调节。在用iNS IgM处理的足细胞中，MAPK相关激酶（ERK1/2、p38、JNK）显示出增加的活性，伴随着AKT–mTOR轴活性的降低。CTR-Desialylated IgM引起了更广泛和更明显的反应，MAPK14、MAPK8、PRKCA和SRC的活性增加，而AKT1、GSK3β和PAK1的活性降低。相比之下，CTR-Resialylated IgM产生的激酶活性谱与对照条件下的相当，与CTR IgM处理的细胞相比没有显著差异。总体而言，在IgM唾液酸化状态不同的条件下观察到磷酸化依赖性信号途径的梯度变化（补充图S4）。低唾液酸化的IgM增加了足细胞中的脂质过氧化并减少了ATP合成。为了确定IgM的唾液酸化依赖性信号改变是否与代谢变化相关，在暴露于不同唾液酸化状态的IgM的足细胞中测量了脂质过氧化和ATP合成。细胞用来自CTR、iNS、MN（anti-PLA2R–阴性）和LN患者的IgM处理，以及用酶法去唾液酸化或重新唾液酸化的CTR或iNS IgM处理。所有IgM制剂在相同的条件下处理并彻底洗涤以最小化酶或污染物的携带。如图7A所示，与所有其他条件相比，用CTR-Desialylated IgM处理的足细胞中的细胞内丙二醛（MDA）水平显著增加（P < 0.0001）。相比之下，暴露于CTR-或iNS-Resialylated IgM的足细胞中的MDA水平与对照组相当，以及用CTR、MN或LN血清的IgM，而iNS IgM诱导了中等的MDA水平。下载：下载高分辨率图像（225KB）下载：下载全尺寸图像图7. IgM唾液酸化状态对氧化应激和ATP产生的影响。(A) 盒形图显示丙二醛（MDA）浓度，表明暴露于iNS来源的IgM和酶法去唾液酸化的对照IgM的足细胞中的脂质过氧化水平较高，而用重新唾液酸化的iNS IgM处理的足细胞以及来自MN和LN患者的IgM的MDA水平与对照条件下的相当（P < 0.0001）。(B) 盒形图显示细胞ATP水平，用iNS来源的IgM和酶法去唾液酸化的对照IgM处理的足细胞中的ATP水平较低。相比之下，暴露于重新唾液酸化的iNS IgM、CTR来源的IgM和来自MN和LN患者的IgM的足细胞中的ATP水平与对照条件下的相当（P < 0.0001）。值以nmol/mg总蛋白表示；每个条件使用十个独立的生物重复进行分析，对应十个不同的IgM池，每个池由具有相似IgM唾液酸化水平的不同患者的血清组合而成。在十个独立的iNS IgM池的生物重复中观察到互补的模式，表明IgM唾液酸化状态相关的代谢改变是分级的，其中去唾液酸化的IgM产生了最强的效应，而重新唾液酸化的IgM类似于对照条件。免疫沉淀（IP）为了研究IgM–足细胞蛋白质相互作用，将未经处理的足细胞的膜富集和细胞质富集部分与来自CTR或iNS患者的IgM孵育，然后进行免疫沉淀和质谱分析。共鉴定出4,371个蛋白质，经过标准化和去除非特异性结合物后，分别对质膜和细胞质部分进行了富集分析。在质膜富集部分，58个蛋白质显著富集。根据针对精心策划的质谱衍生的细胞表面蛋白质图谱的注释，42个蛋白质（72.4%）被分类为膜或细胞表面蛋白质，未检测到核蛋白质（补充图S5A，补充表S3）。同时，在细胞质部分显著富集了75个蛋白质（补充图S5B，补充表S3）。在膜和细胞质部分富集的蛋白质之间没有观察到重叠。功能上，富集的蛋白质聚类为广泛的类别。与膜相关的蛋白质主要参与膜组织和囊泡运输、细胞粘附和细胞骨架组织、细胞外基质/分泌成分、代谢和氧化还原相关过程以及信号或免疫相关功能。细胞质相互作用者富集了细胞骨架组织、代谢酶、蛋白质周转和翻译后调节、信号和免疫相关调节因子，以及与RNA/DNA处理、细胞周期控制和应激反应相关的蛋白质。讨论在这项研究中，我们确定IgM的低唾液酸化是一个与疾病相关且可能可改变的特征，与足细胞脆弱性的增加有关。患者来源的IgM具有降低的SNA反应性，以及更明显的酶法去唾液酸化的IgM，导致肌动蛋白紊乱、应力纤维丢失、粘附力下降、nephrin表达减少、脂质过氧化增加和ATP合成减少。相比之下，IgM的酶法重新唾液酸化导致的结构和代谢特征与对照条件下观察到的无统计学差异。我们的发现扩展并机制上联系了两个先前独立的证据线索。首先，IgM被认为在足细胞病变中具有致病效应：Musante等人1证明，来自iNS患者的抗actin/β-ATP-synthase IgM具有阳离子特性，会在肾小球中沉积，并在体内诱导蛋白尿，这支持了抗体直接介导的足细胞损伤机制。其次，T细胞上IgM的低唾液酸化程度可以识别出严重的类固醇依赖性iNS表型：Colucci等人2发现，唾液酸化程度较低的IgM会在T细胞表面积累，抵抗内化，消除类固醇诱导的抑制作用，并促进足细胞损伤因子的释放，总IgM的唾液酸化程度与T细胞结合的IgM呈负相关。我们的数据通过证明IgM本身的唾液酸化状态可以调节体外足细胞反应，从而有助于统一这些观察结果，支持抗体糖基化是抗体-组织相互作用调节的额外层这一概念。最近的研究也强调了不同的Ig糖基化模式如何影响免疫介导的肾脏疾病中的抗体效应特性和疾病表型18。为了进一步探索这种相互作用的分子基础，使用了富含膜和细胞质的足细胞组分进行了基于免疫沉淀的蛋白质组学分析。这些实验的目的不是为了识别单一的配体受体，而是为了表征在天然条件下与患者来源的IgM优先结合的足细胞蛋白谱。值得注意的是，超过70%的膜相关组分中的蛋白质被实验性地注释为与膜相关，而细胞质相互作用蛋白则代表了一个独特且不重叠的集合。功能注释突出了与膜组织、囊泡运输、细胞粘附、细胞骨架动态、细胞外基质相互作用以及氧化还原和信号传导相关通路有关的通路。这些发现共同支持了一个模型，即IgM的低唾液酸化通过糖链和电荷依赖机制增强了与膜相关足细胞蛋白复合物的相互作用。
唾液酸代谢在维持肾小球选择性过滤中的重要性已经得到充分证实。UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶（GNE）的基因缺陷是唾液酸生物合成的关键酶，会导致小鼠出现严重的蛋白尿，并且可以通过补充N-乙酰甘露糖胺来缓解，这表明唾液酸化不足足以破坏过滤屏障3。选择性去除足细胞糖蛋白（包括足突蛋白）的唾液酸同样会导致足突过程消失和类似FSGS的病变19,20。此外，血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）的唾液酸化改变会调节其等电点和肾小球电荷选择性，这与类固醇敏感模型中的蛋白尿相关4。重要的是，肾小球过滤屏障是一个由内皮糖萼、肾小球基底膜和足细胞组成的整体结构，所有这些成分都富含唾液酸化糖缀合物；目前的体外模型专门研究了足细胞的反应，并没有定义IgM在体内的去唾液酸化发生位置。
在信号传导水平上，磷酸蛋白质组学和KSEA分析显示MAPK通路（ERK、p38、JNK）被激活，同时AKT/mTOR信号传导被下调。重要的是，AKT/mTOR轴的调节不应被解释为足细胞损伤严重程度的线性替代指标。越来越多的证据表明，mTOR信号传导与足细胞损伤之间的关系高度依赖于具体环境且是非线性的。足细胞中mTORC1的持续过度激活代表了一种适应不良的应激反应，导致细胞骨架紊乱、自噬受损、足细胞丢失和进行性蛋白尿21。相反，过度抑制mTOR信号传导也是有害的，因为基础水平的mTOR活性对于足细胞的代谢稳态、适应性应激反应和存活是必需的22。在这个框架下，对低唾液酸化IgM的反应所观察到的信号变化最好解释为应激反应通路的适应性调整，而不是损伤强度的直接测量。
观察到的IgM低唾液酸化与血清神经氨酸酶含量增加之间的关联提供了一个潜在的机制联系。NEU3是一种血浆膜唾液酸酶，它可以去除神经节苷脂中的唾液酸，并调节β1整合素的运输和EGFR的激活，从而影响粘附和MAPK/PI3K信号传导23。同样，NEU1（主要的溶酶体神经氨酸酶）调节生长因子受体的去唾液酸化和肾脏稳态24。虽然患者血清中NEU1和NEU3水平的升高本身并不表明其具有循环中的酶活性，但它与越来越多的证据一致，即在炎症状态下神经氨酸酶会动态上调。需要进一步的研究来确定神经氨酸酶活性的细胞来源及其在肾小球环境中的体内贡献。实际上，NEU1和NEU3越来越多地被认为是炎症驱动的去唾液酸化的活性介质。在特发性肺纤维化中，NEU3的表达和活性在纤维化病变和支气管肺泡灌洗液中显著增加，这与α2,6-连接的唾液酸化减少和SNA反应性增强相平行；药物或基因抑制NEU3可以减轻炎症和纤维化25,26。在神经炎症期间，NEU1在激活的小胶质细胞中也上调，促进神经元表面糖蛋白的去唾液酸化和氧化及代谢应激的放大27。来自气道上皮细胞和实验性结肠炎的额外证据进一步支持神经氨酸酶驱动的去唾液酸化在组织损伤和免疫激活中的作用28,29。总体而言，这些研究定义了一个炎症驱动的神经氨酸酶轴，这与我们在患者中观察到的模式一致，并提供了系统炎症激活、血清神经氨酸酶水平改变以及IgM低唾液酸化依赖性足细胞损伤之间的机制桥梁。
与这一模型一致的是，血清NEU1和NEU3的含量与IgM的唾液酸化程度呈负相关，与蛋白尿直接相关，尽管没有直接测量酶活性。配对样本的纵向分析进一步显示，在活动性疾病期间IgM的唾液酸化程度降低，在缓解期间恢复正常，这支持了IgM的唾液酸化程度随疾病活动动态变化的观点。ST6GAL1在血清中未被检测到，这与其主要位于细胞内的高尔基体位置一致，也不矛盾于系统性的去唾液酸化倾向。相反，IgM的低唾液酸化可能反映了免疫或组织隔室中暴露于去唾液酸化环境的情况，随后修改后的IgM可以在循环中被检测到。
从功能上讲，酶促去唾液酸化的IgM在体外再现并加剧了患者来源IgM观察到的足细胞改变，而重新唾液酸化的IgM则恢复了与对照组相当的细胞骨架和代谢特征。这些发现与经典观察结果一致，即阳离子或去唾液酸化的蛋白质与肾小球过滤屏障的相互作用增强，并增加了蛋白尿潜力30。在不同的肾小球疾病中也出现了不同的糖链特征。抗nephrin阴性足细胞病变的特点是选择性的IgM低唾液酸化，而PLA2R1阳性的膜性肾病则表现出IgG半乳糖化程度降低，这与先前的报告一致31。结合抗nephrin阳性肾病综合征中的IgG afucosylation，这些观察结果描绘了三种趋同的免疫糖链重塑模式，这些模式影响了抗体效应特性和足细胞损伤机制。
这项研究存在局限性。体外系统无法完全再现体内环境的复杂性，包括补体激活和系统介质。合并IgM样本减少了变异性，但可能掩盖了患者特定的糖链差异，而基于凝集素的测定方法无法分辨链接或分支特异性的糖链结构。未来需要使用LC–MS/MS糖蛋白质组学和肾脏组织分析来明确IgM去唾液酸化的精确糖链结构和解剖位置。
总之，在血清神经氨酸酶含量增加的背景下，IgM的低唾液酸化与MAPK相关的细胞骨架重塑和足细胞线粒体功能障碍有关。IgM的低唾液酸化并不作为主要的致病驱动因素，而是作为一种疾病相关的修饰因素，在免疫激活的环境中加剧了足细胞的脆弱性。这些发现提供了关于抗体糖基化如何影响足细胞反应的机制见解，并表明针对NEU–唾液酸轴可能代表一种潜在的治疗策略。
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所有作者声明没有利益冲突。
**数据共享声明**
质谱蛋白质组学数据已存放在PRIDE存储库（ProteomeXchange Consortium）中，访问号为PXD070406 [用户名：reviewer_pxd070406@ebi.ac.uk；密码：SDvDOLfnX8zr]。支持本研究结果的所有其他数据包含在手稿中，可根据合理请求从相应作者处获得。
