膝骨关节炎（Knee osteoarthritis, KOA）是一种以滑膜炎和关节软骨破坏为特征的全身性疾病，其严重程度与滑膜巨噬细胞M1/M2失衡高度相关。近年研究表明，中药汤剂中存在的纳米颗粒可能作为具有治疗潜力的生物活性成分发挥作用。本研究创新性地从具有长期临床抗炎应用史的中药复方骨痹止痛方（Gubi Zhitong formula, GBZTF）中分离得到纳米颗粒（Nanoparticles from Gubi Zhitong formula, NPG），旨在探讨NPG是否通过在KOA模型中重编程滑膜巨噬细胞极化来缓解KOA。研究结果显示，富含黄酮类和苯丙素类的NPG可通过疏水相互作用和氢键形成稳定的纳米结构，显著改善关节功能，减轻软骨侵蚀和滑膜增生等病理特征。全面的体外和体内研究证实，NPG能有效抑制M1型促炎细胞因子，促进M2型抗炎因子，并可将M1巨噬细胞重编程为M2表型。机制研究表明，NPG通过直接和间接双重机制激活芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor, AHR）：既可直接结合受体，又可通过调节犬尿氨酸途径提供内源性配体，从而促进巨噬细胞表型重编程并最终改善软骨微环境。综上所述，本研究结果表明，基于中药的纳米颗粒关节腔注射作为一种潜在有效的KOA治疗策略具有重要前景。
研究背景
膝骨关节炎（KOA）是全球范围内最常见的退行性关节疾病之一，预计到2050年全球患病人数将较2020年增长约74.9%。现有主流治疗药物如非甾体抗炎药（NSAIDs）虽能缓解症状，但存在代谢快、靶向性差及长期使用可能加剧软骨退变的局限。滑膜组织中M1/M2巨噬细胞的极化失衡被认为是驱动KOA炎症与软骨破坏的核心机制。近年来，中药汤剂中被发现含有天然自组装的纳米颗粒，这些纳米颗粒能够增强活性成分的生物利用度和治疗效果，为KOA的治疗提供了新的视角。骨痹止痛方（GBZTF）是收录于《中华人民共和国药典》的临床验方，本研究旨在从该方中分离纳米颗粒（NPG），并系统评估其通过调控巨噬细胞极化治疗KOA的潜力。该研究成果发表于《Materials Today Bio》。
关键技术方法
研究人员采用高速离心结合透析法从GBZTF水提液中分离纯化NPG，并利用激光共聚焦显微镜、透射电镜及动态光散射对其理化性质进行表征。通过非靶向代谢组学分析其化学成分。体外实验使用RAW264.7细胞系和原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）评估NPG对巨噬细胞极化的影响；利用Transwell共培养体系探究巨噬细胞与软骨细胞ATDC5的相互作用。体内实验采用改良Hulth法制备SD大鼠KOA模型，设置不同剂量NPG治疗组及塞来昔布阳性对照组，通过步态分析、Micro-CT扫描及组织学染色评估关节结构与功能修复情况。机制研究结合转录组测序（RNA-seq）、免疫荧光、Western Blot及siRNA敲低技术，验证色氨酸代谢-芳香烃受体（AHR）信号通路的关键作用。
研究结果
3.1 合成与表征NPG
研究人员成功制备了平均粒径约为147 nm、表面电位为-15 mV且具有良好胶体稳定性的球形NPG。其在模拟滑液（SSF）中30天内保持分散状态。药物释放曲线显示，柚皮苷呈双相释放，淫羊藿素I呈稳态释放，芒柄花素呈延迟爆发释放，体现了不同成分的差异化释放行为。
3.2 NPG的化学成分分析
非靶向代谢组学显示，与原始汤剂（ODG）相比，NPG中有机酸及其衍生物、杂环化合物及脂质类分子的相对比例显著升高，其中毛蕊花糖苷、槲皮素等抗炎活性成分富集倍数达1.4至18.5倍。
3.3 NPG改善KOA大鼠运动功能
步态与负重测试表明，NPG治疗显著改善了KOA大鼠的步态参数（如步长、摆动时间）和患肢负重能力，且中、高剂量组效果优于阳性药塞来昔布组。
3.4 NPG改善大鼠KOA软骨下骨重塑与软骨退变
Micro-CT显示NPG显著提高了骨体积分数（BV/TV）和骨密度（BMD），减少了骨小梁分离度（Tb.Sp）。组织学染色（H&E和SO/FG）证实NPG能有效减少软骨破坏，增加蛋白聚糖含量，降低OARSI和Mankin评分。
3.5 NPG调节KOA大鼠炎症反应与软骨代谢
血清ELISA及软骨组织qRT-PCR结果显示，NPG显著下调M1型促炎因子（TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS）的表达，同时上调M2型抗炎因子（IL-10, TGF-β）及软骨合成代谢因子（Aggrecan, Col2a1, Sox9）的表达，抑制分解代谢因子（Mmp13, Adamts5）。
3.6 NPG通过高效内吞调节巨噬细胞功能
细胞摄取实验证明，相较于游离药物，NPG能被巨噬细胞高效内吞，且同等剂量下表现出更强的巨噬细胞表型调控能力。
3.7 NPG调节巨噬细胞极化
流式细胞术与免疫荧光结果显示，NPG呈剂量依赖性地抑制LPS/IFN-γ诱导的M1型标志物CD86的表达，并促进IL-4/IL-13诱导的M2型标志物CD206的表达。
3.8 NPG将促炎性M1巨噬细胞重编程为抗炎M2表型
在RAW264.7细胞中，NPG直接将已极化的M1巨噬细胞重编程为M2表型，伴随M1基因（Il-6, Cd86, Il-1β, Tnf-α, Inos）的下调和M2基因（Il-4, Il-13, Cd206, Arg-1, Tgf-β, Il-10）的上调。
3.9 NPG调节BMDM极化
在原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中，NPG同样表现出一致的M1向M2重编程效应，验证了该效应的生理相关性。
3.10 NPG调节巨噬细胞极化以减轻软骨损伤
Transwell共培养实验表明，NPG通过抑制M1巨噬细胞的炎症分泌，逆转了其对软骨细胞增殖的抑制和促凋亡作用，恢复了细胞外基质（ECM）合成；同时增强了M2巨噬细胞的软骨修复功能。
3.11 RNA-seq分析揭示NPG调控巨噬细胞极化的重编程机制
转录组测序分析显示，NPG处理显著富集了色氨酸代谢通路。基因集富集分析（GSEA）进一步确认了该通路在介导巨噬细胞表型转换中的核心地位。
3.12 功能验证确定AHR是NPG诱导巨噬细胞极化的关键执行者
研究人员发现NPG通过上调犬尿氨酸途径关键基因（Kyat1, Kyat3, Afmid, Il4i1）并下调降解基因（Haao），增加内源性配体犬尿氨酸（KYN）和3-羟基邻氨基苯甲酸（3-HAA）的生成，从而激活AHR并诱导其核转位。siRNA敲低AHR后，NPG的巨噬细胞重编程效应被完全阻断。此外，研究发现NPG对AHR的激活包含直接（配体结合）和间接（代谢调控）双重机制，其中间接机制占主导（贡献率>90%）。
3.13 NPG的体内安全性评价
血清生化指标及肝肾组织切片显示，NPG治疗组未引起明显的肝肾功能损伤或组织病理学异常，而塞来昔布组则观察到轻微的病理改变。
讨论与结论
研究人员在讨论中指出，当前KOA治疗手段存在局限性，而源自中药的天然纳米颗粒为解决这一问题提供了新思路。本研究证实NPG并非单一成分的载体，而是通过疏水作用和氢键网络形成的自组装体系，这种结构本身赋予了其优于游离药物的生物学特性。研究创新性地揭示了“中药纳米颗粒—色氨酸代谢—AHR—巨噬细胞重编程”这一全新的治疗轴，阐明了NPG通过微调代谢通路而非单纯补充配体来激活AHR的独特机制。尽管研究存在样本量及细胞模型成熟度的局限，但其为KOA的局部治疗提供了高效且安全的候选药物。
结论部分总结，本研究成功分离并表征了源自骨痹止痛方的自组装纳米颗粒NPG。通过体内外实验证明，NPG通过直接和间接双重机制激活芳香烃受体（AHR），驱动巨噬细胞表型重编程，最终发挥抗炎和软骨保护作用。该研究不仅阐明了NPG治疗KOA的分子基础，也为利用天然产物靶向AHR-巨噬细胞功能轴提供了新策略。
