摘要
分泌途径是真核细胞的一个核心且进化上保守的特征，负责蛋白质和脂质的运输、膜生物发生、信号传导以及细胞稳态的维持。其复杂性、动态行为和纳米级的组织结构使其成为长期以来显微镜研究的重点对象。在这篇综述中，我们追溯了我们对分泌途径的理解与成像技术发展的平行进程，特别关注植物细胞，因为植物细胞独特的结构和功能特征对机制模型提出了挑战同时也丰富了这些模型。我们强调了电子显微镜（EM）在定义分泌器官的超微结构组织以及建立细胞内运输方向模型方面的基础性作用，随后荧光显微镜技术的出现使得能够直接观察活细胞中的物质流动和器官动态。超分辨率荧光技术的出现弥合了光学显微镜与电子显微镜之间长期存在的分辨率差距，揭示了以前在活细胞中无法观察到的纳米级区室化、膜接触位点以及运输中间体。最近，功能测定、光遗传学以及人工智能驱动的分割、去噪和自适应成像技术的整合，使得对分泌结构的定量和高通量分析成为可能。这些进展共同将分泌途径从一个静态的形态学概念转变为一个动态的、越来越具有机制定义的系统。最后，我们讨论了新兴的综合策略，特别是相关性和人工智能增强的方法，这些方法有望在未来对内膜组织的研究中统一超微结构的精确性与分子特异性和时间分辨率。
1 引言
分泌途径由一系列保守的内膜结构组成，包括内质网（ER）、高尔基体、运输囊泡和质膜。新合成的蛋白质在内质网开始进入分泌途径，在那里它们被折叠并包装成运输囊泡，然后被输送到高尔基体。在高尔基体中经过处理和分选后，货物通过囊泡被运输到最终目的地，包括质膜、液泡/溶酶体或细胞外空间（图1）。这些结构被认为是在最后的真核共同祖先（LECA）时期进化而来的，这突显了它们对细胞功能的基本重要性。在哺乳动物和酵母系统中，分泌途径的核心功能被描述为蛋白质折叠、质量控制、翻译后修饰、脂质合成以及代谢物储存。然而，这一概述仅代表了该途径全部功能的一小部分（表1），因为超过30%的哺乳动物蛋白质会通过分泌系统。尽管在进化上保守且在细胞生理中起核心作用，但哺乳动物和植物的分泌系统之间存在显著差异。
2 使用光学显微镜初步识别亚细胞成分
分泌途径的成分最初是通过光学显微镜识别出来的，1655年胡克首次描述了“细胞”，17世纪初首次描述了亚细胞结构，主要是在哺乳动物细胞中。19世纪30年代，对细胞结构进行了首次常规描述和命名。这项工作从识别细胞核开始，接着是线粒体，然后是内质网（最初被描述为ergastoplasm）。这些器官通常在没有染色的情况下被观察到，研究人员通常依赖于由于不同亚细胞结构存在而导致的细胞内容密度的变化。它们的身份确认通常基于后来开发的显微镜染色技术。光学显微镜的最大分辨率受到光的衍射极限的限制；现代衍射极限共聚焦系统可以达到大约200纳米的横向分辨率，一些超分辨率技术可以达到更低的分辨率。例如，结构照明显微镜（SIM）可以达到100-150纳米的分辨率，刺激发射耗尽（STED）可以达到40-80纳米，单分子成像技术如STORM（随机光学重建显微镜）和PALM（光激活定位显微镜）可以达到20-40纳米（图2）。然而，达到这些更低的分辨率伴随着显著的实验缺点，包括STED需要高激光功率，这可能导致许多样本的光毒性。同时，PALM/STORM是一种速度受限的技术，对荧光团的选择也有严格限制。这些光学显微镜技术的巨大改进发生在光学显微镜最初识别分泌途径器官与超分辨率光学显微镜的最新进展之间，标志着电子显微镜的黄金时代。
3 电子显微镜的黄金时代：建立持久的基础
现代电子显微镜的发展始于阴极射线管的发明，恩斯特·鲁斯卡、博多·冯·博里斯和马克斯·克诺尔在1931年使用它制造了第一台具有13倍放大倍率的两级透射电子显微镜（TEM）。经过多年的发展，恩斯特·鲁斯卡改进了他们的原始TEM，加入了三个磁透镜，其中一个作为聚光镜，另外两个作为物镜和投影镜。这台显微镜可以达到12,000倍的放大倍数，位于真空外的相机可以拍摄放大的区域。这台显微镜最终作为第一台商用TEM在英国制造并出售。在TEM发明之后，曼弗雷德·冯·阿登内于1938年开发了扫描电子显微镜（SEM），可以高放大倍数和分辨率获取样本表面的图像。这两种技术至今仍在生物学研究中广泛使用。电子显微镜的出现标志着分泌途径发现和生命科学的一个重要里程碑。然而，早期TEM的应用受到缺乏可靠的超薄切片技术的限制，使得观察只能限于整个样本或相对较厚的样本，导致细胞内分辨率较差。随后超薄切片技术的发展，使得制备厚度通常小于100纳米的切片成为可能，这对于分辨内质网和高尔基体等内部膜结合的器官至关重要。尽管在进化上保守且在细胞生理中起核心作用，但哺乳动物、植物和真菌的分泌系统之间存在显著差异，反映了它们不同的细胞结构和功能需求。在植物中，大型液泡的存在、高度动态的器官行为以及内膜器官的非核周分布使其分泌组织与哺乳动物系统不同。这种空间分离导致细胞质中分布着离散的、可移动的高尔基体堆栈，使得植物细胞特别适合通过显微镜分析分泌动态。分泌途径为基于显微镜的研究提供了理想系统，特别是因为许多内膜成分表现出重叠的内容和结构成分分布。例如，外核膜与内质网完全连续，如果不使用成像技术，分离这两个结构特别具有挑战性。这个问题可能会因蛋白质的空间分布重叠而加剧，例如在哺乳动物细胞中，肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶（PAM）可以定位在质膜和跨高尔基体网络上。在哺乳动物和植物细胞的高尔基体区室中，生化身份的空间重叠尤为明显，糖基化酶经常显示出至少部分重叠的分布。分泌途径的研究也倾向于使用多模态成像方法，特别是因为许多分泌途径成分位于或接近光的衍射极限，大约200-250纳米。例如，COPII囊泡的直径在酵母和哺乳动物细胞中报告为大约60-80纳米，而内质网管状的宽度在植物细胞中报告低至40纳米。这使得关键分泌途径器官的大小处于传统光学显微镜的极限，但完全在电子显微镜的范围内（图2）。尽管电子显微镜（EM）似乎是研究分泌途径的理想成像方式，但由于成分在其功能过程中会快速重塑，因此无法使用EM技术观察到这种快速重塑。这种快速重塑无法通过EM技术观察到，因为需要使用重金属进行样本固定和染色，这使得分泌途径特别适合多模态成像方法。
4 使用光学显微镜初步识别亚细胞成分
分泌途径的成分最初是通过光学显微镜识别的，1655年胡克首次描述了“细胞”，17世纪初首次描述了亚细胞结构，主要是在哺乳动物细胞中。19世纪30年代，对细胞结构进行了首次常规描述和命名。这项工作从识别细胞核开始，接着是线粒体，然后是内质网（最初被描述为ergastoplasm）。这些器官通常在没有染色的情况下被观察到，研究人员通常依赖于由于不同亚细胞结构存在而导致的细胞内容密度的变化。它们的身份确认通常基于后来开发的显微镜染色技术。光学显微镜的最大分辨率受到光的衍射极限的限制；现代衍射极限共聚焦系统可以达到大约200纳米的横向分辨率，一些超分辨率技术可以达到更低的分辨率。然而，达到这些更低分辨率伴随着显著的实验缺点，包括STED需要高激光功率，这可能导致许多样本的光毒性。同时，PALM/STORM是一种速度受限的技术，对荧光团的选择也有严格限制。这些光学显微镜技术的巨大改进发生在光学显微镜最初识别分泌途径器官与超分辨率光学显微镜的最新进展之间，标志着电子显微镜的黄金时代。现在已知高尔基体由多个堆叠的、自我封闭的膜组成，这些膜被几个较小的圆形囊泡所包围。早期的高尔基体图像是使用缓冲的锇四氧化物作为细胞染色剂拍摄的。这是一个关键的技术发展，因为为了使电子显微镜在生命科学中得到广泛应用，需要同时开发出电子密度高的染色剂来改善生物样本的可视化效果。要通过电子显微镜捕捉图像，目标电子必须与样本发生相互作用。由于生物样本通常是基于碳的，它们的原子核较为稀疏，因此与电子的相互作用较弱，导致图像对比度较低。为了解决这个问题，人们使用了铅、锇和铀等重金属盐作为染色剂。Palade引入的缓冲锇四氧化物显著提高了膜的保存效果，并为现代电子显微镜固定技术铺平了道路。20世纪50年代，人们开发了甲醛和戊二醛等醛类固定剂，用于电子显微镜观察，这些固定剂能够更好地保存细胞超微结构。同样，也开发了使用环氧树脂的包埋技术，这种树脂比早期的塑料树脂更加稳定，使得使用超薄切片机制作超薄切片成为可能。最终，在20世纪60至70年代，人们开发了一种使用醋酸铀和柠檬酸铅的样本处理方法，即先进行醛类固定，然后再进行锇、铀和铅的固定，这种方法至今仍被广泛用于细胞和组织的成像。
分泌途径的概念以及分泌蛋白必须经过的细胞器顺序，是通过将电子显微镜与改进的细胞分级技术和放射自显影技术结合而首次提出的。早期的实验能够追踪哺乳动物外分泌胰腺中的分泌蛋白，从它们在粗面内质网上的合成部位开始，经过不同的高尔基体结构，到达被称为“浓缩液泡”的结构，最终进入酶原颗粒。电子显微镜对此研究至关重要，因为它揭示了细胞器在分泌过程中的空间连续性和区室间的通信。这项里程碑式的研究不仅确立了分泌途径作为细胞生物学的核心框架，还展示了电子显微镜将细胞超微结构与动态生物过程联系起来的能力。重要的是，这些脉冲追踪放射自显影实验不仅绘制了蛋白质运输的路径，还建立了一个定向的、分区的分泌模型，即蛋白质依次从内质网移动到顺式高尔基体、中间高尔基体和反式高尔基体囊泡中，然后被包装成分泌颗粒。然而，这种解释也强化了以囊泡为中心的运输观点，这种观点在该领域主导了数十年。后续的研究质疑了高尔基体囊泡本身是否也会成熟并向前移动，而不是在蛋白质在它们之间穿梭时保持静止状态。因此，即使在最初阶段，电子显微镜定义的分泌途径就已经包含了关于囊泡运输与囊泡成熟之间长期争论的种子。这种争论部分是由电子显微镜本身的局限性所决定的，因为电子显微镜提供的是固定材料的高分辨率但静态的快照；这样的图像可能导致形态学的误解，例如，在薄切片中管状结构可能看起来像囊泡，而无法显示膜流动的方向性。显微镜不仅揭示了结构，还影响了几代人对分泌机制的理解。后续的研究在此基础上进一步解析了分泌的分子机制，包括Günter Blobel的体外重建方法以及James Rothman和Randy Schekman在哺乳动物细胞中开发的遗传学和生化策略。
随着用于研究分泌途径的显微镜技术的分辨率提高，人们对不同物种间分泌途径的多样性有了更深入的理解。其中一个最常被提及的差异是哺乳动物细胞和植物细胞之间的区别。例如，植物细胞通常包含多个不同的高尔基体，而哺乳动物细胞则只有一个较大的高尔基体。由于植物和哺乳动物高尔基体之间存在意外差异，植物的高尔基体甚至被赋予了一个特定的名称——“dictyosome”（最初用于描述高尔基体在有丝分裂过程中产生的片段）。1964年，Morre和Mollenhauer首次分离出了完整的植物dictyosome或高尔基体，这使得超微结构和生化特性研究成为可能。他们开发了生化方法和超微结构技术，将植物高尔基体系统确立为一个适合功能分析的可行系统。他们引入了分离高尔基体膜并用戊二醛稳定的方法，使得可以通过负染色和电子显微镜检查囊泡结构及其相关囊泡，并便于对纯化组分中的酶活性和脂质组成进行生化分析。这些方法上的进步为理解dictyosome囊泡内的功能特化提供了重要的结构背景，并为早期关于植物分泌过程中物质处理和囊泡形成的模型提供了依据。
同时，根冠细胞的放射自显影追踪实验表明，用放射性标记的葡萄糖标记的新合成的多糖从高尔基体堆栈移动到相关囊泡，并穿过质膜进入细胞壁。这些结合了超微结构和生化观察的结果支持了这样一个观点：植物细胞中的高尔基体系统在细胞壁多糖成分的合成、修饰和输出中起着核心作用，直接将细胞器组织与分泌功能联系起来。
将生化分析与电子显微镜结合的方法被称为功能性电子显微镜，它使得可以直接将超微结构与分泌途径中的生物合成活动联系起来。在植物细胞中，这种方法特别有助于解析细胞壁成分的合成和输出过程。通过将亚细胞分级技术与基于电子显微镜的细胞器纯度验证相结合，功能性电子显微镜能够将特定的生物合成活动分配到不同的高尔基体膜和运输中间体上。这些研究表明，在高尔基体中合成的多糖被包装成囊泡并运输到质膜上进行细胞壁沉积，从而为分泌过程中的结构化和生化过程提供了框架。
扩展这些观察结果，酶学分析和超微结构分析揭示了多糖和糖蛋白的生物合成在高尔基体堆栈中的空间组织。不同的糖转移酶活性被定位到不同的高尔基体区域，支持了一种模型，即蛋白质在通过囊泡区室时经历顺序修饰。这项工作为高尔基体内的功能分区提供了早期的实验证据，并为后来的囊泡成熟模型奠定了基础。尽管越来越多的生化证据表明高尔基体区室具有特异性，但仅凭电子显微镜无法确定这些区室是稳定的实体还是不断更新的动力学结构。连续切片和酶定位技术支持了有序的组织结构，但静态图像无法区分不同的运输模型。这一局限性表明了一个更广泛的原则：超微结构的精确性并不自动意味着机制上的清晰性。只有通过将电子显微镜技术与活细胞荧光成像和遗传学扰动技术相结合，才能测试高尔基体囊泡本身是否在动态变化。因此，功能性电子显微镜虽然确立了结构分区，但一些关键的动力学问题仍未得到解答。同时，功能性电子显微镜技术也被应用于研究高尔基体膜的动力学和蛋白质运输机制。连续切片和酶标记的电子显微镜分析显示了内质网、高尔基体膜和质膜之间的连续性，支持了一种统一的分泌膜流动模型。这些植物细胞研究证实，高尔基体囊泡是源自内质网膜的动态结构，而不是静态实体，强调了持续膜流动在维持分泌途径功能中的作用。
随着专门用于改善固定过程中膜保存的快速固定技术的发展，人们对分泌途径多样性的理解也得到了加深。基于这些进展，高压冷冻（HPF）技术使得能够捕捉接近天然状态的细胞结构，从而克服了化学固定的局限性。随后在三维电子显微镜（尤其是电子断层扫描）方面的发展进一步扩展了这些能力，能够原位解析细胞器的连接性和膜组织。21世纪的断层扫描重建技术捕捉到了内质网出口位点、反式高尔基体网络组织以及广泛的囊泡管状结构，提供了传统二维电子显微镜无法实现的定量和空间分辨率。这些方法上的创新使电子显微镜成为定义分泌途径结构和生化组织的关键工具。
冷冻电子显微镜（cryo-EM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）通过允许在接近天然、水合的状态下成像冷冻生物材料，避免了化学固定、脱水和染色，解决了早期技术中的问题。冷冻电子断层扫描还能够在纳米分辨率下对完整细胞区域进行三维重建，直接观察到膜接触位点、囊泡膜和大分子组装。在分泌途径中，冷冻电子断层扫描明确了内质网出口位点的COPII膜结构，并澄清了膜组装的中间步骤，进一步完善了囊泡形成和货物包装的机制模型。尽管冷冻电子断层扫描能够捕捉静态快照，但它保留了动态运输过程中的关键信息。尽管如此，冷冻电子显微镜技术仍然具有技术要求，特别是在植物系统中，因为植物细胞壁需要高压冷冻和聚焦离子束切割。尽管如此，其通量仍低于荧光显微镜，且分子身份通常是推断出来的而不是直接观察到的。相关光电子显微镜（CLEM）作为一种强大的方法，将超微结构信息与基于荧光的蛋白质定位相结合，使得可以将分子身份分配到特定的膜区室中。这些综合策略桥接了分泌途径的结构和动态分析，但冷冻电子显微镜无法捕捉实时动态过程的问题仍然需要通过基于荧光的技术来解决。
在应用于分泌途径的显微镜技术的发展过程中，开发出针对固定样本的蛋白质特异性标记策略是一个关键步骤。在基因编码报告基因出现之前，要在细胞超微结构背景下定位单个蛋白质主要依赖于使用标记的一抗或二抗的免疫染色方法。在光学显微镜下，免疫荧光技术使得能够以更高的特异性可视化分泌途径中的成分，如内质网和高尔基体中的蛋白质，从而将主要基于形态学的解释转变为基于分子定义的细胞内组织图谱。当这种技术与保持亚细胞结构的化学固定技术结合使用时，这种方法特别有效，使研究人员能够将蛋白质定位与细胞器身份相关联。尽管这些基于抗体的标记方法具有优势，但它们本质上仅适用于固定样本，无法直接观察囊泡出芽、运输和融合等动态过程。随后引入的基因编码荧光蛋白（尤其是绿色荧光蛋白GFP）标志着一个范式的转变，因为它使得能够在活细胞中进行蛋白质特异性标记。然而，免疫染色和免疫电子显微镜建立的概念和方法论基础对于解释这些动态成像实验至关重要。早期的基于GFP的分泌途径研究往往依赖于从固定细胞免疫染色中获得的先验知识来验证定位模式和推断功能行为。随着共聚焦显微镜技术的发展，从静态到动态细胞成像的转变真正开始了，这使得能够在活细胞中实时观察分泌结构和过程。然而，活细胞成像也有其自身的实验限制：激发荧光蛋白所需的照明可能会引起光漂白和光毒性效应，产生活性氧并干扰细胞生理活动，尤其是在长时间成像或高激光强度下。因此，必须在空间-时间分辨率和保持正常细胞功能之间找到平衡。在这种限制下，将荧光蛋白标签与分泌途径成分结合使用，彻底改变了我们对细胞器和货物流动的实时追踪方式，从而显著提高了对分泌途径动力学的理解。GFP（绿色荧光蛋白）作为一种可被基因编码的荧光蛋白，其发展对于生物学研究中的实时可视化至关重要，因为它能够用于观察细胞内的分泌过程。尽管已经有许多荧光染料（如FM1-43、罗丹明B（图3）和BODIPY衍生物）被成功应用于分泌途径的成像，但这些染料会带来膜动态改变、细胞结构紊乱和细胞毒性的风险。部分原因在于许多荧光染料具有亲脂性，会进入脂质双层中，其定位受被动扩散、膜亲和力和电化学梯度的影响，而非严格的分子特异性。因此，这些探针可能在膜的不同区室之间重新分布，并在双层内横向扩散，这可能会干扰膜的组织结构，使得对“特定”细胞器的标记解释变得复杂。特别是在那些对染料渗透性较差的细胞类型中，例如具有厚细胞壁的植物和真菌细胞，可能需要添加洗涤剂来帮助染料进入细胞。然而，GFP允许在活细胞中对特定蛋白质进行原位标记，对细胞结构的干扰最小（这一点已通过基于电子显微镜的研究得到证实）。GFP最初于1962年从Aequorea victoria中分离出来，但真正成为分子生物学中的核心工具是通过分子克隆和随后的结构工程实现的。增强型GFP（eGFP）变体表现出更高的亮度、光稳定性和与标准激光线的兼容性。荧光蛋白谱系的扩展，包括来自Discosoma的红色变体，使得蛋白质和细胞器的多色成像成为可能。GFP在植物系统中的适应性改进，包括去除一个隐性的内含子，进一步扩展了其应用范围。活细胞成像揭示了内质网和高尔基体的高度运动性。在植物细胞中，GFP-HDEL通过最小的定位信号保留在内质网中，证明了内质网的连续性、细胞骨架的耦合以及高尔基体与内质网膜的动态关联。后续研究建立了肌动蛋白-肌球蛋白依赖的高尔基体运动机制，并引入了如secGFP这样的运输分析方法，从而能够功能性地研究内质网-高尔基体运输过程。
图3：使用脂质染料和目标GFP观察植物细胞内质网的对比。图(a)显示了用罗丹明B染色的10天大阿拉伯芥菜子叶细胞的内质网和线粒体，而图(b)显示了经过农杆菌介导的转化后3天的烟草叶表皮细胞中的内质网。图像是在Zeiss 880 LSM共聚焦显微镜上使用Airyscan探测器收集的，并进行了Airyscan后处理。比例尺为5微米。光漂白后的荧光恢复（FRAP）显示了内质网和高尔基体之间的ATP依赖性蛋白质交换，而光激活型GFP揭示了超出扩散预期的定向蛋白质流动。通过Förster共振能量转移结合荧光寿命成像显微镜（FRET-FLIM）技术，可以解析蛋白质-蛋白质相互作用，从而在活植物细胞中实现纳米级相互作用映射。这种方法阐明了植物细胞内高尔基体中的特定糖基化复合体和囊泡固定机制。尽管有这些进展，共聚焦显微镜仍受衍射极限（约200-250纳米）的限制，许多亚细胞结构无法被清晰显示。活细胞荧光成像从根本上改变了人们对分泌途径组织的理解，揭示了曾经被认为相对静态的细胞器实际上具有高度动态性，并且不断交换成分。在植物细胞中，发现沿着肌动蛋白丝移动的高尔基体堆栈直接挑战了以哺乳动物为中心的解剖学假设。此外，对货物流量和蛋白质周转的动力学测量开始支持囊泡成熟模型，其中驻留酶逆向循环，而囊泡向前移动。然而，荧光显微镜引入了新的解释挑战：标记蛋白的过表达可能会干扰运输动态，而衍射限制的分辨率使得将蛋白质分配到离散的亚区室变得复杂。因此，虽然活细胞成像解决了电子显微镜固有的时间不确定性问题，但它也引入了新的实验不确定性来源。这一差距促使人们采用了超分辨率荧光技术，包括STED、SIM、STORM和PALM。
超分辨率成像揭示了分泌途径中以前未被充分研究的特征，包括高尔基体囊泡的组织结构、内质网-质膜接触位点以及囊泡的纳米级结构。商业创新如Airyscan通过改进探测器阵列进一步普及了亚衍射成像。最近，超分辨率共聚焦活细胞成像显微镜（SCLIM）结合了旋转盘共聚焦光学系统和优化检测技术，在活植物细胞中实现了高空间和时间分辨率。SCLIM研究揭示了跨高尔基网络的功能分区，并定义了哺乳动物细胞中的特定货物分泌囊泡簇。纳米级成像还重新引发了关于内质网-高尔基体运输机制的讨论。超分辨率和STED成像揭示了与高尔基体堆栈紧密连接的细小内质网管状结构，表明在囊泡运输过程中存在短暂的膜连续性。超分辨率成像与功能分析方法（如FRAP、FRET-FLIM、光遗传学和单粒子跟踪PALM）的结合，进一步细化了对SNARE组织、膜纳米结构和逆向运输途径的理解。超分辨率成像不仅提高了空间精度，还重新提出了之前被认为已解决的机制问题。内质网和高尔基网内纳米级区室的可视化揭示了挑战简单顺-中-逆区室模型的新细节。高分辨率成像还表明了运输方式的多样性，包括囊泡、管状连续性和膜接触位点。超分辨率显微镜不仅解决了长期存在的争议，还揭示了更多的复杂性，表明提高的分辨率往往揭示了新的异质性，而非明确的答案。尽管有纳米级的进步，但仅靠荧光方法无法完全解析膜的超微结构。这一限制促使人们采用了将分子身份与电子密集结构直接结合的相关策略。
相关光电子显微镜（CLEM）作为一种强大的综合成像策略，结合了荧光成像的分子特异性和电子显微镜的超微结构分辨率。这通过在同一仪器上同时使用光和电子显微镜来实现。除了集成平台外，CLEM也可以使用单独的光和电子显微镜依次对同一样本进行成像，通过可信标记、图案化基底或内在的细胞标志物来实现荧光和电子显微图的精确对齐。荧光标记和蛋白质用于确定样本中蛋白质的具体位置，可能是在动态过程中；而电子显微镜的使用提供了更详细的细胞组分超微结构。当比较电子显微镜和共聚焦显微镜的示例图像时，可以清楚地观察到每种成像系统的不同优势（图2）。电子显微镜显示了细胞的精细细节，如植物高尔基体的复杂带状结构，而使用传统的共聚焦显微镜时，可以通过特定靶向的荧光蛋白识别单个高尔基体；它们看起来更像是扁平的圆盘，而不是复杂的多层细胞器。这些能力基于早期的固定和染色方法，其中免疫荧光和免疫电子显微镜首次使得能够在定义的细胞结构内定位蛋白质，尽管是在静态快照中。从这些早期基于抗体的方法到现代CLEM的进步，凸显了显微镜技术的快速演变，逐步整合了分子特异性、超微结构细节以及越来越多的动态信息。
实际上，CLEM的广泛应用仍受到几个核心挑战的限制，包括样本保存、成像模式之间的注册以及在样本制备过程中保持荧光。然而，尽管存在这些挑战，CLEM已成功应用于分泌途径的研究。值得注意的是，CLEM最近被用于表征酵母中COPII囊泡的形成，并提供了关于内质网-高尔基体界面的结构和功能的见解。展望未来，随着抗固定荧光剂的持续开发和改进的图像注册工具，CLEM的工作流程可能会得到加强，从而能够快速跨多种模式对数据集进行对齐。
随着成像技术的分辨率和速度的提升，显微镜数据集的规模和复杂性也在增加，这需要自动化分析方法。人工智能（AI），特别是深度学习，已成为生物图像分析中的变革性工具。卷积神经网络（如U-Net）能够在包括植物、酵母和哺乳动物细胞在内的多种系统中对荧光和电子显微镜数据集中的细胞器进行稳健的分割。在分泌途径的背景下，AI辅助的分割促进了内质网网络拓扑、高尔基体堆栈形态和囊泡群体的定量分析，减少了观察者的偏见，并实现了统计上稳健的比较。自动化的电子显微镜分割方法进一步实现了细胞器连接性和膜接触位点的三维重建。除了分割之外，基于深度学习的去噪和恢复算法在保持结构细节的同时提高了信噪比，允许在活细胞成像过程中降低照明强度并减少光损伤。AI越来越多地集成到能够进行实时决策的自适应显微镜系统中。这些方法使得检测罕见运输事件、自动跟踪囊泡动态以及根据细胞行为优化成像参数成为可能。这些发展对于研究快速的内质网-高尔基体相互作用和瞬态囊泡融合事件特别相关。在系统层面，机器学习促进了高内容表型分析，将分泌途径的形态与遗传扰动联系起来，推进了定量和预测性模型的发展。然而，AI方法也引入了新的挑战，包括训练偏差、可解释性限制以及对高质量注释数据集的依赖。严格的验证和透明度仍然是必要的。总体而言，人工智能正在将显微镜从主要基于观察的学科转变为一种能够生成关于分泌途径组织机制和预测性见解的定量、数据密集型科学。分泌途径研究的历史表明，显微镜技术的进步不仅提高了分辨率，还重塑了概念模型。经典电子显微镜建立了内质网-高尔基体系统的结构框架，并支持了以细胞器为中心的运输解释。功能性电子显微镜将结构与生物合成活动联系起来，但留下了动力学问题的未解决状态。活细胞荧光成像技术为研究提供了时间上的洞察力，揭示了细胞器的运动性和物质运输过程，这些发现挑战了传统的静态观点，并加强了诸如高尔基体成熟等动态模型的准确性。在植物细胞中，高度活跃的高尔基体堆叠结构以及紧密的内质网-高尔基体耦合进一步丰富了这些研究结果。图6（可在图形查看器或PowerPoint中打开）。
解读分泌途径：不同尺度下成像技术的演变。该示意图展示了显微镜技术的进步如何逐步完善了分泌途径的概念模型。经典的透射电子显微镜（20世纪50-80年代）确定了内质网-高尔基体系统的超微结构，并支持了以囊泡为中心的运输模型。荧光显微镜技术的革命（20世纪80-21世纪）借助基因编码的荧光标记物和活细胞成像技术，揭示了细胞器的动态行为、物质运输过程以及依赖于细胞骨架的高尔基体运动，尤其是在植物细胞中。冷冻电子显微镜和冷冻电子断层扫描（21世纪至今）实现了对膜结构、膜蛋白组装以及内质网-高尔基体界面的近乎天然状态的三维可视化，从而进一步完善了运输中间体的结构模型。近年来，超分辨率显微镜技术和光电子显微镜结合技术（21世纪至今）能够解析纳米级别的细胞器区室化现象，并将分子身份与超微结构直接关联起来。人工智能和计算显微镜技术通过自动化分割、定量分析及预测建模将这些方法整合在一起，将分泌途径从一个描述性的形态学系统转变为一个动态的、多尺度的、更加定量的研究框架。最新的发展不仅提高了研究的精确度，也增加了研究的复杂性。冷冻电子显微镜技术能够观察到接近天然状态的细胞器结构，从而对囊泡形成和膜组织模型进行了更精确的描述；超分辨率成像技术揭示了曾经被认为均匀的细胞器内部的纳米级亚结构；而光电子显微镜结合技术则将分子身份与超微结构联系起来。这些方法并没有直接解决长期存在的争议，而是揭示了更多的异质性。如今，人工智能和计算显微镜技术使得大规模定量分析成为可能，推动该领域向数据驱动和更具预测性的方向发展。综合性的成像策略正在将分泌途径转变为一个多尺度系统，在这个系统中可以同时研究结构、动态过程和分子组织。然而，一些基本机制问题仍然存在，因此未来的显微镜技术进步不仅会进一步阐明细胞内物质运输的机制，还将重新定义我们对这一过程的理解。
利益冲突声明：
作者声明不存在任何利益冲突。
资金信息：
CP获得了Leverhulme Trust提供的早期职业发展奖学金（ECF-2022-002）。EF获得了生物技术和生物科学研究委员会（BB/T008784/1）的资助。
