反义寡核苷酸（ASO）已被证实是治疗中枢神经系统（CNS）疾病的重要候选药物，但经鞘内给药引发的神经毒性是其临床转化的主要限制因素。既往研究已探索多种降低毒性的策略，但核酸碱基化学修饰对毒性的调控作用尚不明确。本研究通过体外与体内实验，系统评估了将gapmer型ASO中的鸟嘌呤替换为次黄嘌呤，以及其他碱基替换为次黄嘌呤对毒性与活性的影响，并进一步分析了多种鸟嘌呤化学修饰经小鼠脑室内注射后的中枢神经毒性与疗效变化。研究发现，鸟嘌呤替换为次黄嘌呤可显著降低神经毒性，而腺嘌呤或胞嘧啶替换为次黄嘌呤则会加剧毒性；所有类型的次黄嘌呤替换均会降低ASO与目标RNA的结合亲和力，并削弱体内基因沉默效率。在此基础上，研究人员筛选出多种可缓解神经毒性的鸟嘌呤修饰，其中7-脱氮鸟嘌呤（7-deazaguanine）修饰在维持ASO原有基因沉默活性的同时，实现了最显著的毒性降低效果。该研究揭示了核苷酸碱基依赖性的神经毒性机制，并提出鸟嘌呤修饰是一种在不牺牲治疗活性的前提下改善ASO中枢安全性的有效策略，为针对中枢神经系统疾病的ASO药物设计提供了新方向。
引言
反义寡核苷酸（ASO）疗法的临床有效性与安全性证据正逐步积累，已有多个药物获批上市。由于ASO分子量大且带负电荷，无法穿透血脑屏障，因此针对中枢神经系统（CNS）疾病通常采用鞘内给药。Nusinersen作为首个获批用于中枢系统的ASO药物，采用硫代磷酸酯（PS）骨架与全2′-O-甲氧乙基（2′-MOE）修饰，用于治疗脊髓性肌萎缩症，但临床中仍观察到无菌性脑膜炎等不良事件。Tofersen作为靶向超氧化物歧化酶1的gapmer型ASO，在肌萎缩侧索硬化症的临床试验中也报告了脊髓炎、神经根炎及无菌性脑膜炎等严重神经不良反应。因此，开发兼具高效基因沉默能力与更高安全窗的ASO是中枢疾病治疗的关键需求。
Gapmer型ASO通过序列特异性结合目标RNA形成异源双链，招募RNase H切割靶RNA。翼区的锁核酸（LNA）修饰可增强结合亲和力与核酸酶抗性，提升治疗效果，但多项研究报道鞘内注射此类ASO后可引发中枢行为异常。既往研究提示ASO的序列特征与神经毒性相关，鸟嘌呤距离3′端越近、鸟嘌呤富集程度越高，急性毒性越强。此外，有研究表明核苷酸碱基修饰可降低gapmer型ASO的肝毒性，这提示碱基修饰可能同样适用于缓解神经毒性。基于此，本研究首先探究LNA-gapmer中四种碱基与神经毒性的关联，重点验证鸟嘌呤替换为次黄嘌呤对体外与体内毒性的影响，随后筛选可在不降低活性的前提下减少毒性的鸟嘌呤化学修饰，包括N2-甲基鸟嘌呤、N2-异丁基鸟嘌呤与7-脱氮鸟嘌呤，并通过小鼠脑室内（i.c.v.）注射、急性耐受性评分系统（ATSS）、旷场实验及脑内基因沉默效率评估，结合熔解温度（Tm）测定与RNase H切割实验，明确修饰对ASO性能的影响。
结果
次黄嘌呤替换减轻gapmer型ASO的细胞毒性
研究人员首先测定了靶向小鼠微管相关蛋白tau（Mapt）mRNA的16-mer LNA-gapmer ASO1与靶向β-位点淀粉样前体蛋白裂解酶1（Bace1）mRNA的13-mer LNA-gapmer ASO2及其次黄嘌呤替换衍生物的Tm值。结果显示，鸟嘌呤替换为次黄嘌呤后，ASO双链稳定性显著下降，Tm降低超过10 °C。细胞毒性实验中，Neuro-2a小鼠神经母细胞瘤细胞转染ASO1或ASO2后，乳酸脱氢酶（LDH）释放呈剂量依赖性升高，细胞活力下降；而将gap区鸟嘌呤替换为次黄嘌呤后，两种ASO的LDH释放均被显著抑制，细胞活力下降趋势得到缓解。靶基因表达分析显示，两种原始ASO均呈浓度依赖性敲低靶mRNA，但次黄嘌呤替换后，除50 nM高浓度组外，ASO1在所有浓度下的沉默活性均下降；ASO2在5 nM及以上浓度下的细胞内活性也显著降低。这表明次黄嘌呤替换虽可降低细胞毒性，但会伴随双链稳定性下降，进而削弱细胞内基因沉默效率。
鸟嘌呤替换为次黄嘌呤减轻体内急性神经毒性
在体内实验中，小鼠接受i.c.v.注射9.4 nmol ASO1或11 nmol ASO2（均为50 µg/只），通过ATSS评估神经行为毒性。结果显示，原始ASO1与ASO2在注射后1小时即引发严重急性神经毒性，而鸟嘌呤替换为次黄嘌呤的衍生物在1小时（ASO1）或2小时（ASO2）时间点显著改善了神经毒性评分。但靶基因表达分析表明，两种ASO的次黄嘌呤替换衍生物在海马区的基因沉默效率均呈下降趋势，与体外实验结果一致。综合体外与体内数据，鸟嘌呤替换为次黄嘌呤可有效缓解神经毒性。
次黄嘌呤替换的神经毒性效应具有碱基依赖性
为进一步明确碱基特异性，研究人员将ASO1中的腺嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶分别替换为次黄嘌呤并进行体内评估。Tm分析显示，腺嘌呤替换为次黄嘌呤使Tm下降超过10 °C，而胸腺嘧啶或胞嘧啶替换为次黄嘌呤后，双链稳定性极低，无法可靠测定Tm。体内毒性实验显示，腺嘌呤或胞嘧啶替换为次黄嘌呤后，ATSS评分较原始ASO1升高，其中腺嘌呤替换组在注射后3小时最大运动速度显著降低，胞嘧啶替换组在1小时与3小时的最大速度也呈下降趋势，且两组分别出现动物死亡；胸腺嘧啶替换则未改变ATSS评分与运动能力。所有次黄嘌呤替换组的海马区基因沉默效率均显著低于原始ASO1，与Tm下降的结果相符。该结果表明次黄嘌呤替换对体内神经毒性的影响具有明确的碱基依赖性。
鸟嘌呤修饰减轻ASO1的体内神经毒性
鉴于鸟嘌呤替换为次黄嘌呤可降毒但牺牲活性，研究人员尝试对鸟嘌呤进行化学修饰，在ASO1的gap区引入N2-甲基鸟嘌呤（methyl g）、N2-异丁基鸟嘌呤（isobutyl g）或7-脱氮鸟嘌呤（deaza g）。Tm分析显示，methyl g与deaza g未改变双链稳定性，isobutyl g则使Tm下降8 °C。体内实验表明，三种修饰均显著降低ASO1的急性神经毒性，其中deaza g在注射后1小时的ATSS评分改善效果优于次黄嘌呤替换，且运动能力恢复趋势更明显。基因沉默效率评估显示，methyl g与isobutyl g修饰降低了海马区靶基因敲低效率，而deaza g维持了与原始ASO1相当的沉默活性。体外RNase H切割实验进一步发现，methyl g修饰会降低RNase H对ASO/RNA双链的切割效率，这可能是其活性下降的原因。综上，三种鸟嘌呤修饰均可缓解ASO1的体内神经毒性，其中deaza g在降毒的同时未损害治疗活性。
鸟嘌呤修饰对ASO2神经毒性的影响
为验证修饰策略的普适性，研究人员将上述三种鸟嘌呤修饰引入ASO2。Tm结果与ASO1一致：methyl g与deaza g未降低双链稳定性，isobutyl g使Tm下降9 °C。小鼠i.c.v.注射后，三种修饰型ASO在注射后4小时的ATSS评分均显著低于原始ASO2，其中deaza g在2至4小时的ATSS评分与3小时的旷场实验最大速度指标上均表现出最强的毒性缓解效果。基因沉默分析显示，isobutyl g修饰的ASO2未显著降低靶RNA水平，methyl g与deaza g修饰及原始ASO2则可显著下调靶基因表达。这表明deaza g在不同序列的gapmer型ASO中均能实现毒性降低且不损失基因沉默活性。
讨论
本研究证实鸟嘌呤替换为次黄嘌呤可在体外与体内减轻ASO诱导的神经毒性，而鸟嘌呤化学修饰同样可降低体内神经毒性，其中7-脱氮鸟嘌呤的效果最为突出，且不影响治疗活性。次黄嘌呤替换降低细胞毒性的机制可能与次黄嘌呤模拟鸟嘌呤与蛋白质侧链相互作用的能力改变有关，从而减少与毒性反应相关蛋白的结合。体内实验中鸟嘌呤替换为次黄嘌呤缓解神经毒性，与既往研究中鸟嘌呤含量越高、钙振荡评分越低、神经毒性越强的结论一致。已知鸟苷酸可作为α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体的竞争性抑制剂，且ASO诱导的急性神经毒性与神经元内游离钙浓度下降相关，因此推测鸟嘌呤通过与包括AMPA受体在内的细胞表面蛋白非特异性相互作用介导神经毒性，而次黄嘌呤替换可减弱这种相互作用。
不同碱基替换为次黄嘌呤的效应差异与既往报道的序列特征规律相符：胞嘧啶与腺嘌呤富集序列可改善神经功能损伤，胸腺嘧啶富集序列无显著影响。三种鸟嘌呤化学修饰均缓解了原始ASO的急性神经毒性，推测其机制同样与减少非特异性蛋白结合相关。次黄嘌呤替换导致所有ASO沉默活性下降，原因是I–C配对氢键减少及错配增加，使Tm显著降低。相比之下，7-脱氮鸟嘌呤不改变Watson–Crick碱基配对，因此维持了双链稳定性与Tm；N2-甲基鸟嘌呤虽未降低Tm，但因空间位阻影响RNase H识别与切割，导致活性下降；N2-异丁基鸟嘌呤则因体积更大的取代基产生更强空间位阻，进一步削弱RNase H活性。本研究仍存在一定局限，鸟嘌呤修饰对AMPA受体相互作用及RNase H结合亲和力的具体影响机制仍需深入阐明，且修饰对脱靶效应的影响、在不同长度与化学修饰类型的ASO中的普适性，以及鞘内给药是否可获得相同安全性改善，均需进一步验证。总体而言，本研究提出了碱基修饰这一改善ASO中枢安全性的新策略，其中7-脱氮鸟嘌呤修饰在平衡毒性与活性方面表现最优，为中枢神经系统疾病ASO药物的设计提供了重要参考。
结论
本研究证明鸟嘌呤化学修饰是降低LNA-gapmer型ASO急性神经毒性的有效策略。既往研究已表明减少PS连接、糖基修饰（如2′-O-甲基、2′-MOE、5′-环丙烯）可缓解神经毒性，而本研究进一步凸显了碱基修饰的潜力。其中7-脱氮鸟嘌呤修饰在降低毒性的同时保持了基因沉默活性，为针对中枢神经系统疾病的ASO设计提供了新的优化方向，是推动ASO疗法安全性提升的重要进展。
