郑清·朱 | 阿津·霍达埃 | 海伦·E·金 | 哈里·韦南斯 | 萨伯·阿明·亚瓦里
乌得勒支大学医学中心骨科
乌得勒支 3508GA，荷兰
S.AminYavari@umcutrecht.nl
骨骼再生，尤其是在关键尺寸的缺损情况下，仍然是一个重要的临床挑战。羟基磷灰石（HA）因其与骨矿物质的相似性而被广泛使用，但其生物活性通常需要进一步改进。引入治疗性金属离子显示出潜力，但铜（Cu）和锶（Sr）的联合效应及其机制差异仍需进一步探索。Cu和Sr通过不同的信号通路影响干细胞：Cu促进血管生成并调节分化，而Sr促进骨形成和骨重塑。重要的是，这些差异不仅限于干细胞调控；Cu和Sr在骨形成和血管生成过程中激活了不同的机制。当两者结合时，这种双重作用产生了真正的协同效应，独立增强了骨形成和血管生成的结果，超出了任何单一离子所能达到的效果。为了利用这一点，我们开发了一种由聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）组成的可注射双网络水凝胶，并将其与通过水热法合成的Cu/Sr共掺杂HA结合。通过改变合成温度（80°C、120°C、160°C），我们揭示了HA结晶度对生物活性的依赖性，并确定120°C为结合机械稳定性和生物性能的最佳温度。细胞毒性测试确定了Cu和Sr的安全阈值。值得注意的是，在这些最佳阈值下共掺杂得到的复合材料具有优异的可注射性、体内外生物相容性，并且最重要的是，通过互补机制协同促进了骨形成和血管生成。这种双离子策略为同步骨和血管再生提供了新的途径。
1. 引言
骨骼再生在再生医学和骨科中仍然是一个关键挑战，特别是对于超过身体自然愈合能力的关键尺寸缺损（1-3厘米）。这些缺损通常由创伤、肿瘤切除或退行性疾病引起，需要移植来 bridging 缺口并刺激修复。自体移植（患者自身的骨骼）因其骨生成活性和相容性被认为是金标准，但其使用受到供体部位并发症和供应限制的影响。异体移植（尸体骨骼）避免了供体部位的问题，但仍有免疫排斥和疾病传播的风险，且机械性能不稳定。异种移植（动物来源的骨骼）面临类似的免疫障碍和更高的传染病风险。虽然这些基于移植的方法主导了临床实践，但其局限性（包括二次手术、生物变异性和感染风险）推动了人们对具有可调性能和减少并发症的合成替代品的需求。合成骨移植材料（如羟基磷灰石（HA）通过提供可调的机械性能和消除供体部位并发症来解决这些局限。虽然HA与天然骨矿物质的化学相似性是其骨传导性的基础，但其生物性能取决于其结晶度——这一参数可以通过水热合成条件来控制。高结晶度的HA在高温（>200°C）下合成，具有适合承重应用的强大机械强度，但降解速率较慢，不利于离子交换和新骨形成。相反，在较低温度（80-120°C）下合成的HA结晶度较低，能更有效地模拟新生骨矿物质，从而增强生物吸收和成骨细胞粘附。然而，在较低合成温度下产生的过多无定形成分会损害结构完整性，导致移植物过早溶解。水热合成通过调节反应温度可以实现精确的结晶度调控。研究表明，将温度从80°C升高到200°C可以使HA晶体生长从c轴主导转变为a轴主导，改变表面拓扑结构和蛋白质吸附动态。Feng等人的研究表明，无定形磷酸钙比纳米结晶或烧结HA更能支持成骨细胞粘附，尽管它们极端的温度差异（80°C vs. 1100°C）使得直接比较结晶度变得复杂。新兴的多温度水热协议提出了梯度结晶度支架，可能实现了空间可控的降解和骨化。
鉴于当前骨组织工程的发展状况，人们正逐渐从昂贵且可能有风险的重组生长因子（如BMP-2和VEGF）转向更稳定的“无药物”离子基方法。在这种情况下，像钙和磷这样的非金属元素对于形成结构矿物基质至关重要，而金属微量元素（如Cu、Sr、Mg、Zn）作为强大的生物指令信号，可以积极调节血管生成、骨形成和骨重塑。HA表现出独特的离子交换能力，允许用治疗性二价金属（如铜和锶）替代表面钙离子，同时保持其结晶结构。这一特性使HA生物材料的功能化在骨再生过程中增强特定生物响应。Cu显示出多功能作用，作为参与电子转移、氧气运输和金属稳态的酶蛋白的辅因子。将其嵌入骨移植材料中可以通过激活血管内皮生长因子来促进血管生成，改善养分向植入部位的输送。此外，Cu还具有抗菌作用并刺激胶原蛋白沉积，尽管最佳浓度仍需确定。研究表明，低浓度（≤1.0 wt%）的Cu可增强成骨细胞活性和血管化，而高浓度（≥2.0 wt%）则会损害碱性磷酸酶活性、胶原蛋白合成和啮齿动物模型中的异位骨形成。这种双相反应强调了在材料合成过程中精确控制掺杂剂的必要性。相比之下，Sr通过激活钙感知受体（CaSR）刺激成骨细胞分化并抑制破骨细胞介导的吸收，对骨重塑具有双重调节作用。它的离子半径和与钙的相似性使其能够融入HA的原子结构并在材料降解过程中释放。临床上，硫酸锶自2004年以来已被证明在治疗骨质疏松症方面有效，验证了其合成代谢和抗分解代谢机制。在骨科植入物上的Sr掺杂HA涂层通过上调RUNX2和骨钙素等骨生成标志物增加了骨整合。新兴研究探讨了多离子掺杂的协同效应，尽管现有证据仍然有限。虽然Wu等人展示了Cu-Si共掺杂能增强骨形成，但仍需要系统研究Cu和Sr的具体组合。与主要支持早期基质合成的Si不同，Sr以其独特的双重药理学作用而脱颖而出。
先前的研究强调了Cu或Sr掺杂HA的骨生成和血管生成益处。Cu促进血管生成和骨生成分化，而Sr促进骨形成和矿物质密度。然而，关于Cu和Sr在HA中的联合效应的研究，尤其是在水凝胶系统中的研究有限。仔细控制金属离子剂量至关重要，因为过量会导致骨生成受抑制、炎症、氧化应激或全身毒性。目前尚无确定的Cu和Sr的毒性阈值，且HA结晶度对共掺杂体系中的生物相容性和细胞附着的影响仍需探索。解决这些空白有助于优化骨移植材料的机械和生物性能。为此，这里开发了一种结合聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）与Cu和Sr掺杂HA的双网络水凝胶。PVA具有出色的生物相容性和机械强度，通过其羟基形成稳定的水凝胶。4-羧基苯硼酸（CPBA）作为生物相容性交联剂，与PVA形成共价硼酸酯键。海藻酸钠（SA）作为一种天然多糖，通过形成钙离子的离子网络进一步增强水凝胶的稳定性和细胞附着。水热合成的Cu和Sr共掺杂HA通过增强其机械强度和提供活性离子的控制释放进一步强化了水凝胶。本研究介绍了PVA、SA、Cu/Sr掺杂HA的复合材料，并评估了水热合成条件如何影响HA的结晶度，从而影响复合材料的机械和生物性能。此外，还研究了Cu和Sr在复合材料中的细胞毒性阈值和分化特性。最后，系统研究了不同浓度的Cu和Sr掺杂对HA骨生成和血管生成潜力的影响。
2. 材料与方法
2.1 材料
硝酸钙（CaNO3，MW：236.15，CAS：13477-34-4）、硝酸铜（CuNO3，MW：241.60，CAS：10031-43-3）、硝酸锶（SrNO3，MW：211.63，CAS：10042-76-9）、磷酸氢铵（MW：115.03，CAS：7722-76-1）、氢氧化铵（最大33% NH3）、海藻酸钠（SA，CAS：9005-38-3）、聚乙烯醇（PVA，MW：85,000-124,000，CAS：9002-89-5）和氯化钙（CaCl2，MW：110.98，CAS：10043-52-4）均购自德国Sigma Aldrich。4-羧基苯硼酸（CPBA，CAS：14047-29-1）购自美国Thermo-Fisher Scientific Chemicals。Advanced DMEM（Thermo-Fisher Scientific，美国）、内皮细胞生长培养基-2 BulletKit（EGM-2，CC-3162，Lonza，瑞士）、RPMI 1640培养基（Thermo-Fisher Scientific，美国）、青霉素-链霉素抗生素（Pen-Strep，Thermo-Fisher Scientific，美国）、L-抗坏血酸2-磷酸盐半镁盐水合物（l-抗坏血酸，A8960，Sigma Aldrich，德国）、地塞米松（DXMS，D8893，Sigma Aldrich，德国）、β-甘油磷酸二钠盐水合物（BGP，G9422，Sigma Aldrich，德国）和胎牛血清（FBS，Invitrogen，英国）用于体外细胞培养。食用苏木精钠盐（MW：251.17，CAS：62758-13-8，Sigma Aldrich，德国）、佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA，P8139，Sigma Aldrich，德国）、Pico Green试剂（P7589，Thermo-Fisher Scientific，美国）和活/死细胞检测试剂（Thermo-Fisher Scientific，美国）用于细胞活力检测。Matrigel（356234，Corning，美国）用于管形成试验。碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（CAS：9001-78-9）、茜素红S（MW：342.26，CAS：130-22-3）和十六烷基吡啶氯化物（CPC，MW：358.00，CAS：6004-24-6）购自德国Sigma Aldrich，用于骨生成评估。Trizol（Thermo-Fisher Scientific，美国）、iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，美国）和iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，美国）用于RNA分离、cDNA合成和qRT-PCR检测。脂多糖（LPS，00-4976-03，ThermoFisher Scientific，美国）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α，DY210，RδD系统，美国）ELISA试剂盒用于基本全血检测。
2.2 方法
2.2.1 HA和金属掺杂HA颗粒的合成
采用水热合成方法合成了不同结晶度的HA。简而言之，将等体积的1 M硝酸钙（1.5 ml/min）缓慢加入0.6 M磷酸氢氨溶液（[Ca]/[P] = 1.67），然后用25%氢氧化铵调节pH值至10，在室温下磁力搅拌两小时。所得悬浮液转移到内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，溶液体积占高压釜容量的70%。进行了多次实验，将高压釜加热至80°C、120°C或160°C，持续20小时。收集沉淀物并用乙醇匀质化后，通过离心以2000 rpm分离沉淀物，每种沉淀物重复此过程三次。然后用Milli Q水重复此过程。洗涤后，用超声处理将沉淀物均匀分散在Milli Q水中，然后冻干。冻干后的HA粉末储存在密封塑料管中，等待分析和进一步测试。HA的形成基于以下反应：
Ca(NO3)2 + 6(NH4)2HPO4 + 8NH4OH → Ca10(PO4)6(OH)2 + 6H2O + 20NH4NO3
对于金属（M）掺杂HA的合成，用不同摩尔比的Cu（0.5%、1%、3%、5%）和Sr（2%、4%、8%、12%）替换Ca。[Ca + M]/[P]的摩尔比保持在1.67。Cu/Sr-HA的双金属离子合成过程与上述方法相同，只是在HA合成过程中加入Cu和Sr（0.5 mol% Cu/4 mol% Sr或1 mol% Cu/4 mol% Sr）。水热合成方法和粉末获取与上述方法相同。
2.2.2 HA-PVA/SA可注射复合材料的合成
溶液A是通过在80°C下将14 wt% PVA搅拌3小时直至溶液变得均匀透明来制备的。溶液B是在室温下将6 wt% SA搅拌2小时溶解在Milli Q水中制备的。在10 wt% NaOH中制备不同浓度的CPBA溶液，并用1 M HCl调节溶液的pH值（7.4或8.4）。为了制备复合材料，首先在30% wt HA或M-HA颗粒存在下混合溶液A和B；然后加入溶液C以交联PVA网络。最后，用1.4 M CaCl2溶液冲洗形成的凝胶以交联SA网络，形成双网络。最终圆柱形样品使用6 mm biopsy punch（D = 6 mm，H = 3 mm）制成。为了研究干燥状态下的复合材料，样品被冻干并保存在室温下。HA-PVA/SA复合材料表征
合成的HA颗粒通过扫描电子显微镜（SEM，Zeiss EVO 15-EDX，Bruker Xflash 6/30双探测器）和能量分散X射线光谱仪（XRD，Bruker D8 Advance，Cu Kα，λ = 0.15406 nm）进行了形貌分析。相组成通过X射线光谱分析（XRD，Bruker D8 Advance，Cu Kα，λ = 0.15406 nm）进行检测，步长为0.02°。晶粒尺寸使用Scherrer（Ds）公式计算：
β代表半高宽（FWHM）；选择（002）平面来计算所有合成HA样品的Ds。
39A Thermo Scientific Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）配备Pike GladiATR衰减总反射（ATR）单元和金刚石窗口，在400至4000 cm−1范围内记录数据以研究分子相互作用。WITec alpha 300 R共聚焦拉曼显微镜配备了532 nm激光器和每毫米600条刻线的光栅，用于获取HA颗粒的光谱，以探究不同掺杂物对HA结构的影响。每个光谱采集2秒，重复10次，以获得信噪比良好的结果。根据拉曼光谱结果，系统地分析了HA、1% Cu-HA和5% Cu-HA颗粒的特征v1磷酸盐带（957 cm−1）与OH/水带（3572 cm−1）的面积比，以及3572 cm−1带的FWHM，以研究离子掺入HA后的结构变化。
2.2.4 体外实验
2.2.4.1 人类骨髓间充质干细胞（hMSCs）的采集和培养
在机构医学伦理委员会（METC 08-001 K和METC 07-125 C协议）的批准下，从荷兰乌得勒支大学医学中心接受骨科手术的患者中获取健康的骨髓样本。人类材料的获取符合赫尔辛基宣言，得到了当地医学伦理委员会（荷兰乌得勒支大学医学中心（UMCU）的批准，并获得了参与者的书面同意。通过Ficoll–Paque离心法获得单核细胞组分。随后在添加了100单位/mL Pen-Strep和10% FBS的先进DMEM培养基中培养细胞，直到细胞完全贴附到底部并增殖至70–80%的汇合度。然后将贴附的原代细胞传代到相应的代数。第4或第5代细胞用于成骨分化实验，而第5或第6代细胞用于细胞毒性和细胞粘附测定。这些hMSCs在湿润的培养箱中维持（37 °C，5% CO2，MCO-170AICUV-PE，Panasonic）。培养期间每周更换两次培养基。
2.2.4.2 人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）的培养和扩增
HUVECs（Lonza，瑞士）在PBS-gel包被的培养瓶中培养。为了预涂层t175培养瓶（Greiner Bio-One，德国），将10 ml PBS-gel（1%明胶）在培养箱条件下孵育5–6分钟。然后，HUVECs在EGM-2培养基中扩增，并在第6至8代时使用。
2.2.4.3 THP-1细胞系的培养和分化
THP-1人类单核细胞白血病细胞（R&D Systems，美国）在添加了10%（v/v） FBS和1%（v/v） Pen-Strep的RPMI-1640培养基中维持。为了将THP-1分化为M0巨噬细胞，将5 × 10^5个细胞/ml的细胞在100 nM PMA培养基中孵育24小时，直到巨噬细胞贴附到底部。
2.2.4.4 体外实验的样品制备
从复合材料中释放的上清液用于体外实验。简言之，将复合材料浸入六孔板中的先进DMEM中，并在37 °C和5% CO2条件下孵育，质量与体积比为1g/10 mL（根据ISO 10993-13）。然后在孵育1天、3天和7天后收集上清液并更新。在第0天、第2天和第6天更换上清液后进行体外实验，收集孵育1天、3天和7天后的上清液。为了准备成骨分化实验，在复合材料孵育期间将先进DMEM替换为成骨诱导培养基。第7天后，继续使用常规的成骨诱导培养基。为了准备血管生成实验，在复合材料孵育期间将EGM-2培养基替换为EGM-2培养基。
2.2.4.5 细胞毒性
通过Alamar blue测定法研究复合材料的细胞代谢活性。简要来说，将5.54 mg的resazurin盐溶解在50 ml PBS中。混合溶液使用0.22 µm过滤器过滤，然后在先进DMEM中稀释10倍。将5 × 10^3个hMSCs接种到96孔板的每个孔中，并与复合材料的上清液一起培养1天和7天，然后在细胞培养箱中与200 µL稀释的resazurin盐溶液一起孵育2小时。之后，将每组的100 µL上清液转移到新的96孔板中，使用微孔板读数器（激发：560 nm，发射：590 nm，BMG LABTECH，德国）。所有实验组的数据均相对于阳性对照组（在常规培养基中孵育的细胞）进行归一化，根据ISO 10993-5:2009标准，使用70%的代谢活性阈值来确定细胞毒性。通过对裂解的细胞进行Pico Green测定法来定量每个孔中的DNA（dsDNA）含量。还使用在不同温度（80 °C、120 °C和160 °C）下合成的HA复合材料评估HA结晶度对细胞粘附的影响。简言之，当复合材料（3 mm × 3 mm）放置在96孔悬浮板中时，将hMSCs接种在复合材料的表面1天；然后按照上述方法进行Alamar blue和Pico Green测定。通过荧光染色活/死细胞试剂盒（Calcein AM，绿色）可视化分析孵育1天和7天后的细胞存活情况。活细胞用Calcein AM染色，死细胞用ethidium homodimer-1（红色）染色。成像使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，Leica SP8X，德国）。从含有（0.5%、1%、3%、5% Cu和（2%、4%、8%、12% Sr-HA颗粒）的复合材料中收集上清液，以研究不同浓度金属离子的生物相容性。进行Alamar blue、Pico Green测定和活-死细胞染色，以评估第1天和第7天的初始细胞存活率和增殖情况。
2.2.4.6 HUVECs迁移和管形成测定
对于迁移测定，将HUVECs以5 × 10^5个细胞的密度接种在12孔板中并孵育24小时，直到细胞过度汇合。随后用无菌P200移液器尖端在每个孔中划一条划痕，用PBS洗涤后去除未贴附的HUVECs。然后将贴附的HUVECs与复合材料的 상清液共孵育0小时和24小时，并用倒置显微镜（OLYMPUS，日本）观察细胞。使用ImageJ软件根据封闭面积与初始伤口面积的比例量化细胞迁移率。
对于管形成测定，将30 µL解冻的Matrigel放置在预冷却的96孔板中，并在37 °C下放置1小时形成凝胶。然后将HUVECs以每孔2 × 10^4个细胞的密度接种在Matrigel上。它们在37 °C下与释放的上清液一起孵育6小时。使用光学显微镜（DMI1，Leica，德国）观察管形成，并使用ImageJ软件中的血管生成分析插件自动量化节点数、连接点数、分支数、分支长度和管长度。
2.2.4.7 ALP和alizarin red测定
对于ALP测定，将5 × 10^3个hMSCs接种在96孔板中孵育24小时，然后加入释放的上清液以更新培养基。在第7天、10天和14天后收集细胞并进行表征。细胞用0.2% Triton X-100渗透30分钟，然后按照ALP试剂盒说明在室温下进行ALP测定。为了研究细胞外基质的矿化，将5 × 10^4个hMSCs接种在48孔板中，并与释放的上清液和常规成骨培养基一起孵育。第21天，将细胞在100%乙醇中固定15分钟，然后用0.2% Alizarin Red S（pH 4.2）染色30分钟。使用立体显微镜（SZ61，OLYMPUS，日本）成像孔后，将吸附的alizarin red染料溶解在10 mM Na2H2PO4中的10% CPC中。根据吸附染料的浓度量化Ca离子的浓度。
2.2.4.8 RNA提取和qRT-PCR分析
通过qRT-PCR确定成骨（RUNX2/ALP/Col1/OCN）和血管生成（CD31/VEGF）标志物的RNA表达。使用GAPDH和YWHAZ作为内参基因。使用的引物序列见表1。14天后，使用细胞刮刀（541070，Greiner Bio-One，德国）收集细胞，并使用Trizol方法提取细胞的总RNA。提取的1 µg RNA用iScript cDNA合成试剂盒逆转录为20 µL cDNA，然后将cDNA稀释至250 µL。下一个扩增反应系统的总体积为15 µL，包括5 µL cDNA、2.5 µL稀释的引物和7.5 µL iTaq Universal SYBR Green Supermix。变性在95 °C下进行15秒，退火/延伸在60 °C下进行30秒，共40个循环；对于YWHAZ基因，退火/延伸温度设置为65 °C。目标mRNA表达通过2^-ΔΔCt方法量化；对照组进行归一化后与其他组进行比较。
2.2.5 基本全血测定
通过UMC Utrecht Mini Donor Dienst获得两名健康捐赠者的血液，并获得了当地医学伦理委员会的书面知情同意和授权。乌得勒支大学医学中心的医学伦理委员会（METC协议07-125 C；2010年3月1日）给予了伦理批准。将10 ml血液在RPMI培养基中稀释5倍，然后在37 °C和5% CO2条件下与复合材料一起在48孔板中孵育24小时。使用含有1 ng/mL LPS和25 ng/mL PMA的稀释血液作为阳性对照。最后，将每个孔的血液离心（500 g，5分钟）以收集用于ELISA kit测定的TNF-α血清。
2.2.6 统计分析
所有定量测量考虑了三次技术重复。所有数据使用GraphPad Prism 8、ImageJ和Origin 2021进行绘图和分析。所有图中的值均表示为平均值±标准偏差（SD）。统计分析采用了单因素和双因素ANOVA（用于分组比较），并且使用Bonferroni统计假设检验校正多重比较。所有结果根据统计学显著差异进行判断，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
3. 结果
3.1 表征
在80 °C合成条件下，HA颗粒相对较小，表现出不规则的形态，并有可见的聚集现象。在160 °C下，SEM图像显示颗粒尺寸显著增加，形态更加紧凑且聚集程度更高，表明更高的合成温度导致HA颗粒的聚集增加（图1A）。在不同温度（未加热、80 °C、120 °C和160 °C）下合成的HA的XRD分析显示结晶度和峰定义有明显变化（图1B）。标准HA显示出尖锐且定义明确的峰，这是高结晶材料的特征。特定2θ值（25°、31.8°、32°和32.9°）处的峰对应于晶体HA的（002）、（211）、（112）和（300）平面（数据库：96-230-0274,40., 41）。在室温下未加热合成的组中，所有衍射峰都显著变宽。Kis等人的最新晶体学研究表明，天然骨矿物质以单斜钙磷酸盐介晶体的形式存在。很可能我们结晶度较差、未加热的沉淀物最初形成类似单斜前驱相。随后进行的水热热处理（80–160 °C）提供了连续晶体生长和结构成熟所需的动力。在80 °C和120 °C下，结晶度明显改善，峰变得更尖锐和更明确。在160 °C下合成的样品显示出最尖锐和最明确的峰，与标准HA非常相似。随着温度的升高，线条变得更加尖锐，Ds的大小也变大。较高的合成温度促进了HA结构内的晶体生长和有序性，这从XRD峰的变尖可以看出。38下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图1. 合成的HA颗粒和共掺Cu/Sr-HA复合材料的表征。(A) SEM图像展示了在80°C、120°C和160°C下合成的HA颗粒的形态变化。比例尺：50 µm。(B) 从不同温度（室温、80°C、120°C和160°C）合成的HA获得的XRD图案，以及与标准HA 96-230-0274数据库中的HA进行比较（使用(211)峰通过Scherrer方程计算Ds）。(C) 水凝胶组分（PVA、SA）及其组合的ATR FTIR光谱。在2950 cm−1处的小负带是由于材料吸收率低时背景光谱中的异丙醇污染物造成的；它不影响光谱的其余部分（1：PVA，2：CPBA，3：PVA + CPBA，4：PVA + CPBA + Ca，5：PVA + CPBA + SA + Ca，6：PVA + CPBA + SA + Ca + HA）。(D) 共掺Cu/Sr-HA复合材料的FTIR光谱（1：PVA + CPBA + SA + Ca，2：PVA + CPBA + SA + Ca + HA，3：PVA + CPBA + SA + Ca + 4% Sr-HA，4：PVA + CPBA + SA + Ca + 0.5Cu%-HA，5：PVA + CPBA + SA + Ca + 1Cu%-HA，6：PVA + CPBA + SA + Ca + 0.5% Cu/4% Sr-HA，7：PVA + CPBA + SA + Ca + 1% Cu/4%Sr-HA）。(E和F) 涂有不同的Cu（0.5%、1%）和Sr（4%、12%）浓度的HA颗粒的拉曼光谱。(E) 拉曼位移：200–1200 cm−1。(F) 拉曼位移：3400–3700 cm−1。(G) 共掺Cu/Sr-HA复合材料的拉曼光谱（1：PVA + CPBA + SA + Ca + HA，2：PVA + CPBA + SA + Ca + 4% Sr-HA，3：PVA + CPBA + SA + Ca + 0.5 Cu%-HA，4：PVA + CPBA + SA + Ca +1Cu%-HA，5：PVA + CPBA + SA + Ca +0.5% Cu/4% Sr-HA，6：PVA + CPBA + SA + Ca +1% Cu/4% Sr-HA）。为了系统地阐明特定离子掺杂对晶体结构的影响，对所有在120°C下合成的单掺（1Cu，5Cu，4Sr，12Sr）和最佳共掺（1Cu/4Sr）HA粉末进行了XRD相分析（SI图S4）。所有掺杂样品均表现出标准HA相的特征衍射峰，完全没有次要金属氧化物相（例如CuO或SrO）。此外，尽管Cu和Sr离子的掺入不可避免地导致HA结晶度的轻微变化，但这种变化的程度非常有限。使用Scherrer方程对(002)反射进行定量评估显示了掺杂剂引起的晶粒细化。晶粒大小（Ds）从纯HA的40.8 nm降低到最佳1Cu/4Sr-HA的38.8 nm，对于重度掺杂的5Cu和12Sr组进一步降低到约37.0 nm。43，44。12Sr-HA的特征衍射峰与纯HA相比向较低的2θ角度发生了明显位移。这种向左的位移直接表明了层间距的增加和单位晶胞尺寸的膨胀。44使用SEM-EDX分析了(1%，5%) Cu或(4%，12%) Sr-HA的形态和元素分布（SI图S1A）。Ca、磷、Cu和Sr的元素映射表明这些元素在HA晶体中均匀分布，证明了掺杂的成功。HA颗粒的拉曼光谱（图1E和F）显示了典型的磷酸基团振动带。425 cm−1处的带对应于O–P–O弯曲模式，588 cm−1处的带代表磷酸基团的ν4弯曲模式。957 cm−1处的带归因于ν1对称磷酸基团的伸缩。这与1045和1075 cm−1处的行为相似，它们与ν3不对称磷酸基团的伸缩相关。在高波数区域，结构OH伸缩模式位于3572 cm−1。45，46。3572 cm−1处的OH带与957 cm−1处的磷酸带面积比被用作羟基浓度的指标47，因此可以用来衡量合成过程中的脱氢程度48。纯HA组显示出最低的面积比（0.144），表明相对羟基含量较低，而Cu的掺入逐渐增加了这一比例（1% Cu：0.170和5% Cu：0.179）。这表明Cu掺杂可能抑制了脱氢作用。在HA组中，3600 cm−1处强度高的窄峰表明羟基离子具有固定的位置。49此外，还分析了3572 cm−1 OH带的FWHM以评估结构有序性和氢键复杂性。纯HA显示出最窄的OH带（FWHM：8.569 cm−1），表明羟基环境更为有序。然而，在Cu掺杂后，FWHM显著加宽（1% Cu：8.742 cm−1，5% Cu：8.948 cm−1），并且带显示出显著的位移，反映了羟基基团氢键网络的增加的无序性和复杂性（表2）。因此，这些拉曼结果共同表明Cu的掺入在保持HA结构中羟基的同时引起了结构扰动并增加了结构无序性，特别是在较高Cu浓度下。在复合材料的拉曼光谱（图1G）中，3439 cm−1处的宽带是由于水凝胶组分和水分中的O–H伸缩，而2933 cm−1处的带归因于PVA主链中的C–H伸缩。表2. HA/Cu-HA复合材料的面积比和3572 cm−1/957 cm−1带FWHM类型HA颗粒面积比3572 cm−1/957 cm−1FWHMHA（120°C）0.1448.5691% Cu-HA0.1708.7425% Cu-HA0.1798.948合成的复合材料的FTIR光谱显示了表明复合材料成功形成的特征带（图1C和D）。在PVA + CPBA水凝胶中，1423 cm−1处出现的带表明PVA和CPBA之间形成了硼酸酯连接，50，51。3400 cm−1处的O–H峰变得不那么明显，表明交联过程中羟基群体的消耗。添加钙离子进一步改变了FTIR光谱，在1620 cm−1处出现了新的带，表明Ca与羧酸基团相互作用，可能形成了钙羧酸盐复合物。最终复合材料的FTIR光谱在3361 cm−1处显示宽O–H带（宽O–H和吸附的水）和1619 cm−1处显示羧酸基团的CO伸缩。添加HA后，在607 cm−1处出现了强带，对应于HA典型的磷酸基团弯曲振动。1016 cm−1处的带（PO43−对称伸缩）和O–H伸缩带的轻微位移表明HA与聚合物基质的相互作用。含有Cu和Sr-HA的复合材料的光谱显示出明显的变化，包括与磷酸基团和羟基相关的峰强度变化，以及1431 cm−1带的持续存在，表明金属离子存在下硼酸基团的稳定性。这些光谱表明水凝胶内的交联不受Cu和Sr-HA掺入的影响，但磷酸基团的峰位移表明金属离子可能与HA颗粒发生了相互作用。3.2. 膨胀和降解性能每个组的膨胀比率在6小时后趋于稳定，而含有HA的复合材料膨胀比率较低。在相同的pH值下，不同浓度的CPBA对复合材料的降解没有可测量的影响（SI图2A和B），但在相同的CPBA浓度下，pH 8.4的CPBA显示出复合材料的降解速率降低。所有组在SBF中可以保持超过28天（SI图2C–F）。3.3. 注射性和机械性能所有组的可注射率均高于80%（SI图3J）。它们的压缩强度约为2 MPa，组间没有显著差异。随着HA结晶度的提高，复合材料的压缩模量也增加了（SI图3I）。3.4. 优化的复合材料的细胞毒性与hMSCs和巨噬细胞为了确保临床生物安全性，我们有意避免了高毒性的传统化学交联剂（例如戊二醛）和刺激性溶剂（例如DMSO）。虽然过量的系统性硼可以引起骨骼毒性，但CPBA的具体浓度和pH值经过了严格优化（SI图3）。活死染色显示，随着CPBA浓度的降低，死亡细胞的数量也减少了（SI图3A和B）。不含HA的复合材料显示出更多的死亡细胞，而在pH 8.4下制备的复合材料显示出略微更高的细胞毒性，表现为死亡细胞数量的增加。然而，所有组的整体细胞存活率均保持在70%以上，表明具有良好的生物相容性。使用Alamar blue测定法评估了代谢活性（SI图3C和E）。结果表明，低浓度的CPBA（3%，4.5%）增强了hMSCs的代谢活性，而巨噬细胞的代谢活性在所有组间没有显著差异，表明这些材料对每种细胞类型都没有细胞毒性。Pico Green测定法（SI图3D和F）显示各组之间的dsDNA含量没有显著差异，表明所有条件下的细胞增殖一致。基于膨胀、降解和细胞毒性结果，选择优化后的CPBA（3%，pH = 8.4）进行后续复合材料合成。3.5. 不同结晶HA复合材料的细胞粘附性能Alamar blue测定法表明，在120°C下合成的含有HA的复合材料上播种的细胞表现出最高的代谢活性，表明在这种结晶度水平下细胞粘附性得到改善（SI图3G）。Pico Green测定法也得出了类似的结果（SI图3H），支持了120°C下合成的HA促进更好细胞粘附的发现。3.6. Cu和Sr掺杂HA复合材料的生物相容性活死染色显示，在3%和5% Cu-HA复合材料中，第1天和第7天都没有存活细胞（图2A），表明在这些高浓度的Cu下存在显著的细胞毒性。在第7天，含有较低浓度Cu（0.5%和1%）的复合材料观察到细胞增殖和扩张，所有Sr浓度都促进了细胞扩张。Alamar blue数据显示，3%和5% Cu-HA复合材料中的hMSCs在第1天的代谢活性低于70%，这些值在第7天进一步降低，表明在这些Cu浓度下持续存在细胞毒性（图2B和C）。0.5%和1% Cu-HA复合材料中的细胞代谢活性在7天后也降低了。相比之下，所有Sr-HA复合材料在第1天和第7天都没有细胞毒性，而且细胞代谢活性在7天后增加，没有毒性迹象（图2F和G）。Pico Green的结果与Alamar Blue数据一致，显示较高Cu浓度组的dsDNA含量显著降低（图2D，E，H和I）。所有组在7天后dsDNA含量没有显著增加，可能是因为细胞以接近饱和的密度播种，限制了进一步的增殖。进行了基本全血测定法来评估两种供体的TNF-α产生情况，包括两个阳性对照（LPS和PMA）和一个阴性对照（常规RPMI 1640培养基）以确定基线细胞因子水平（图2J和K）。在实验组中，TNF-α的产生保持在基线水平，与阴性对照相当，表明没有显著的炎症反应诱导。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图2. 混合了不同浓度Cu和Sr掺杂HA复合材料的生物相容性评估。(A) 第1天和第7天hMSCs的代表性活死染色图像；绿色表示活细胞，红色表示死细胞。比例尺：500 µm。第1天（B）和第7天（C）培养在Cu-HA复合材料中的hMSCs的代谢活性，虚线代表根据ISO 10993-5:2009规定的70%代谢活性的阈值。第1天（D）和第7天（E）培养在Cu-HA复合材料中的hMSCs的DNA计数。培养第1天（F）和第7天（G）时，使用含有Sr-HA复合材料的hMSCs的代谢活性，虚线代表70%代谢活性的阈值，用于根据ISO 10993-5:2009标准确定细胞毒性。培养第1天（H）和第7天（I）时，含有Sr-HA复合材料的hMSCs的DNA计数。（J和K）体外全血检测测量了暴露于不同复合材料的两个供体的TNF-α水平；LPS和PMA为阳性对照。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
3.7. 含Cu和Sr的HA复合材料的促血管生成特性在伤口愈合实验中，24小时后3%和5% Cu-HA复合材料中的HUVECs消失，表明这些Cu浓度具有显著的细胞毒性（图3A）。相比之下，1% Cu和4% Sr-HA复合材料在24小时时的细胞迁移能力比对照组（常规EGM-2培养基）更强（图3C）。管状结构形成实验进一步评估了不同掺杂浓度对血管生成的影响。结果表明，除了5% Cu-HA复合材料外，不同掺杂组处理不会显著影响HUVECs形成管状结构的能力（图3B）。在3% Cu-HA复合材料中观察到了管状结构形成，这表明Matrigel可能降低了Cu的毒性，从而使更高浓度的Cu具有更广泛的应用范围。对管状结构形成参数的量化分析，包括节点数、接头数、分支数和总管长，显示4% Sr-HA复合材料具有最多的节点和接头数（图3D–G）。
3.8. 含Cu和Sr的HA复合材料的成骨特性由于3%和5% Cu-HA复合材料对hMSCs具有观察到的细胞毒性，在活死染色中排除了这两组，不再进行进一步的成骨实验。所有实验组都表现出明显的钙化现象，红色染色表明样品中形成了矿化结节（图4A）。4% Sr-HA复合材料显示出特别强烈的染色，表明其矿化作用比其他组更强。茜素红染色的定量分析显示，所有组（包括含Sr和Cu-HA的组）与对照组（常规成骨培养基）相比都显示出显著的钙化，其中4% Sr-HA复合材料表现出最高的钙化程度（图4B）。这表明在这些浓度下，Sr有效地增强了复合材料的成骨潜力。ALP活性根据dsDNA含量进行了标准化，以考虑细胞数量的变化（图4C–E）。结果显示，在第10天和第14天，0.5% Cu和4% Sr-HA复合材料的ALP活性显著高于其他组，表明成骨分化增加。这些组中观察到的ALP活性升高表明，低浓度的Cu和适量的Sr促进了早期成骨分化，这对于有效的骨再生至关重要。
3.9. 共掺杂Cu/Sr-HA复合材料在促进血管生成方面的协同效应基于上述体外实验结果，选择了0.5% Cu、1% Cu和4% Sr-HA复合材料，以进一步研究Cu和Sr在促进血管生成和成骨方面的协同作用。在伤口愈合实验中，6小时后观察到了细胞迁移（图5A）。所有复合材料的迁移能力都比对照组更强，其中1% Cu/4% Sr-HA复合材料显示出最高的迁移率，显著高于HA、0.5% Cu、4% Sr和0.5% Cu/4% Sr复合材料（图5G）。这表明在最佳浓度下，Cu和Sr具有协同效应，比单独使用掺杂剂更有效地促进了内皮细胞的迁移。管状结构形成实验显示，与对照组相比，不同复合材料培养的HUVECs形成的毛细血管结构显著增加（图5B）。特别是1% Cu/4% Sr-HA复合材料，其分支长度最长，节点和接头数量也显著高于HA和0.5% Cu-HA复合材料（图5C–F）。qRT-PCR分析（图5H和I）通过检测培养14天后血管生成标记物CD31和VEGF的表达来进一步评估Cu/Sr掺杂复合材料的血管生成能力。与对照组相比，0.5% Cu/4% Sr和1% Cu/4% Sr复合材料组的CD31表达水平显著升高，表明内皮细胞活性和血管发育增强。同时，1% Cu/4% Sr-HA复合材料的VEGF表达显著高于所有其他实验组，进一步证实了结合最佳Cu和Sr浓度的协同血管生成效应。
3.10. 共掺杂Cu/Sr-HA复合材料在成骨特性方面的协同效应通过茜素红染色、基于DNA计数的ALP活性测定以及对关键成骨标记物（包括RUNX2、ALP、Col1和OCN）的定量qRT-PCR分析，评估了Cu和Sr共掺杂HA复合材料的体外成骨分化潜力。14天后的茜素红染色及其量化显示所有实验组都出现了明显的矿化现象（图6A和B）。1% Cu/4% Sr-HA复合材料显示出比其他组更强的钙化作用，表明其成骨分化和矿化沉积更为显著；在第10天，1% Cu/4% Sr-HA复合材料的ALP活性显著高于对照组和HA组。在第14天，这种差异更加明显。这是由于1% Cu/4% Sr-HA复合材料的ALP活性显著高于对照组和HA组，强调了其优越的成骨分化能力。通过qRT-PCR进行的基因表达分析提供了关于成骨机制的额外见解。培养14天后，0.5% Cu/4% Sr和1% Cu/4% Sr-HA复合材料的ALP基因表达显著上调（图6F–I）。与对照组和HA组相比，其余实验组的RUNX2表达显著上调。COL1和OCN的表达——分别是基质成熟和晚期成骨的标志物——在0.5% Cu/4% Sr和1% Cu/4% Sr-HA复合材料中升高。然而，在1% Cu/4% Sr-HA复合材料中观察到的增加并不具有统计学意义。虽然Sr掺杂显示出更广泛的治疗窗口，这与Gomes Luz等人的研究结果一致，支持其在高剂量应用中的多功能性。最优浓度（Cu：0.5–1%，Sr：4%）增强了血管生成和骨生成潜力；这些浓度与之前的一些研究略有不同，可能是由于不同的加载系统造成的。由于Cu和Sr在骨生成和血管生成中的功能和机制不同，我们考虑将Cu和Sr结合到HA中，以验证是否可以更有效地促进协同效应。这一过程表明，用1% Cu和4% Sr共掺杂的HA显著增强了内皮细胞迁移和VEGF、CD31基因的表达，这与之前的观察结果一致，并且共掺杂还显著提高了骨生成标志物（ALP、OCN、Col1）和矿化程度，超出了单个离子掺杂的效果。TNF-α ELISA结果显示，在体外条件下，这些复合材料没有引起明显的促炎反应，凸显了其临床应用的潜力。虽然之前的研究已经探讨了Cu/Sr在陶瓷、玻璃或金属基材中的共掺杂，但很少有研究系统地探讨HA的结晶度、离子浓度和递送方式如何共同影响生物学结果。我们的研究通过水热合成精确调节HA的结晶度来填补这些空白。此外，还将最佳掺杂的HA（0.5–1% Cu，4% Sr）结合到一个可生物降解的双网络水凝胶系统中。我们发现，Cu浓度超过1%时会在我们的系统中引起显著的细胞毒性，这与早期报告一致；然而，Matrigel在内皮细胞实验中显著降低了这种效应。另一个发现是，尽管有强烈的矿化作用，但1% Cu组的ALP活性异常低。这可能反映了ALP与后期矿化之间的时间差异，短暂的高浓度Cu最初抑制了ALP，但仍通过Wnt/β-catenin或VEGF等途径间接促进了骨生成。相比之下，Li等人得出结论，Cu可能会限制MSCs的骨生成分化，并通过Runx2通路限制体内骨形成；然而，这也可能是由于使用了高浓度的Cu（5 µmol L−1）。这揭示了Cu在骨再生过程中的复杂作用以及需要谨慎选择Cu浓度。同样，尽管Cu/Sr-HA复合材料总体上增强了骨生成，但在第14天时，1% Cu/4% Sr-HA组显示的RUNX2表达低于仅含Sr的组，可能是因为协同效应加速了骨生成过程，导致RUNX2的表达提前达到峰值随后下调。这种动态模式在之前的研究中也有所观察。这些发现为Cu/Sr-HA复合材料不仅促进骨生成，还调节骨生成分化的时间动态提供了新的机制见解。然而，随着先进的药物递送策略的出现，引入空间配比的Cu/Sr区域是下一代时空骨支架的一个特别有前途的概念。
尽管有这些令人兴奋的结果，但仍需承认几个限制。首先，只评估了一种HA浓度（30%wt），因为初步试验表明，HA负载量超过40%wt会破坏水凝胶的均匀混合性和可操作性；然而，不同的HA负载量可能会影响交联、机械性能、降解行为和细胞相容性。增加HA含量还会压缩水凝胶孔隙，可能限制肿胀和细胞渗透，因此未来的研究应探讨复合材料的孔隙率和内部结构。其次，虽然中等结晶度（120°C合成）表现良好，且优化的CPBA（3%，pH = 8.4）在不影响体外降解的情况下保持了最大的生物相容性，但可能需要调整以确保在体内不同机械载荷和缺陷几何形状下的最佳性能。需要明确指出的是，这种可注射水凝胶的初始压缩模量约为2 MPa，它是专门为非承重骨缺陷（例如填充空腔）设计的，而不是用于分段承重应用。尽管我们的结构数据（XRD/EDS）表明HA晶格的溶解过程是持续且一致的，从而防止了细胞毒性的突然释放，但尚未通过电感耦合等离子体质谱法对实时实际释放动力学进行定量分析；精确的药代动力学分析仍然是必要的下一步。此外，对于某些Cu浓度（例如1% Cu），ALP活性与最终矿化结果之间的差异表明，需要进一步的研究来阐明Cu如何影响骨生成分化的各个阶段，对于基因表达研究，应在早期（例如7天）和后期（例如21天）都设定时间点。此外，体外上清液提取实验无法完全捕捉动态表面拓扑结构和3D局部浓度梯度，因此需要未来的体内缺陷模型来阐明组织再生过程中的物理化学相互作用。虽然我们的体外实验表明炎症反应最小，但需要进行长期体内研究以确认长期的生物相容性并评估复合材料在生理条件下的表现。最后，可以使用诸如在水凝胶基质中的物理包裹或共载入可生物降解微球中的封装策略来引入生长因子（如BMP-2或VEGF），这些方法将实现局部、持续的释放，进一步增强水凝胶复合材料的临床效果，特别是在加速骨再生和改善关键大小缺陷的血管化方面。
基于这些发现，提出了几个未来的研究方向。首先，需要在大鼠中建立临界大小的股骨缺陷模型，并在两个时间点（四周和八周）评估Cu/Sr共掺杂对体内骨形成和新生血管的影响。例如，通过改变Cu的浓度（如降低Cu浓度以促进更多的骨形成或增加Cu浓度以促进血管生成），可以应用一些高生物活性材料来中和Cu的细胞毒性。其次，探索加入其他生物活性离子（如Mg、Zn）或生长因子可能通过协同效应进一步改善再生结果。考虑到我们水凝胶系统的灵活性，可以开发出各种形式的载药制剂，如可注射糊剂或涂层，以满足特定的临床需求。对于微创手术，双 barrels注射器可以通过Y型接头以液态形式输送快速反应的前体。或者，对于需要特定几何形状植入物的临床场景，可以在体外完全交联复合材料，然后在外科植入前将其冲压或模制成定制的宏观形状。第三，根据不同临床应用所需的机械性能，可以调整水凝胶的交联密度或复合材料与其他聚合物或陶瓷的耦合，以提高承重能力。最后，受到最近免疫治疗进展的启发，复合材料也可以被设计用来调节免疫反应，例如引导巨噬细胞极化（如从M0转变为M2），从而增强骨再生和组织整合。这种可注射和可塑的复合材料特别适合微创手术和不规则骨缺陷的治疗，包括治疗关键大小的长骨缺陷、颅面重建、脊柱融合移植增强以及肿瘤切除后的缺陷填充。同时，应评估该复合材料的大规模可制造性。值得注意的是，我们认为该复合材料也可能成为Masquelet技术中不可生物降解的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）间隔物的潜在替代品，后者广泛用于管理大骨缺陷。然而，未来的动物研究是必要的，以评估其诱导膜形成和足够的结构完整性的能力。
**结论**
本研究证明，水热合成的HA可以成功地结合到双网络PVA/SA水凝胶中，并且合成温度可以控制HA的结晶度，从而改变复合材料的机械性能和生物活性。通过仔细调节HA结构中的Cu和Sr浓度，我们在体外实现了对血管生成和骨生成的协同效应。低至中等浓度的Cu（0.5–1%）和中等浓度的Sr（4%）特别有益，而超过3%的Cu则会导致细胞毒性。机制研究表明，骨生成分化的不同阶段，包括基因和ALP的表达以及矿化结节的形成，对Cu浓度具有不同的敏感性，这突显了精确剂量优化的必要性。体外TNF-α实验表明，这些复合材料不会引起明显的炎症反应。我们的发现强调了在基于HA的复合材料中平衡结晶度、离子掺杂和聚合物交联的重要性，以实现促进快速血管化和坚固骨形成的多功能系统。未来的工作应包括体内验证、定制和添加额外生物活性剂的官能化，以推动这种方法在关键大小或大骨缺陷修复中的临床应用。
**利益冲突**
作者声明没有利益冲突。
**数据可用性**
支持本研究结果的数据可以在文章及其补充信息（SI）中找到。补充信息请参见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra01689h。
