王晨曦|冯军|周晨佳|修乐山|胡琴琴|李慧|郭晓奎|王旭|陈敏|尹坤
中国上海交通大学医学院中国热带病研究中心全球健康学院，上海200025
**摘要**
抗菌素耐药性（AMR）是一个紧迫的全球公共卫生问题，尤其是在“同一健康”（One Health）概念下，需要创新的方法来进行有效的治疗和控制。在这种情况下，即时检测（POCT）成为应对这一挑战的关键策略。微流控系统通过实现快速、准确且成本效益高的诊断策略，为AMR的早期检测和治疗指导提供了潜力。本文首先总结了微流控系统中样本处理、制造技术、设计和检测策略的现状，然后重点介绍了微流控诊断技术在AMR领域的最新进展，包括用于抗生素耐药基因（ARGs）检测和抗菌素敏感性测试（AST）的微流控平台。最后，在“同一健康”概念下，讨论了微流控技术在AMR POCT中进一步发展的挑战和前景。
**1. 引言**
抗菌素耐药性（AMR）是一个重要的“同一健康”问题，其根本原因是抗菌压力下耐药菌株的选择和传播[1]。如果不采取适当的干预措施，到2050年，AMR可能导致全球每年有1000万人死亡，造成的累计经济损失约为100万亿美元[2][3]。这一全球威胁的主要原因是缺乏快速可靠的诊断工具，这加速了耐药菌株的选择和传播[4][5][6][7]。传统的诊断方法（如抗菌素敏感性测试（AST）、PCR和全基因组测序（WGS）存在局限性，可能阻碍准确的抗生素处方和管理。例如，AST方法需要昂贵的设备、高技能的人员或较长的周转时间。传统的AST方法在要求和性能上差异很大：肉汤稀释法是金标准，但耗时较长（通常为16-24小时），且所需设备简单；而基于显微镜的AST方法可以提供快速的单细胞分析（几小时内完成），但需要专业人员和先进仪器；PCR可以快速检测耐药基因（2-4小时内），但可能无法检测到与已知遗传标记无关的表型耐药机制。WGS虽然能提供全面的见解，但仍然相对昂贵且计算密集，尽管最近纳米孔测序技术的进步已将某些工作流程中的病原体鉴定和选定的基因组分析的周转时间缩短至8小时[8]。这些权衡突显了在资源有限的环境中需要适应性更强、成本效益更高的替代方案。这严重限制了这些技术在临床应用中的可用性和实用性，尤其是在资源匮乏的地区[9][10]。AMR不仅是一个临床挑战，也是一个由人类、动物、食物系统和环境之间相互传播的耐药细菌和耐药基因所塑造的“同一健康”问题。在这个更广泛的背景下，微流控诊断技术不仅可以支持临床检测，还可以支持在不同环境中的分散式监测和快速检测。除了人类临床诊断外，还应从更广泛的“同一健康”监测框架考虑微流控AMR检测的潜在价值。原则上，这些微型化和集成化的系统可以用于兽医样本、食品基质和环境样本中的AMR监测，而这些领域的快速分散式检测目前仍然有限。尽管大多数报道的平台仍处于概念验证阶段，主要用于临床用途，但它们的便携性、低试剂消耗和多重检测潜力使其成为未来跨领域AMR监测的有希望的候选者。
为了解决这些挑战，迫切需要开发快速、成本效益高且用户友好的诊断方法，以实现及时的AMR检测和大规模筛查。世界卫生组织（WHO）发布了一份全球报告，建议到2020年所有临床医生在开具抗菌药物前应进行快速诊断测试[2]。即时检测（POCT）是一个有潜力的选择，可以显著改善患者结果，支持适当的治疗决策，并促进AMR监测[11]。理想的POCT平台应具备快速、经济、易于操作的特点，并能够在紧凑的格式内整合样本制备、扩增和检测功能。如今，微流控技术已经证明了将样本制备和目标检测集成到单一微型系统中的可能性，为POCT或近患者应用提供了有希望的机会[12][13][14][15]。其小巧的尺寸和灵活的设计显著减少了周转时间，简化了流程，并实现了多重检测[16][17]。微流控系统在AMR诊断中的应用预示着应对这一紧迫全球挑战的范式转变。
多项研究探讨了使用微流控技术快速检测AMR的可行性[12][18][19]。然而，大多数这些平台仍在实验室环境中开发中，尚未达到WHO提出的ASSURED（经济实惠、灵敏度高、特异性强、用户友好、快速、无需设备、易于使用）原则[20]。因此，仍需通过全面回顾来跟踪微流控AMR检测系统的发展，识别不足之处，并提出未来方向。我们预计本文将对寻求建立高效AMR检测和控制的POCT方法的诊断开发者大有裨益。然而，这些系统在临床应用中的实际实施不仅取决于分析性能，还取决于样本类型、工作流程整合程度、仪器要求、操作便利性以及与分散式临床或现场使用的兼容性。本文提供了与AMR诊断相关的代表性微流控技术的叙述性和批判性概述，重点讨论了四个主要方面：样本处理、基底材料、检测策略以及向实际应用转化的挑战。本文主要将POCT视为微流控AMR诊断的转化方向和设计目标。然而，目前报道的许多平台仍处于实验室概念验证阶段，尚未真正实现即时检测功能。
**2. 微流控系统中的样本处理**
有效的样本制备对于成功的下游AMR检测至关重要[21]。根据研究目的，样本制备协议大致分为两类：用于表型AST研究的菌落培养[22][23][24][25][26][27]，以及用于基因型分析的细胞裂解结合核酸提取[29]。值得注意的是，微流控系统在成本效益和易用性方面取得了显著进展（图1）。对于表型研究，微流控技术能够在受控条件下实现高通量单细胞培养，从而在减少试剂体积的情况下精确监测细菌生长和抗生素反应[30][31][32]。在基因型分析中，集成微流控平台结合了快速细胞裂解、核酸提取和芯片上的扩增，简化了耐药基因的检测过程。这些系统降低了交叉污染风险，减少了处理时间，并提高了即时检测的便携性。除了支持基因型检测外，微流控设备还可以从复杂样本中分离和浓缩病原体，以便进行后续的表型AST。最近的研究展示了从尿液等临床基质中分离细菌的简化工作流程，减少了手动预处理的需求[33][34]。
**图1. 微流控系统中的样本处理。**
**注释：AST**：抗菌素敏感性测试。
对于表型AST，样本处理的主要技术进展包括快速细菌富集、芯片上的限制以及受控条件下的微型化培养。标准AST方法至少需要24小时来培养细菌，再需要18-24小时来测量抗生素效果，这使得过程缓慢且劳动密集[35]。微流控技术通过芯片上的细菌富集在几分钟内实现了这一目标，消除了细菌菌落分离的需要，显著缩短了检测时间[30][31][32]。Busche等人[32]展示的微流控纳米间隙捕获原理允许通过芯片过滤和随后的细菌增殖实现样本预浓缩。这种纳米间隙可以在10分钟内从含有10^4个细胞/毫升的稀释液中捕获足够数量的细胞，表明该平台适用于未培养和低浓度样本的检测。Chen等人[31]利用介电泳和电渗流力的协同作用实现了快速富集和浓缩，在2分钟内实现了千倍的目标增强，并在约2小时内完成了完整的芯片AST检测，检测限（LOD）为3个菌落形成单位（CFU）/毫升，比标准离心纯化方法灵敏度高五个数量级。此外，微流控系统的紧凑设计大大减少了试剂消耗，特别是传统AST中使用的培养基和抗生素的用量。一种新型微流控平台被开发用于快速自动AST[36]，仅需纳升级别的试剂即可完成七种抗生素的AST和最小抑制浓度（MIC）的准确测定。这些研究表明，微流控样本处理技术正朝着更快富集、更低试剂消耗和更集成化的检测工作流程方向发展。
对于基因型检测，微流控技术为细菌裂解和目标富集提供了有前景的解决方案，从而减少了周转时间并间接提高了检测能力。临床样本通常包含复杂的基质和低丰度目标，这严重限制了传统分子检测方法的性能。微流控平台通过精确的流体处理、快速热传递和高效的表面核酸捕获解决了这些问题。例如，Valiadi等人[37]开发了一种微流控样本制备系统，该系统包括5分钟的尿液样本孵育、3.5分钟的样本浓缩（从1毫升浓缩至6.4微升）以及5分钟的热裂解，整个样本制备过程仅需15分钟，比市售核酸提取试剂盒快了三分之一[38]。此外，将目标富集步骤集成到微流控系统中显著提高了检测灵敏度。例如，一种集成固相萃取（SPE）腔室的微流控芯片能够在酸洗的硅胶珠上浓缩DNA，实现了高达1 CFU/毫升的灵敏度[39]。纳米多孔氧化铝膜（AOM）过滤器用于改进DNA捕获，实现了微流控平台上核酸的快速富集，检测限达到10个拷贝/微升[40]。因此，微流控平台为资源有限的环境提供了节省时间和用户友好的替代方案[39]。一旦样本处理和目标制备在芯片上集成，基底的选择就成为决定设备性能的下一个关键因素，因为它影响制造策略、流体控制、光学兼容性和适用于即时检测的能力。
**3. 微流控系统的基底**
目前，已经开发了一系列使用不同基底的微流控系统，包括基于硅的材料、聚合物和纸张，用于AMR的即时检测[41]（图2；表1）。基于硅的微流控芯片与透明聚合物或玻璃结合时具有满意的光学透明度，并且与精密制造工艺兼容，可实现实时监测和准确检测[42]。聚合物具有灵活性和成本效益，适合一次性使用[43]。纸质微流控系统具有便携性和简单性，满足资源有限环境的需求[44]。微流控系统基底的进步促进了AMR POCT用微流控芯片的发展。最近的研究进一步扩展了微流控设备的制造范围，越来越多地关注先进的3D制造和混合材料集成，超越了传统的实验室原型制作[45][46]。
**图2. 不同基底材料的微流控系统。**
**注释：PDMS**：聚二甲基硅氧烷；**PMMA**：聚甲基丙烯酸甲酯。
**表1.**多种多样的基底适用于不同的抗菌素耐药性（AMR）检测目的。以下是部分基底及其对应的检测目标、传感器类型、检测限（LOD）、时间参考和检测方法的总结：
| 基底 | 检测目标 | 传感器类型 | LOD | 时间参考 | 检测方法 |
|-------------|-------------------|--------------|-------------|-------------------|
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 1小时 | [47] |
| 玻璃 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | 1个拷贝 | 15分钟 | [48] |
| 玻璃 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 10个拷贝 | 25分钟 | [49] |
| 玻璃 | 细胞外氧气消耗 | NA | 约6小时 | 荧光 | [50] |
| 玻璃 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 3–8小时 | 荧光 | [51] |
| 玻璃 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 18小时 | 显微镜 | [52] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | SERS | 3 CFU/mL | 2小时 | [31] |
| PDMS | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | NA | 24小时 | [54] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | <10 CFU/mL | 2小时 | [39] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 10 CFU/mL | 1小时 | [55] |
| PDMS | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | NA | 15小时 | [56] |
| PDMS | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | 100 CFU/mL | 24小时 | [57] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 30 fg/μL | 2.5小时 | [40] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | NA | 1小时 | [58] |
| 硅 | 单个细胞 | 荧光 | 2–4小时 | [60] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | NA | 约8小时 | [62] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 约5小时 | [63] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 10 CFU/mL | 4–8小时 | [64] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 2–4小时 | [65] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 约5小时 | [66] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 约1小时 | [67] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 4–5小时 | [68] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 8–9小时 | [36] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 3小时 | [53] |
| SERS | 抗菌素耐药细菌（ARB） | SERS | 3 CFU/mL | 2小时 | [31] |
| PDMS | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | NA | 24小时 | [54] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | <10 CFU/mL | 2小时 | [39] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 10 CFU/mL | 1小时 | [55] |
| PDMS | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | NA | 15小时 | [56] |
| PDMS | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | 100 CFU/mL | 24小时 | [57] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 30 fg/μL | 2.5小时 | [40] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | NA | 1小时 | [58] |
| 硅 | 单个细胞 | 荧光 | NA | 2–4小时 | [59] |
| 硅 | 单个细胞 | 荧光 | NA | 约8小时 | [60] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 约5小时 | [62] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 10 CFU/mL | 4–8小时 | [64] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 2–4小时 | [65] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 约5小时 | [66] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 约1小时 | [67] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 4–5小时 | [68] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 8–9小时 | [36] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 3–4小时 | [69] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 1小时 | [70] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 5小时 | [70] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 3小时 | [71] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 3小时 | [72] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 33分钟 | [73] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 30分钟 | [74] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 2–3小时 | [75] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 2小时 | [76] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 3–4小时 | [77] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 1–3小时 | [78] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 光学密度 | NA | 24小时 | [54] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 散射 | NA | 2小时 | [81] |
| SERS | 抗菌素耐药细菌（ARB） | SERS | 103 CFU/mL | 2小时 | [82] |
| SERS | 抗菌素耐药细菌（ARB） | SERS | NA | 5小时 | [84] |
| PMMA | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | 104 CFU/mL | 3小时 | [85] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 1000个细菌/mL | 45分钟 | [37] |
| PMMA | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | NA | 24小时 | [86] |
| PMMA | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法/荧光 | 103 CFU/mL | 5小时 | [88] |
| PMMA | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | 4–9小时 | [89] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 104 CFU/mL | 30分钟 | [90] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 2小时 | [91] |
| 硅 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | SERS | 103 CFU/mL | NA | [93] |
| PC | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 20–200 CFU/反应 | 70分钟 | [94] |
| PMMA | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 荧光 | 30 fg/mL | 40分钟 | [95] |
| PTFE | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | NA | 1小时 | [14] |
| VeroClear | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 显微镜 | 5×10^3个细胞/mL | 2小时 | [96] |
| 纸 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | NA | 过夜 | [97] |
| 纸 | 抗菌素耐药细菌（ARB） | 色度法 | 5×10^3个拷贝 | 1小时 | [98] |
**注释：**
- LOD（Limit of Detection）：检测限，指能够被检测到的最低样本浓度。
- ARB（Antimicrobial Resistant Bacteria）：抗菌素耐药细菌。
- ARG（Antibiotic Resistance Gene）：抗生素耐药基因。
- SERS（Surface Enhanced Raman Spectroscopy）：表面增强拉曼光谱。
- CFU（Colony Forming Units）：菌落形成单位。
- NA（Not Applicable）：不适用。
如表1所示，基于聚合物的平台，特别是聚二甲基硅氧烷（PDMS）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），在报道的微流控AMR检测系统中占很大比例，这反映了它们在制造灵活性和成本效益方面的优势。此外，大多数报道的平台旨在对抗菌素耐药细菌进行表型分析，而不仅仅是检测耐药基因，表明了对快速AST应用的强烈兴趣。荧光和显微镜读数是最常用的策略，而表面增强拉曼光谱（SERS）、光学密度和其他传感模式虽然较少见，但在特定情况下提供了互补的优势。尽管报道的检测时间差异很大，但许多研究已将检测或敏感性测试时间缩短到几小时内，突显了微流控技术在加速AMR诊断方面的潜力。这些趋势还表明，基底选择与预期应用场景密切相关，基于聚合物和纸的平台在低成本和分散式检测方面显示出特别的前景。
**3.1 基于硅的材料**
硅具有热稳定性和化学稳定性，使其成为需要耐热性和精细操作的微流控制造的理想候选材料。由于其晶体结构，硅支持高分辨率的各向异性蚀刻[42]。硅还支持电驱动（例如电润湿、直流/交流电渗流），因为其具有高热导率和电导率。材料的刚性允许精确制造电极，从而实现高压应用，如液滴分选或PCR热循环。由于硅不可变形，气动驱动较少使用，尽管混合设计（例如硅-PDMS结合）可以集成外部阀门。Yao等人[99]开发了一种具有约20,000个微腔的硅数字PCR芯片，实现了与自动化荧光成像的无缝图像采集和融合，并实现了精确的定量分析。然而，硅材料的高成本限制了其作为大规模生产可行材料的吸引力。硅对可见光和紫外光的有限透明度影响了其在主流荧光或显微镜成像读数中的可用性。为了寻找硅的替代品，研究人员将重点转向了玻璃[100]。玻璃是一种理想的材料，具有光学透明度和低荧光背景，使得基于光的检测可以集成到设备中[100]。更重要的是，当涂覆氧化铟锡（ITO）玻璃时，基于玻璃的微流控技术可以实现通道内流体行为的电子控制和操纵，从而实现可编程功能。例如，Kalsi等人[48],[49]设计了包含薄膜晶体管、ITO玻璃和Al2O3形成的离子屏障绝缘层的数字微流控系统，通过全电子控制实现了ARGs检测的复杂流体操纵。通常，为了实现灵活的液滴控制，需要大量的信号线以及复杂的控制电路。数字微流控（DMF）可以使用绝缘电极阵列来静电操纵离散液滴[101]。通过依次激活相邻电极，可以在芯片表面上以可编程的方式运输、合并、分割或混合液滴。这种操纵模式特别适用于AMR诊断，因为它可以实现自动化的小体积反应、灵活的检测设计以及减少试剂消耗的并行处理。“像素数量”指的是DMF阵列中可独立寻址的电极数量，决定了液滴控制的分辨率和灵活性（例如分割、合并和运输）。更高的像素密度可以实现更精确和复杂的流体操作。然而，研究人员通过结合活性矩阵技术和薄膜晶体管基底解决了数字微流控阵列的可扩展性问题。在微流控芯片上进行的高通量分析的可扩展性允许同时处理多个样本，从而提高POCT的检测能力和效率。
**3.2 聚合物**
近年来，聚合物在微流控应用中得到了广泛采用。其中，PDMS是最常用的基底之一，具有许多理想的特性（例如价格低、易于成型、低自荧光和良好的生物相容性[102]。此外，PDMS的透气性可以用于驱动自动样品加载，从而减少对外部大型泵的依赖，并可能提高现场AST的可行性。由于其弹性，PDMS非常适合气动和真空驱动，可以实现集成Quake阀门用于液滴生成或蠕动泵送。功能性PDMS微流控平台的制造涉及几个重要步骤：设计、主模具的制造、PDMS的制备和固化、基底粘合、进出口端口的创建以及最终组装测试。软光刻技术已成为制造PDMS微流控芯片的突出技术[103]。该技术包括一组利用复制模制的方法，只需几个简单步骤即可创建PDMS模具[104]。简而言之，通常使用光刻技术制造刚性主模具，也可以使用注塑成型、热压印或激光打印等快速原型制作方法[104]。接下来，未固化的PDMS通过铸造[71]或旋涂[60]等方法在主模具上成型。随后，在高温下固化芯片层并从模型上剥离，以便进一步处理或组装[73]。除了PDMS，PMMA是另一种流行的微流控聚合物，其特点是高尺寸稳定性、低自荧光和良好的光学性能[105],[106]。像PMMA这样的热塑性塑料更适合离心微流控，因为它们的刚性能够承受旋转力。在某些情况下，PMMA用作波导和基底，便于视觉显微镜观察[85]。基于PMMA的微流控通常通过注塑成型和激光切割来制造复杂的形状和图案[93]。在这两种技术中，激光切割因其能够创建高度精确和准确的设计而脱颖而出，这些设计用其他方法难以实现[42]。为了减少激光切割过程中材料的热损伤风险，最近还使用了计算机数控技术[42]。计算机数控加工的可扩展性和速度允许大规模生产质量一致的微流控系统，从而实现针对特定应用的复杂设计[93]。聚碳酸酯（PC）因其出色的热稳定性而成为有前途的材料。PC的玻璃化转变温度在150–155°C之间，非常适合需要高温的应用[107]。为了展示这一潜力，Meng等人[94]建立了一个基于PC的微流控系统，能够通过环介导的等温扩增（LAMP）反应区分不同的葡萄球菌种类并预测甲氧西林耐药性。
**3.3 纸**
近年来，基于纸的微流控领域已成为POCT的一个有前途的方向。得益于纸的可丢弃性和经济性等优势，纸易于运输、分发和安全焚烧[108]。纸的燃烧副产品（主要是CO2和水）迄今为止危害较小，符合废物处理规定和循环经济目标。此外，纸的多孔性质使得自动化流体处理成为可能，而用户友好的视觉结果读数（通常通过侧向流动条）进一步增强了基于纸的微流控系统的吸引力[109]。Lafleur等人[98]首次开发了一个完全集成的平台，具有基于纸的信号读数，非常适合相关实际应用。该平台包含一个物理多路复用的纸网络，允许独立等温扩增多个目标。扩增后，溶液被转移到侧向流动条上以检测ldh1和mecA。这种设计利用了纸的毛细作用，绕过了外部泵或电源的限制。除了侧向流动设备外，基于纸的显色琼脂还用于基于培养的细菌鉴定和AST[97]。He等人[97]开发了一种微流控设备，集成了基于纸的显色琼脂用于细菌培养，具有用户友好性和适应性，特别是在资源有限的环境中。这些研究表明，基于纸的微流控技术在低成本AMR检测方面具有巨大潜力，特别是在简单性和便携性重要的环境中。除了简单的读数原理外，比色法特别适用于即时护理AMR诊断，因为它们通常需要最少的仪器，并且可以用肉眼或低成本便携设备进行解释。这些特点使它们特别适合分散式测试、初级医疗环境和资源有限的环境，其中可能无法获得先进的光学系统。总体而言，微流控AMR诊断中基底材料的选择不仅取决于它们的内在物理特性，还取决于预期的诊断应用。硅和玻璃通常更适合需要精确制造、稳定热性能或先进光学/电子集成的系统，而基于聚合物的材料则更适合低成本制造、灵活设计和一次性设备开发。基于纸的平台特别适合即时护理和资源有限的环境，因为它们成本低、便携且无需设备。因此，材料选择应基于分析要求、可制造性、成本和分散式测试的实际适用性之间的平衡。
**4. 检测策略**
作为微流控工作流程的最终分析步骤，检测策略决定了如何将生物反应或耐药性标志物转化为可测量的信号。因此，它与芯片设计和操作要求的兼容性对于构建实用的AMR诊断平台至关重要。以下部分重点介绍了这些读数策略在AMR诊断中的应用示例，包括耐药基因检测和表型AST。目前，荧光、色度法、拉曼光谱和显微镜观察是微流控AMR检测平台中的主流检测策略[110],[111],[112],[113]（图3）。一系列微流控系统既支持定性也支持定量研究，产生的视觉信号可以方便地用肉眼或智能手机等便携式电子设备解读[114],[115],[116]。此外，用于原位分析的拉曼散射和单细胞成像技术的发展为AMR识别和监测提供了有前途的解决方案[117],[118]。在这里，我们总结了与各种读数方法相关的独特属性和相关研究，以便在选择最佳读数方法时做出明智的决策。
**下载：**
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**图3. 微流控中的主流读数形式。**
**缩写：**
GFP：绿色荧光蛋白；HNB：羟基萘酚蓝。该平台能够在30分钟内直接识别人体尿液中的抗生素耐药基因（ARGs），检测限（LOD）达到10^4 CFU/mL（图4B）。除了使用膜完整性染料或荧光标记的细菌外，还可以通过酶响应底物实现基于荧光的表型抗菌素敏感性测试（AST）。最近的研究表明，病原体相关的或可诱导的酶活性可以在短时间抗生素暴露后触发荧光底物的水解，从而实现快速敏感性测定，在某些情况下还可以同时进行细菌鉴定[122]、[123]。下载：下载高分辨率图像（972KB）下载：下载全尺寸图像图4. 基于荧光的微流控读数系统。A：集成微流控系统的工作流程包括（a）样品制备和目标DNA分离，（b）随后是洗涤步骤，以及（c）进行LAMP反应并收集荧光信号[47]。B：DMF平台上的DNA扩增工作流程。（d）使用洗脱缓冲液将珠子从DMF装置中的油中移动到储液垫上。（e–g）分配含有试剂、对照品和样品的液滴，并与RPA试剂混合。（h）荧光信号收集[90]。缩写：LAMP，环介导等温扩增；BS，珠子储存；PC，阳性对照；NC，阴性对照；WB，洗涤缓冲液；S，样品；PLR，阳性LAMP试剂；NLR，阴性LAMP试剂；EMA，乙锭单氮化物；ARG，抗生素耐药基因；DMF，数字微流控；RPA，重组酶聚合酶扩增。
4.2. 基于比色的检测由于其简单性、快速性和成本效益，基于比色的检测也被广泛用于微流控中的抗菌素耐药性（AMR）诊断[86]、[124]、[125]。比色检测可以使用简单的设备完成，颜色变化可以通过肉眼或光学读数器观察到，非常适合即时检测（POCT）。Jin等人提出了一种显著的基于比色的微流控平台[85]，该平台使用羟基萘酚蓝（HNB）来可视化LAMP反应中ARGs的扩增。HNB最初呈现紫色，随着反应的进行会变为天蓝色。集成的塑料芯片和封闭管检测平台能够在不到2小时内同时识别六种ARGs，检测限达到10^3 CFU/mL。由于能够快速且灵敏地检测细胞生长或代谢活动的变化，基于比色的检测现在被广泛用于表型AMR研究。在Lee团队的研究中[86]（图5A），首先将试剂（包括细菌悬浮液、pH依赖性比色培养基和抗生素）加载到腔室中。随后液体腔室与不同浓度的稀释抗生素相互作用导致培养基颜色变化，从而确定最小抑菌浓度（MIC）值。此外，引入显色琼脂为AST过程中识别传染性病原体提供了直接的方法。He等人[97]在其实验设计中引入了显色培养基，选择性地促进了大肠杆菌的生长（图5B）。在他们的微流控系统中，同时测试了五种常用的治疗尿路感染的抗生素，从而开发出了第一个能够同时进行细菌培养、物种鉴定和多重AST的纸质设备。下载：下载高分辨率图像（365KB）下载：下载全尺寸图像图5. 基于比色的读数微流控系统。A：使用抗生素组合的基于比色的AST示意图[86]。（a）加载样品、pH敏感的比色培养基和两种抗生素。（b）自动在芯片上分配细菌、稀释和混合培养基和抗生素。这是通过改变泵的持续时间来实现的，持续时间越长，试剂负载量越大。整个过程由连接到芯片的定制气动控制模块控制。（c）培养细菌16-24小时后，通过视觉解释AST结果。（d）如果细菌继续生长，颜色会从红色变为黄色；如果抗生素阻止了微生物生长，则保持红色。B：用于细菌鉴定和抗生素耐药性测试的三层纸质设备示意图。（e）图形表示结合纸质设备的结果：（f）在使用大肠杆菌病原体测试之前，以及（g）使用阿莫西林进行抗生素敏感性测试之后[97]。缩写：AST，抗菌素敏感性测试。
4.3. 基于表面等离子体共振的检测拉曼光谱是一种无标记且非侵入性的分析技术，可以通过拉曼散射效应提供分子的特征指纹，基于分子振动和旋转信息[126]。与荧光和比色方法相比，它不需要荧光标记或颜色指示剂，减少了化学试剂的使用并简化了实验过程[127]、[128]。多项研究利用SERS进行AMR检测。例如，Chang等人[93]开发了一种快速AST平台，该平台结合了膜过滤和SERS活性底物（MF-SERS），通过分析分泌代谢物的SERS光谱（图6A）。这种方法实现了10^3 CFU/mL的检测限，比传统的离心纯化程序的灵敏度高四个数量级[93]。尽管MF-SERS具有高检测性能，但其临床应用受到许多离芯片样品制备过程的限制。因此，Liao等人[83]开发了一种自动微流控系统，该系统具有控制系统来执行所有AST步骤（图6B）。由于消除了试剂的手动处理，系统进一步降低了污染风险。这种高通量AST方法的样本到结果时间为3.5小时，具有高效实施的潜力。Lin等人[84]提出了一种用于多重AST检测的集成芯片。微流控系统采用Y形主通道和64个侧通道来生成抗生素浓度梯度并提供隔离的微环境。侧通道下的792微孔阵列将细菌封装在不同的空间中，实现多重并行SERS分析（图6C）。研究表明，将高灵敏度光谱检测与微流控的精确样品操作和并行处理能力相结合，对于AMR的即时诊断具有潜在的相关性。下载：下载高分辨率图像（870KB）下载：下载全尺寸图像图6. 基于SERS的读数微流控系统。A：膜过滤辅助的SERS平台（MF-SERS）示意图，用于快速AST，其中细菌通过代谢物相关的拉曼信号进行富集和分析[93]。B：由自动微流控控制系统操作的用于基于SERS的AST的微流控设备。（a–c）抗生素预加载包括抗生素注射，随后是分离和干燥。（d）细菌注射以重新配制抗生素并进行孵育（e–f）去离子水洗涤和空气隔离。（g）附着SERS底物以进行同时SERS测量。C：在自动微流控控制系统中用AMP处理3小时后的AMP敏感性和耐药性大肠杆菌的AST结果：（h）敏感菌株的SERS光谱；（i）用AMP处理的耐药菌株的SERS光谱[83]（转载自《Biosensors and Bioelectronics》，第191卷，C.C. Liao等人，一种由自动微流控控制系统操作的用于表面增强拉曼散射抗菌素敏感性测试的微流控微孔设备，第113483页，版权（2021年），经Elsevier许可）。缩写：AST，抗菌素敏感性测试；DI，去离子水；SERS，表面增强拉曼光谱；AMP，抗菌肽。
4.4. 基于显微镜成像的检测在微流控中对细胞进行分子成像和实时监测是最有用的读数策略之一。这项技术能够观察单个细胞或细胞群体的动态变化，由于能够在更小的尺度上观察细胞，显著减少了微生物生长量化所需的时间[119]、[129]、[130]。传统的依赖显微镜的微流控平台通常在微流控芯片上进行琼脂稀释或培养基稀释方法来观察细菌生长以进行AST[27]、[131]。例如，Samuel等人[71]开发了一种基于培养基稀释的微流控AST设备，该设备在八个30纳升腔室中生成浓度梯度并进行细胞培养。该设备可以自动执行AST，包括细菌分布、培养基输送和抗生素稀释。最近，随着单细胞成像技术的进步，跟踪单个细胞的生长变得特别有吸引力，可以在不需要培养的情况下进行快速且无损的AST。Sun等人[15]使用显微镜成像来监测细菌细胞的数量和形态，以确定MIC值，在1-3小时内获得AST结果，为原位、快速和无标记的AST提供了实用解决方案（图7A）。此外，深度学习在自动显微镜图像分析方面成为更可靠的工具[132]、[133]、[134]。Riti等人[133]开发了DropDeepL AST，可以在2小时内提供临床菌株的粘菌素敏感性特征，并允许直接分析尿液样本中高于感染阈值的细菌。该方法使用明场成像来检测液滴中细菌的存在和生长，并使用深度学习算法进行自动图像分析。进一步训练相关模型将提高检测灵敏度并扩大可检测的革兰氏阴性细菌的范围，有助于及时开具针对多重耐药细菌感染的治疗方案（图7B）。下载：下载高分辨率图像（628KB）下载：下载全尺寸图像图7. 基于显微镜成像的微流控系统。A：多重微流控系统的示意图[135]。（a）具有圣诞树设计的微通道结构，用于创建浓度梯度。（b）芯片内不同流速下的细胞培养。（c）在不同药物浓度下观察到的细胞数量变化。（d）在不同药物浓度下观察到大肠杆菌形态长度的变化。B：用于正负液滴分类的工作流程和用于快速自动检测液滴内细菌的卷积神经网络结构（液滴图像改编自X Zhou等人，WSCNet：用于细胞封装微流控液滴的生物医学图像识别，Biosensors 2023）821，https://doi.org/10.3390/bios13080821，根据CC BY 4.0许可）。缩写：relu，修正线性单元
总体而言，不同读数策略是否适合即时AMR诊断取决于分析性能和操作简便性之间的平衡。基于荧光的方法提供高灵敏度和与核酸扩增的良好兼容性，但通常需要专用的光学组件。基于比色的方法更为直接且成本低廉，特别适用于分散式或资源有限的设置，尽管其定量分辨率可能较低。基于拉曼的方法提供无标记和信息丰富的检测，但由于依赖于专用仪器，目前限制了其在即时检测中的广泛应用。基于显微镜的方法特别适用于通过直接观察细菌生长或形态进行快速表型AST，但其更广泛的实施取决于便携式成像和自动图像分析的进一步进展。
5. 挑战与展望从实际即时检测的角度来看，目前最有前景的应用涉及相对简单或临床可获得的样本矩阵，如尿液和其他低复杂性液体，这些样本的预处理要求有限。相比之下，在更复杂的样本中的实施仍然面临主要障碍，包括病原体分离、目标富集、基质干扰以及对外部仪器的依赖。因此，将微流控AMR平台转化为真正的即时检测工具不仅需要微型化芯片设计，还需要简化的样本到结果的工作流程、便携式读数系统、最少的手动步骤以及在非实验室条件下的稳健性能。近年来，微流控技术的快速发展显示了在各种场景中快速准确检测AMR的巨大潜力，从识别临床AMR病原体到ARGs筛查。尽管这些系统近年来很受欢迎，但它们仍难以满足即时检测（POCT）的标准[137]。因此，共同努力改进AMR的POCT至关重要。基于微流控的AMR检测系统的开发面临技术、临床和监管领域的多方面挑战。从技术上讲，临床样本的固有复杂性要求复杂的样本处理，同时保持设备的便携性。从临床角度来看，迫切需要弥合实验室性能和即时检测稳健性之间的差距。从监管角度来看，缺乏标准化的评估协议阻碍了其广泛采用。解决这些挑战可能包括开发更具成本效益和稳健性的传感器，提高检测能力的完整性和准确性，并增加这些设备在更广泛的医疗保健提供者和资源有限环境中的可用性和可访问性。
5.1. 集成样本预处理最近的研究表明，微流控能够集成样本预处理，从而快速检测临床样本中的低丰度AMR病原体[31]、[32]。然而，此类集成平台的开发仍然有限，并面临两个主要挑战。首先，临床样本复杂，需要一系列步骤来去除干扰物质并提取目标。将去除干扰物质的步骤转移到微流控芯片上需要复杂的设计或额外的流体系统，使得开发过程更具挑战性[138]。其次，为了检测临床样本中的低浓度病原体，需要引入预富集步骤，如膜过滤和磁珠捕获，这需要高精度的设计和制造[10]。克服这些挑战需要开发高效的靶标捕获方法和改进高精度芯片制造技术[28]。将采样集成到微流控芯片上为开发快速便携的即时检测提供了潜在的相关性。解决提高微流控技术可靠性和可用性的现有挑战对于实现这一潜力并使这些技术广泛应用于抗菌素耐药性（AMR）检测至关重要。5.2 便携式信号收集
一些当前的诊断方法受到对专用设备（包括显微镜和拉曼设备）依赖性的限制，特别是在资源有限的环境中。由于缺乏便携性，这些方法只能在实验室中使用，从而限制了微流控技术在实地应用中的实际应用。此外，所需设备的高成本也突显了财务上的限制。因此，需要开发出更易于获取的替代设备。Zhang等人[139]报道了一种便携式拉曼光谱仪，可用于无标记地现场检测沙门氏菌中的AMR。结果表明，基于拉曼光谱的AMR检测在资源有限的环境中具有潜在的应用价值。近年来，智能手机在比色和荧光检测中的应用越来越广泛[140]，为细菌样本中各种AMR标志物的检测提供了巨大潜力。这些设备的使用可以简化医疗工作者的诊断流程，减少培训需求，并使其在偏远地区更加普及。持续的研究和创新对于克服AMR挑战以及确保患者获得及时和适当的治疗至关重要。
5.3 多重检测
为了在临床环境中做出明智的抗生素使用决策，微流控系统应提高同时筛查不同AMR生物标志物的多重检测能力[68]、[77]。将芯片划分为多个独立腔室以进行不同反应是最常见的实现多重检测的策略[141]、[142]、[143]。在这些设计中，不同的腔室可以预先装载不同的抗生素、浓度或目标特异性反应混合物，从而可以在单个芯片上并行分析多种测试条件。尽管能够同时检测多个目标，但这些设计受到反应腔室数量的限制，无法满足大规模检测的需求。在这种情况下，液滴微流控技术作为一种有前景的解决方案出现，它通过在微流控系统内生成和操控样品及试剂液滴来执行多种反应。SCALe-AST平台利用皮克级液滴微流控技术同时评估32种抗生素条件，通过液滴簇之间的物理屏障保持<2%的组间串扰。通过对每种抗生素浓度约10,000个液滴的高通量统计分析，该系统实现了单细菌分辨率，从而准确测量生长抑制效果[61]。这种基于液滴的设计使每个液滴簇都能作为一个独立的微反应器，从而大大提高了检测通量，同时减少了试剂消耗并最小化了不同测试条件之间的交叉污染。通过快速提供高精度结果，这些创新的微流控方法可以作为传统AST平台的有效、省时且准确的替代方案，最终有利于患者护理和治疗决策。最近的研究进一步扩展了液滴微流控技术在AST中的应用范围，不仅限于简单的反应分隔。通过将单个细菌或小群体分离成独立的液滴，这些系统能够高效筛查多种抗生素浓度和条件，同时减少串扰和试剂消耗。更近期的研究将基于液滴的培养技术与自动化光学读数和数据分析相结合，进一步提高了检测通量，并支持单细胞水平的多重表型AST[144]。
5.4 过程自动化
微流控自动化的最新进展通过集成样品到结果的系统改变了AMR检测方式，这些系统将样品制备、扩增和检测结合在一个试剂盒中完成。虽然目前的离心LabDisk®系统在基因定量方面的变异系数低于5%[145]，但仍存在一些关键限制，如试剂保质期短（室温下<6个月）、多重检测能力有限（每次运行<10个目标）以及粘稠样品导致的假阴性率较高。新兴解决方案采用人工智能（AI）驱动的质量控制[146]和自供电平台（操作时间<15分钟）[147]，可能会改变这一领域。实现这些进展需要微流控工程师、临床微生物学家和数据科学家之间的紧密合作，以平衡技术可行性和诊断需求。
尽管已经报道了许多用于AMR检测的微流控系统，但只有少数系统在真实临床样本条件下经过了验证。这一限制在即时检测（POCT）背景下尤为明显。许多报道的平台仍然基于培养的细菌或简化的样本模型，而不是复杂的临床样本。实际上，真正的即时AMR诊断仍然具有挑战性，因为通常还需要病原体分离、目标富集和干扰去除。目前，更现实的短期应用可能仅限于相对容易获取的样本类型，如尿液、某些无菌液体和选定的血液样本。因此，在这些系统从有前景的实验室原型发展成为实用的诊断工具之前，广泛的临床验证、标准化性能评估、制造可重复性和法规合规性是必不可少的。将这些平台扩展到更广泛的“同一健康”（One Health）应用将更具挑战性，尤其是在处理异质非临床样本（如动物粪便、牛奶、肉类产品、废水和地表水）时。与相对容易获取的临床样本相比，这些样本通常含有更复杂的背景微生物、悬浮固体和扩增抑制剂，对样品预处理和检测稳健性提出了更高的要求。因此，如果微流控AMR系统要为兽医医学、食品安全和环境监测的集成监测做出贡献，未来的发展将需要更有效的病原体富集、抑制剂去除、与样本兼容的提取策略以及在真实非临床样本中的验证。尽管这些应用仍处于初步阶段，但它们代表了将微流控技术从诊断工具扩展到更广泛的“同一健康”AMR监测的重要方向。
6. 结论
开发成本效益高、快速且用户友好的微流控技术对于实现“同一健康”下的AMR即时检测至关重要，以补充复杂的传统方法。微流控设计和尖端检测策略的最新进展促进了微流控AMR检测的发展，并为资源有限环境下的即时检测提供了巨大潜力。在这篇综述中，我们系统地总结了微流控AMR检测的最新进展及其在即时检测应用中的未来前景，这将有助于克服现有限制并推动创新。随着技术和流程创新的不断进步，基于微流控的AMR即时检测有望改变我们使用抗菌剂的方式，最终减少不必要的使用，缓解抗生素耐药性，并延长现有抗生素的寿命。未来微流控技术的发展可能会集中在更加集成化的样品到结果系统、便携式和低成本的信号读数、改进的多重检测能力以及分析工作流程的自动化方面。此外，AI辅助的数据解释、可扩展的制造和临床验证的进步对于将有前景的实验室原型转化为可靠的即时检测工具也非常重要。在这些领域的持续进展可能会加速微流控平台在分散式和资源有限环境中的部署[148]、[149]。进一步的研究和开发对于充分发挥基于微流控的AMR检测和管理的潜力至关重要，特别是在人类-动物-环境界面方面。
**CRediT作者贡献声明**
Xu Wang：方法学
Min Chen：研究
Hui Li：研究
Xiaokui Guo：资源、方法学
Chenxi Wang：撰写——初稿、方法学
Jun Feng：资源
Kun Yin：监督、研究、概念化
Qinqin Hu：方法学
Chenjia Zhou：撰写——初稿、方法学
Leshan Xiu：撰写——初稿、监督、方法学
