索马桑达尔·阿鲁穆加姆（Somasundar Arumugam）|凯伦·里哈尼（Karen Rihani）|维格内什·文卡特斯瓦兰（Vignesh Venkateswaran）|吉野裕介（Yusuke Shiota）|德瓦塞纳·蒂亚加拉詹（Devasena Thiagarajan）|比尔·S·汉森（Bill S. Hansson）|马库斯·克纳登（Markus Knaden）|西尔克·萨克塞（Silke Sachse）
德国马克斯·普朗克下一代化学生态学中心（nGICE）
**摘要**
臭氧水平的上升对昆虫的生态平衡和生物多样性构成了重大威胁。先前的研究表明，高浓度的臭氧会干扰挥发性有机化合物（VOCs），从而影响昆虫的觅食和交配行为。然而，关于臭氧如何影响昆虫的适应性、嗅觉行为和生理机能的综合性研究仍然有限。为填补这一空白，我们将黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）暴露在类似于受污染城市环境中的臭氧浓度下四天。随后，我们评估了这些果蝇的总体适应性以及它们对气味的神经和行为反应。虽然果蝇的总体适应性没有明显变化，但我们观察到臭氧暴露改变了它们的嗅觉行为：果蝇对特定吸引性气味和复杂气味的反应显著减弱，而对排斥性气味的厌恶感增强。为了探究其背后的神经生理机制，我们采用了功能成像和电生理实验来监测嗅觉感觉神经元中的气味反应，发现神经元处理过程发生了细微变化。此外，RNA测序显示臭氧暴露引发了感觉组织和大脑中的转录变化，这些变化与应激适应反应一致。这些发现共同揭示了空气污染物如何影响昆虫的嗅觉感知和行为，为大气污染的更广泛生态后果提供了新的见解，并为未来的研究开辟了方向。
**1. 引言**
由于各种人类活动，近年来空气污染达到了令人担忧的程度（Vingarzan, 2004）。在这些污染物中，臭氧已成为一种重要的人为污染物，其大气浓度近年来显著增加（Yeung et al., 2019）。对流层臭氧是一种强氧化性污染物，由于它与植物、动物和人类的直接相互作用，被认为对生物体具有潜在危害（Agathokleous et al., 2020）。研究表明，暴露于臭氧这种空气污染物会对人类健康造成有害影响。长期暴露于臭氧可通过自由基机制导致肺部毒性，从而引发长期健康风险（Graham et al., 1998; Radbel et al., 2024）。即使在植物和动物中，短期暴露于臭氧也会破坏植物间（Girón-Calva et al., 2016）、植物-昆虫（Farré-Armengol et al., 2016; Cook et al., 2020; Masui et al., 2021）以及昆虫-昆虫之间的相互作用（Jiang et al., 2023; Jiang et al., 2024）。
臭氧容易氧化含有碳-碳双键的挥发性物质，从而破坏许多花香。这一过程会显著降低传粉昆虫的觅食效率，进而干扰昆虫与植物的相互作用（Fuentes et al., 2013; Girling et al., 2013; Li et al., 2016; Ryalls et al., 2022; Langford et al., 2023; Dubuisson et al., 2024）。除了分解花香外，臭氧还会分解昆虫信息素（这些信息素通常也含有碳-碳双键），从而干扰昆虫的性通讯（Jiang et al., 2023; Jiang et al., 2024）。除了因臭氧降解而减少信息化学物质外，昆虫还面临分解产物的增加。例如，许多常见生物源性和与嗅觉相关的信息素的氧化副产物已被证明会影响黑腹果蝇的嗅觉选择行为（Venkateswaran et al., 2023）。除了通过氧化信息素干扰气味介导的通讯外，对昆虫的研究还表明，臭氧会直接产生生理效应，引发氧化应激并损害整体生理性能（Démares et al., 2024; Telesnicki et al., 2015）。然而，对粉虱的研究揭示了相反的结果：臭氧暴露反而增强了其适应性和繁殖能力，这表明存在复杂的、物种特异性的反应（Hong et al., 2016）。
在这里，我们研究了臭氧对黑腹果蝇适应性参数以及生理和行为反应的潜在影响。我们将果蝇暴露在200 ppb（十亿分之一）的臭氧浓度下数天，这一浓度反映了受污染城市环境中的实际水平（Kleinman et al., 2005; Wang et al., 2017）。臭氧浓度通常会在夜间波动并降低，而我们的实验条件则是一个简化和恒定的环境。最初，我们评估了多种适应性参数，包括寿命、繁殖力和活动性，以确定臭氧暴露对果蝇生命周期特征的影响。这些实验提供了关于臭氧对果蝇健康和存活能力的群体层面影响的见解。此外，我们的研究还扩展到了臭氧暴露与果蝇嗅觉之间的关系。尽管对大黄蜂、黄蜂和蜜蜂的研究表明臭氧暴露后嗅觉行为发生了显著变化（Vanderplanck et al., 2021; Démares et al., 2022），但臭氧对果蝇嗅觉系统的直接影响仍不清楚。为了进一步探讨这一方面，我们使用简单的T型迷宫进行了行为测试，比较了臭氧暴露组与对照组果蝇对单个化合物和生态相关混合物的嗅觉偏好，以了解臭氧暴露可能如何影响果蝇的嗅觉。通过使用电触角图记录（EAG）和功能成像等技术，我们研究了臭氧暴露对气味的外周神经元反应以及大脑第一个嗅觉处理中心——触角叶中的球状细胞活动的影响。最后，我们通过评估臭氧暴露果蝇的学习能力，并分析大脑和嗅觉器官的转录组，来确定臭氧暴露是否引发了转录变化。
**2. 方法**
**2.1. 臭氧制备和暴露**
臭氧的制备方法如（Jiang et al., 2023）所述（补充图S1）。简而言之，臭氧发生器通过向空气中提取的氧气施加电放电来产生臭氧，然后通过特氟龙管将其输送到混合室。使用清洁的加湿空气（相对湿度75%）将臭氧稀释，最终在100升的有机玻璃室中达到200 ppb的浓度。稀释后的臭氧被输送到流量计，以0.2升/分钟的流速注入装有果蝇的5升玻璃瓶中（称为臭氧暴露组果蝇）。同时，作为对照组的纯空气经过臭氧净化后，也被输送到另一个装有果蝇和果蝇食物的5升玻璃瓶中（称为对照组果蝇）。在整个实验过程中，果蝇被维持在含有1.5%（w/v）琼脂和10%（w/v）蔗糖的固定饮食中。实验开始时提供食物，但在四天的暴露期间不再更换或移动食物。臭氧浓度通过集成BMT臭氧传感器（BMT 932, BMT Messtechnik GmbH, Germany）进行连续监测。有关臭氧制备的更多细节，请参见补充材料。所有实验中使用了约200只1天大的黑腹果蝇（Canton-S品系，CS）。果蝇在12小时光照和12小时黑暗的恒定光周期条件下暴露于臭氧环境中四天，相对湿度保持在75%。后续分析和比较在相同的控制湿度条件下进行。
**2.2. 适应性实验**
为了研究臭氧暴露是否影响果蝇的不同适应性参数，我们进行了多组实验：
1) **寿命（无食物）**：暴露于高浓度臭氧或对照空气四天后，将果蝇放入70毫升的试管中。每个试管内含有100微升蒸馏水，但不提供食物。每个试管中装有10只同性果蝇。在两种实验条件下（臭氧暴露组和对照组）各设置了10个重复试管。每隔3小时监测一次死亡率。试管内的湿润纸巾每24小时更换一次。持续监测直到实验中最后一只果蝇死亡。
2) **寿命（有食物）**：实验方案与饥饿评估类似，不同之处在于每个试管中含有25毫升玉米粉培养基作为食物。由于有食物的情况下寿命延长，死亡率大约每隔一天记录一次。为了在整个生命周期内持续提供营养，果蝇每周更换一次试管。持续监测直到实验中最后一只果蝇死亡。
3) **繁殖力**：通过计算用于寿命实验的雌性果蝇的后代数量来计算繁殖力。在将雌性果蝇转移到新的试管进行寿命评估时，之前使用的旧试管被放置在果蝇培养箱中十天，让其中的卵孵化发育。随后统计从这些试管中出现的成年果蝇总数，并计算每只雌性产生的后代数量。具体来说，繁殖力是通过将每个试管中出现的成年后代数量除以产生后代的母体果蝇数量来确定的。
4) **活动性监测**：使用DAM（Drosophila Activity Monitor）系统（DAMS, TriKinetics Inc., Waltham, MA USA）量化果蝇的运动活动。该系统由多个板组成，每个板上装有32个单独的槽位。每个槽位中放置一根玻璃管，一端装有少量果蝇食物，另一端用带孔的盖子封闭以防止果蝇逃跑，同时允许气体交换。总共放置了16只雌性和16只雄性果蝇在指定的槽位中。臭氧暴露组和对照组各使用两个板，共计64只果蝇（32只臭氧暴露组和32只对照组果蝇）。整个DAM系统置于培养箱中，保持12小时光照和12小时黑暗的恒定光周期，相对湿度为75%，温度为25°C。在8天内持续监测果蝇的运动行为，数据采集和存储由该公司提供的DAMSystem3数据收集软件完成。实验开始当天及随后第一天在培养箱内的数据被排除在外，仅分析随后连续五天的数据。计算这5天内每只果蝇的平均活动水平。
**2.3. 嗅觉偏好测试**
在1天饥饿期后，进行嗅觉偏好测试，随后是4天的臭氧暴露。T型迷宫的各臂连接到装有圆形滤纸的Eppendorf管上。每个嗅觉臂的滤纸上浸有3微升溶剂中的气味物质（详见表S1），另一侧则含有相应的溶剂。30只雌性果蝇在冷诱导麻醉后被放入T型迷宫的下臂，并立即用棉塞密封。40分钟后，通过计算迷宫两端果蝇的数量来计算偏好指数。单一气味物质溶解在10^-2或10^-1的矿物油中。我们测试了天然吸引性气味（如乙酸乙酯和香醋）和天然排斥性气味（如苯甲醛和乙酰苯酮）。食物提取物（意大利Supergarden制造的香蕉、猕猴桃和诺尼果的冻干粉末）溶解在水中，浓度为10%（即1克溶于10毫升水中）。这些食物提取物对果蝇具有天然吸引力。偏好指数通过公式（O – C）/T计算，其中'O'表示气味臂中的果蝇数量，'C'表示对照臂（矿物油）中的果蝇数量，'T'表示每次实验中使用的总果蝇数量。**电触角图记录**
电触角图（EAG）记录是在年轻雌性果蝇（4-5天大）暴露于臭氧或对照条件4天后进行的。将适当长度的银电极插入装有Ringer溶液（NaCl（130 mM）、KCl（5 mM）、MgCl2（2 mM）、CaCl2（2 mM）、蔗糖（36 mM）和HEPES-NaOH（pH 7.3，5 mM）的玻璃微电极中。处理昆虫时确保其双眼和触角可被电极接触。为了防止触角移动，将其固定以保持实验过程中的稳定性。建立了接地电极、触角和参比电极之间的良好接触，其中接地电极连接到眼睛，记录电极连接到触角。在获得稳定的基线信号后，向动物释放气味。
**嗅觉刺激**
通过直径为1毫米的Pasteur移液管以0.5 L/min的恒定气流进行嗅觉刺激，移液管末端距离触角1厘米。每次试验前，将新鲜制备的10 μL稀释气味溶液（详见表S1）与己烷混合后涂抹在1平方厘米的Whatman滤纸上，并将其插入玻璃Pasteur移液管中。气味释放时间为0.5秒。信号经过低通滤波（0.1 Hz至300 Hz）。EAG信号通过USB-Universal Serial Bus-Intelligent Data Acquisition Controller（IDAC）预放大（10倍）。随后使用AutoSpike软件（版本3.7，Syntech）对信号进行可视化、记录和分析。
**钙成像**
钙成像实验使用Orco>GCaMP6f果蝇进行。通过将Orco-GAL4品系与UAS-GCaMP品系杂交，获得了所有Orco+球状体均标记有GCaMP的子代果蝇，以便进行成像。所有实验均使用雌性果蝇，以确保与嗅觉行为实验的一致性。使用雌性果蝇的另一个好处是它们的体型较大，便于解剖和成像大脑的AL区域。首先将果蝇固定在冰上，然后用铜板（Athene Grids，Plano）将其固定在定制的Plexiglas载物台上（Strutz等人，2012年）。使用针固定口器，再用Protemp II粘合剂（3M ESPE）将头部牢固地固定在载物台上。此外，用细金属丝轻轻将触角向前伸展。在果蝇头部放置一个带有圆形孔的塑料盖玻片。为防止Ringer溶液泄漏到触角上，在圆形窗口周围涂覆了双组分硅材料（World Precision Instruments）。在Ringer溶液下方、果蝇眼睛和单眼之间创建一个小孔，以便施加Ringer溶液。最后，为了提高触角叶的可见度并减少光散射，仔细清理了脂肪、气管和气囊。
钙成像实验使用TillPhotonics成像系统（TILL imago，http://www.till-photonics.com）进行，该系统配备了一个安装在荧光显微镜（BX51WI，http://www.olympus.com）上的CCD相机（PCO imaging，http://www.pco.de）。使用20倍水浸物镜（NA 0.95，XLUM Plan FI，http://www.olympus.com）进行钙成像。根据Strutz等人（2012年）的方法，使用475纳米的波长激发样本。仔细选择特定焦平面以识别触角叶上层的多个Orco+球状体。
**气味施加**
将10 μL的气味剂（详见表S1）用矿物油稀释至10^-1或10^-2浓度，然后通过玻璃Pasteur移液管滴到滤纸上。在钙成像中使用这些浓度，因为这些浓度已在行为实验中测试过。通过Stimulus Controller CS-55（Syntech）控制气味剂的释放。为了将气流导向果蝇的触角，使用了一个装有不锈钢管的定制金属载物台。该设置可实现1 L/min的连续气流，并伴有0.5 L/min的间歇性气味脉冲。气味脉冲的引入有2秒的延迟，持续时间为2秒。在成像过程中，数据以4 Hz的频率记录，共记录40帧，相当于10秒的时间。
**嗅觉学习范式**
我们使用了一个定制的差分嗅觉学习装置，包括T型迷宫（如图所示）。大约40-60只暴露于臭氧或对照组的雌雄果蝇在实验中接受了气味训练。训练和测试阶段在黑暗中进行，T型迷宫连接到流量计（Flow sensors，FESTO）以确保气味流的恒定。气味以0.35 L/min的流速释放，在释放前通过蒸馏水瓶进行加湿。气味以2秒的脉冲形式呈现，每个脉冲后跟随2秒的加湿空气。有关气味释放和标准化的更详细协议，请参考Thiagarajan等人（2022年）的研究。我们使用了溶解在石蜡油中的乙酰丙酮（AAC）和乙基丁酸酯（ETB）（1% v/v）。铜管连接到电击发生器，施加90 V的电击（15次脉冲），持续1分钟。气味脉冲和电击在整个实验过程中通过LOGO Direct Digital Control（DDC - Siemens LOGO，德国慕尼黑）同步。气味脉冲由快速电磁阀（Festo – Esslingen，德国）控制，并通过特氟龙管释放。
**偏好指数计算**
偏好指数使用以下公式计算：[(# CS+果蝇 – (# CS-果蝇)] / [(# CS+果蝇 + (# CS-果蝇)]。T型迷宫包含铜网衬里的管道，在训练和测试阶段均使用该迷宫以保持一致的实验环境。为了确定固有的气味偏好，在没有光照的情况下，所有训练和测试程序均在25°C和70%相对湿度下进行。使用红光（>720 nm，即果蝇看不见的光）在实验场内操作果蝇。
**RNA提取和测序**
收集暴露于臭氧和对照组的雌性果蝇，将它们放入50 mL的Falcon管中，并立即在液氮中快速冷冻5分钟。随后剧烈摇晃（涡旋）15秒，重复2-3次。为防止解冻时RNA降解，向Falcon管中加入预冷的（-20°C）100%丙酮。通过逐渐密集的网筛过滤丙酮混合物以分离触角和上颚须，同时收集剩余的头部。解剖头部以提取大脑，并将其收集在Eppendorf管中。通过6000 rpm离心3-5分钟去除触角、上颚须和大脑中的丙酮。组织在含有珠子的试管中用0.6 mL Trizol匀浆20分钟，然后在4°C下以12,000 rcf离心10分钟。收集上清液，并在冰上与72 μL 1-Br-3-Cl-propan一起孵育15-20分钟。之后，以10,000 rcf在4°C下离心15分钟。整个上清液用DNAse处理并在37°C下孵育30分钟。向混合物中加入0.6 mL TRIZOL和72 μL 1-Br-3-Cl-propan，并剧烈摇晃。在冰上孵育20分钟后，以10,000 rcf在4°C下离心15分钟。收集全部上清液，并在-20°C下用（0.3–0.5 mL）100%异丙醇过夜孵育。然后以14,000 rcf在4°C下离心15分钟。去除上清液，用室温下的0.8 mL冰冷乙醇洗涤沉淀物。通过7500 rcf在4°C下离心10分钟去除乙醇。沉淀物在通风橱中空气干燥10分钟，随后重新悬浮在25 μL RNA储存溶液中。使用Nanodrop和凝胶电泳分别测量和验证RNA的浓度和质量。RNA样本储存在-80°C。为考虑生物学变异性，RNA提取进行了三次生物学重复实验，每次重复使用约100只果蝇。标准RNA测序由AZENTA生命科学公司完成。
**数据质量控制**
在分析原始数据后，使用Trimmomatic v.0.36修剪可能的接头序列和质量较差的核苷酸。使用STAR aligner v.2.5.2b将修剪后的读段映射到ENSEMBL上的参考基因组。STAR aligner使用剪接接头来检测剪接位点并帮助对齐整个读段序列。由此生成BAM文件。使用Subread package v.1.5.2计算独特基因的 hit计数。仅计算位于外显子区域的独特读段。此过程在脑中识别出大约10,378个基因，在触角中识别出10,595个基因。提取基因 hit计数后，使用这些计数表进行下游差异表达分析。使用DESeq2比较不同样本组之间的基因表达。Wald检验用于生成p值和对数2倍变化（Log2 fold changes）。
**基因集富集分析（GSEA）**
使用排名基因列表进行基因集富集分析（GSEA），以检测超出单基因显著性的协调转录变化。生成两种排名策略以评估稳健性：（1）按对数2倍变化排名；（2）方向显著性得分，计算公式为：得分 = 符号（log2FC）×（-log10(p值)），以结合表达方向和统计支持。原始p值仅用于排名，不用于统计推断。排除缺失或非有限值的基因，并删除重复条目。使用WebGestalt（Zhang等人，2005）分析排名列表，以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的基因符号作为标识符。评估京都基因组百科全书（KEGG）通路和基因本体生物学过程（GO:BP）术语的富集情况。使用假发现率（FDR）评估显著性，FDR ≤ 0.05被视为显著。为了确保可靠性，优先考虑在两种排名策略中都富集的通路。对于关键通路，检查前沿基因以确认表达方向和生物学相关性。
**统计分析**
统计分析和初步图表使用GraphPad Prism v. 9（GraphPad Software，美国）进行。随后使用Adobe Illustrator CS处理图表。在R中使用Kaplan-Meier生存分析分析寿命数据，并使用log-rank（Mantel–Cox）检验评估暴露于臭氧和对照组之间的差异。使用负二项广义线性模型分析繁殖力（后代数量），以处理、时间（作为分类因素）及其交互作用作为预测因子。每个时间间隔的活雌性数量作为log偏移量，以考虑组间大小的变化。使用似然比检验评估模型术语，并使用估计的边际均值进行事后比较。为了比较两个独立组（对照组与暴露于臭氧的果蝇）在行为测试、活动监测、嗅觉偏好测试、电触角图（EAG）记录、钙成像反应和学习表现方面的差异，我们首先使用Shapiro-Wilk检验来评估数据是否呈正态分布。对于正态分布的数据，我们使用非配对双尾t检验来比较两组；而对于非正态分布的数据，则使用Mann-Whitney U检验。每种分析使用的具体统计检验方法在相应的图例中有所说明。
3. 结果
3.1. 暴露于臭氧后醋酸果蝇寿命的性别差异
我们首先研究了臭氧暴露对果蝇各种适应性参数的影响。在4天的臭氧处理期间，我们观察了果蝇在有食物和无食物的条件下的寿命（图1A）。在没有食物的情况下，两种性别的存活时间没有明显差异（图1B）。然而，在有食物的情况下，暴露于臭氧的雌性果蝇的存活时间显著缩短（图1C）。在雄性果蝇中，虽然没有检测到统计学上的显著效应，但在相同条件下存活时间有所增加。为了分析观察到的雌性存活率性别差异是否会影响繁殖能力，我们量化了臭氧处理后的繁殖率（图1D, E）。繁殖力随时间显著变化（似然比检验，p < 0.001），反映了实验期间的繁殖输出变化。然而，处理效应不显著（p > 0.05），处理与时间的交互作用也不显著（p > 0.05）。这些结果表明，臭氧暴露并未显著影响总体繁殖力或其时间模式（表S2、S3和S4）。此外，我们还使用活动监测器跟踪了单个果蝇的日常活动，以研究臭氧是否影响其一般运动能力（图1F, G）。然而，我们发现不同处理条件下的活动水平没有显著差异。这些结果表明，尽管臭氧暴露会适度缩短雌性果蝇的寿命，但它既不影响繁殖力也不影响运动能力。
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图1. 臭氧暴露影响雌性果蝇的存活率。(A) 示意图展示了在4天200 ppb臭氧暴露后，有食物和无食物情况下监测果蝇存活率的实验方案。(B) 无食物条件下对照组和臭氧处理组的存活曲线。(C) 有食物条件下对照组和臭氧处理组的存活曲线。使用对数秩检验比较对照组和臭氧处理组之间的统计差异。(D) 示意图展示了在两种处理条件下监测繁殖率的实验方案。(E) 暴露于对照组和臭氧处理组后，每只雌性果蝇的产卵量随时间的变化。使用负二项广义线性模型比较对照组和臭氧处理组。(F) 示意图展示了监测单个果蝇日常活动的实验设置。(G) 盒形图表示两种处理条件下每只果蝇的平均每日计数。使用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。对于正态分布的数据，使用非配对双尾t检验比较组间差异；对于非正态分布的数据，使用Mann-Whitney U检验（‘ns’表示无显著差异）。
3.2. 臭氧暴露增加了对厌恶气味的排斥反应，并降低了对吸引气味的反应
接下来，我们研究了臭氧暴露是否会影响果蝇的气味感知，进而影响其嗅觉引导的行为。T迷宫实验用于测试果蝇对单独和复杂气味的偏好，这些果蝇之前分别暴露于高浓度臭氧或对照空气中4天（图2A）。值得注意的是，我们观察到，像苯甲醛和乙酰苯酮这样的天生厌恶气味，在暴露于臭氧的果蝇中表现出更强的厌恶反应，而对照组则没有这种效应。这种效应仅在高浓度气味（即10^-1）下出现，而在低浓度气味（10^-2）下没有显著差异（图2B）。除了影响对厌恶气味的反应外，臭氧暴露还影响了果蝇对食物气味乙酸乙酯的吸引力，暴露于臭氧的果蝇在高浓度（10^-2）下对乙酸乙酯的吸引力降低（图2B）。当测试更接近现实情况的复杂混合物时，果蝇更可能遇到来自不同来源的气味混合物，而不是单一气味，我们发现香醋对暴露于臭氧的果蝇的吸引力低于对照组果蝇。有趣的是，在其他测试混合物中，暴露于臭氧的果蝇和对照组果蝇之间没有显著差异（图2C）。这些结果表明，长期暴露于臭氧会对某些气味产生特定影响，并改变对某些气味的反应，但不是所有气味。
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图2. 臭氧暴露影响对单个气味和复杂混合物的嗅觉行为偏好。(A) 示意图展示了臭氧暴露和用于确定先天偏好的嗅觉实验方案。1天大的雌性果蝇分别暴露于臭氧（200 ppb）或空气中4天，然后每组30只果蝇被分组并禁食24小时。使用T迷宫评估两组果蝇的嗅觉偏好，每组果蝇在40分钟内对一种气味及其相应溶剂（水或矿物油）进行二选一的选择。(B) 盒形图表示果蝇对单一气味（如乙酰苯酮（10^-2,10^-1）、苯甲醛（10^-2,10^-1）和乙酸乙酯（10^-2）的偏好指数。(C) 盒形图表示果蝇对复杂混合物（如香醋（10^-3,10^-2）、香蕉提取物、猕猴桃提取物和诺丽提取物）的偏好指数。箱形图表示中位数（箱内水平线）、四分位数范围（箱的高度，50%的数据在此范围内）以及每个实验组四分位数的1.5倍的最小值和最大值（须状部分），超出须状部分的数据为异常值。点表示单个果蝇的数据。使用单样本t检验比较组均值与假设均值。所有数据使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。对于正态分布的数据，使用非配对双尾t检验比较组间差异；对于非正态分布的数据，使用Mann-Whitney U检验（‘ns’表示无显著差异，*表示p < 0.05）。
3.3. 臭氧暴露影响对特定气味的神经元反应
接下来，我们探讨了臭氧暴露对气味引导行为的影响是否是由于在感觉层面气味检测的变化所致。因此，我们首先使用电触角图（EAG）记录来检测果蝇触角对气味的检测能力。EAG记录在暴露后立即进行，以及在恢复1天后进行（见补充材料）。在行为实验中使用的相同气味在浓度10^-1和10^-2下进行了测试（图3A）。无论是在暴露后（图3B）还是恢复1天后（补充图S2），任何气味的EAG记录中都没有观察到处理组间的显著差异。虽然我们观察到臭氧暴露后对个别气味的明显行为变化，但EAG结果仅显示臭氧暴露的果蝇反应总体减弱；然而，只有香醋显示出统计学上的显著差异。EAG记录中的轻微效应可能是由于技术的灵敏度较低和样本量较小，这表明臭氧可能引起了一些细微的、特定球状结构的改变，而这种技术无法检测到。因此，我们接下来进行了功能性钙成像实验，以研究观察到的行为变化是否与这些气味在第一个嗅觉处理层次——触角叶的神经元反应变化有关。在这里，我们使用GAL4-UAS系统在雌性果蝇的触角叶中可视化气味诱导的活动模式，以驱动基因编码的钙传感器GCaMP6f的选择性表达。先前的研究在黑腹果蝇中表明，特定球状结构的活性与行为吸引或厌恶相关（Knaden等人，2012年）。功能性成像显示，在10^-1浓度下，臭氧暴露的果蝇中DL1和D球状结构的活性显著降低（这两个球状结构都参与编码厌恶气味）。在10^-1浓度下，苯甲醛也观察到类似的趋势，尽管不显著。此外，我们还检查了DM1、DM2和VA2球状结构对乙酸乙酯和香醋的激活情况，这些球状结构通常会被吸引性气味激活。虽然臭氧暴露的果蝇与对照组相比活性总体降低，但差异不显著。DM1、DM2和VA2的轻微降低与之前描述的对这些吸引性气味的反应减弱一致（图2B和C），而DL1和D的降低与观察到的对这种厌恶气味的增强反应不一致。
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图3. 臭氧暴露和对照组果蝇中嗅觉感觉神经元的气味诱导反应。(A) 示意图展示了臭氧暴露、电触角图（EAG）记录和钙成像的实验方案。1天大的雌性果蝇分别暴露于臭氧（200 ppb）或空气中4天。暴露后，记录并比较了果蝇的电生理反应。使用Orco-GcaMP6f果蝇进行了类似的程序，以测量暴露后的嗅觉感觉神经元的钙反应。(B) 盒形图表示对照组和臭氧暴露果蝇对厌恶气味（乙酰苯酮10^-1、苯甲醛10^-1）和吸引性气味（乙酸乙酯10^-2）的EAG反应幅度。(C) 热图显示了臭氧暴露果蝇和对照组之间钙反应的计算差异。(D) 条形图表示臭氧暴露果蝇和对照组对厌恶气味（苯甲醛、乙酰苯酮）的钙反应。(E) 条形图表示臭氧暴露果蝇和对照组对吸引性气味（香醋和乙酸乙酯）的钙反应。所有数据使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。对于正态分布的数据，使用非配对双尾t检验比较组间差异；对于非正态分布的数据，使用Mann-Whitney U检验（*表示p < 0.05，**表示p < 0.01）。误差条显示标准差。
3.4. 臭氧暴露不影响学习表现
鉴于臭氧暴露对触角叶层面的气味处理以及气味引导行为的影响，我们假设更高层次的大脑回路（如蘑菇体）也可能受到臭氧的影响。由于蘑菇体是果蝇的学习和记忆中心，我们使用经典的厌恶学习范式评估了臭氧暴露和对照组果蝇的学习能力。我们改进和修改了传统的Tully T迷宫（Tully和Quinn，1985年），训练果蝇将特定气味（乙酰丙酮醋酸酯（AAC）或乙基丁酸酯（ETB）与电击（无条件刺激，US）这种负面强化联系起来。在训练阶段，一组果蝇在同时接受电击刺激的同时暴露于一种气味（称为CS+）。随后，给予第二种气味而不提供任何强化（CS-）。在随后的测试阶段，我们通过让果蝇在两种气味（CS+和CS-）之间进行选择来评估它们的偏好（图4A和B）。
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图4. 学习表现不受臭氧暴露的影响。(A) 示意图展示了臭氧暴露后使用厌恶差异条件进行的嗅觉学习实验。(B) 使用两种气味乙酰丙酮醋酸酯（AAC）和乙基丁酸酯（ETB）（浓度为10^-2）进行差异厌恶条件训练的方案。来自两种处理的果蝇分别被放置在含有气味A（AAC或ETB）的臂中，并同时接受电击刺激（CS+）。1分钟后，相同的果蝇再次暴露于气味B（ETB或AAC）而不接受任何强化（CS-）。在这种训练程序之后，通过让果蝇在两种气味之间进行选择来评估它们的学习表现。(C) 条形图表示果蝇对AAC和ETB的先天和习得行为的偏好指数。数据使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。对于正态分布的数据，使用非配对双尾t检验比较组间差异；对于非正态分布的数据，使用Mann-Whitney U检验（*表示p < 0.05，**表示p < 0.01）。误差条显示了标准差（STDEV）。由于两种气味ETB和AAC的浓度在实验前已经进行了标准化处理，以消除任何固有的偏差，我们首先测试了这种相同的偏好是否在暴露于臭氧的果蝇中受到影响。我们发现，臭氧暴露并未影响果蝇对这两种气味的先天偏好（图4C）。当果蝇在训练阶段被训练将ETB或AAC气味与电击联系起来后，它们随后表现出对CS+气味的强烈厌恶，并将偏好转向CS-气味臂（图4C），无论它们之前是否暴露于臭氧。因此，这些结果表明，臭氧暴露不会影响果蝇在厌恶性联想学习范式中的学习能力。
3.5. 臭氧暴露会诱导嗅觉和脑组织中的通路级转录组变化
我们进行了转录组分析，以研究臭氧暴露如何调节基因表达。在臭氧暴露四天后，我们解剖了大脑和主要嗅觉器官（触角和上颚须），然后提取RNA并进行了标准RNA测序（图5A）。选择这些组织是因为在臭氧处理后观察到嗅觉检测和神经元处理方面的生理变化。使用基因间差异表达方法进行的初步计算评估得到的显著结果有限，这表明臭氧的影响可能是通过微妙的、协调的变化来体现的，而不是个别转录本的巨大变化。因此，我们转向了通路级分析，以捕捉这些综合的生物学信号。
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图5. 臭氧暴露后嗅觉和脑组织中的通路级转录组变化。(A) 一个示意图，概述了臭氧处理后从大脑和嗅觉器官中提取和测序RNA的实验程序。(B, C) 使用两个独立指标（log₂倍数变化和有符号的−log₁₀ p值）对基因列表进行GSEA分析。在两种排名中都显示出的通路在KEGG分析中具有一致的富集方向。条形图表示(B)嗅觉器官（触角和上颚须)和(C)大脑中顶级通路的标准化富集分数（NES）。正NES表示在臭氧条件下表达较高的基因之间的相对富集，而负NES表示表达较低的基因之间的相对富集。条形图颜色表示经过多重检验校正后的统计显著性（FDR ≤ 0.05，青色；FDR > 0.05，红色）。
在嗅觉器官的转录组中，几个通路在两种排名中都显示出一致的阳性富集（图5B）。这些通路包括光转导和寿命调节通路，在多重检验校正后仍然显著（FDR ≤ 0.05）。进一步检查这些通路中的转录变化发现，Arrestin 2 (Arr2)和几种热休克蛋白（Hsp70Ab, Hsp70Ba, Hsp26, Hsp27）以及应激传感器（Aft6, Thor）显著上调。与细胞蛋白质稳态和处理相关的其他通路，包括蛋白酶体、内质网中的蛋白质处理、囊泡运输中的SNARE相互作用以及细胞色素P450的外源物质代谢也显示出一致的富集，但没有达到FDR阈值。几个代谢通路，包括碳代谢、淀粉和蔗糖代谢，显示出负富集，但没有统计显著性。
在脑数据集中，剪接体是唯一一个在多重检验校正后显示出显著富集的通路（图5C）。其他通路，包括核糖体、氧化磷酸化和糖胺聚糖降解，也显示出一致的阳性富集，但没有达到统计显著性。几个与核心代谢和生物合成功能相关的通路，包括氨基酰-tRNA生物合成和维生素B6代谢，在各种排名中都显示出一致的负富集。
4. 讨论
我们研究了长期暴露于高浓度臭氧对醋蝇（Drosophila melanogaster）在分子、神经元和行为层面的潜在影响。通过涵盖广泛的研究，包括评估臭氧对各种生活史特征（如适应性、寿命和运动活动）的影响，以及对单个气味和气味混合物的反应，以及对触角和触角叶中嗅觉感觉神经元的反应、先天和习得的嗅觉行为以及转录组分析，我们对200 ppb臭氧暴露在模型昆虫醋蝇中的后果有了全面的了解。尽管目前世界上大多数地方的臭氧浓度仍然要低得多，但在污染地区，如中国（Ma等人，2016年）和墨西哥（Barrett等人，2019年），已经描述了接近或甚至超过200 ppb的臭氧水平。在这种情况下，果蝇连续四天暴露于200 ppb的恒定臭氧浓度，没有昼夜变化。虽然这种暴露方式不能再现自然条件下通常观察到的臭氧水平的昼夜循环，但它提供了一个受控的、持续的氧化挑战，使我们能够评估高浓度臭氧压力的生理和感官后果，而不是复制平均环境暴露。
在我们的寿命实验中，我们在饥饿条件下没有观察到死亡率的显著差异。然而，当食物充足时，暴露于臭氧的雌性果蝇显示出更高的死亡率。这表明臭氧的影响在寿命后期变得明显，表明在果蝇暴露于臭氧4天后，200 ppb的臭氧具有长期影响。然而，雄性果蝇在类似条件下没有显示出更高的死亡率，这表明可能存在性别特异性效应。臭氧诱导的氧化应激的叠加效应以及产卵的生理需求可能导致暴露于臭氧的雌性果蝇死亡率增加（Shingleton和Vea，2023年）。因此，我们决定进行下一组实验，以研究臭氧对雌性果蝇繁殖力的影响，这是另一个重要的生活史特征。我们的分析没有发现可归因于臭氧暴露的明显差异，表明繁殖率（生命周期中的产卵率）没有受到臭氧的影响。这一观察结果值得注意，因为它表明尽管雌性果蝇在臭氧暴露后的寿命略有缩短，但它们的繁殖率仍然不受影响。
对行为数据的检查显示，臭氧处理后对单个气味的偏好发生了改变，果蝇对刺激性气味表现出更大的厌恶，并对某些吸引性气味（如乙酸乙酯和香醋）的吸引力降低。我们推测，处于压力下的果蝇可能更加警觉，并被刺激性气味所排斥。此外，它们优先考虑的可能是自我保护而不是寻找食物，这可能导致对吸引性气味的偏好降低。然而，当考虑其他生态相关的气味混合物时，行为效应的幅度减弱了。先前的研究表明，复杂的气味混合物是由多种但不同类型的OSN检测到的，从而增强了果蝇的辨别和感知能力。这种适应机制有助于成功导航和定位食物来源（Parnas等人，2013年；Sachse和Beshel，2016年）。我们的结果与其他物种的研究结果一致，例如黄瓜甲虫、黄蜂和蜜蜂，这些研究显示由于臭氧暴露，它们定位资源的能力受到了不同程度的损害（Fuentes等人，2013年；Démares等人，2022年；Vanderplanck等人，2021年）。此外，我们对活动监测数据的分析没有发现活动水平的任何差异。这种差异的缺失表明，我们研究的嗅觉行为可以完全归因于嗅觉偏好，任何观察到的变化都没有受到活动或运动等混杂因素的影响。
为了研究臭氧处理后对单个气味的行为偏好变化是否可以归因于嗅觉感觉神经元层面上的气味接收和检测的变化，我们进行了EAG记录。然而，尽管我们发现臭氧暴露对某些气味的先天价值和神经反应都有影响，但这两者之间的联系仍然具有推测性。直接暴露于臭氧的氧化效应可能会与嗅觉受体蛋白相互作用，可能影响外周气味的检测和敏感性（Iriti和Faoro，2008年）。然而，我们的结果与观察结果一致，即不同昆虫物种的EAG反应模式在臭氧暴露后保持不变或仅显示出微小差异。这包括对无花果黄蜂（Vanderplanck等人，2021年）、蜜蜂（Démares等人，2022年）和几种果蝇（Jiang等人，2023年）的研究结果。尽管如此，Vanderplanck等人（2021年）显示，无花果黄蜂和大黄蜂在臭氧暴露和对照条件下的EAG幅度存在差异，这表明不同昆虫物种对臭氧对外周气味检测的抵抗力可能有所不同。鉴于迄今为止进行的研究数量有限，进一步的研究对于全面评估昆虫外周嗅觉反应对臭氧的总体敏感性至关重要。此外，我们观察到暴露于臭氧的果蝇的振幅趋势较低，但这种差异仅在吸引性食物气味香醋中达到统计显著性。鉴于EAG记录的变异性和有限的敏感性，我们还使用了触角叶中嗅觉感觉神经元的钙成像，这使我们能够以高信噪比监测特定球状体中的气味诱发反应，反映了特定嗅觉感觉神经元类型的反应特性。特别是，我们的钙成像数据显示，与对照果蝇相比，暴露于臭氧的果蝇对驱避性气味乙酰苯酮的反应钙信号显著降低。在暴露于吸引性气味乙酸乙酯、香醋以及驱避性气味苯甲醛时，也观察到了类似但不显著的趋势。这些发现与我们对这些气味的行为数据一致，显示出臭氧处理后的反应变化。使用更高脑区（如侧角）的成像进行进一步研究可能会提供额外的见解。
使用钙成像研究臭氧效应意味着氧化应激可能对更高脑中心（如蘑菇体）产生影响。鉴于蘑菇体在果蝇中充当学习和记忆中心，检查学习能力可能会揭示臭氧对认知功能的更广泛后果。然而，我们的学习实验显示，暴露于臭氧的果蝇与对照果蝇的学习能力相似。有趣的是，一项针对蜜蜂的研究（Démares等人，2022年）显示，臭氧处理后学习效率下降，这一发现与我们在Drosophila melanogaster中的结果相反。这种差异可能是由于每种模型生物体对氧化应激的抵抗力不同和/或不同研究中使用的学习协议不同所致。
最后，我们进行了转录组分析，以阐明臭氧暴露在分子层面的影响。200 ppb的臭氧暴露似乎诱导了微妙的、协调的转录变化，而不是个别基因的高幅度变化。这表明对慢性环境压力的稳态调整，通过通路级分析比通过单个基因指标更好地捕捉到了生物信号。光转导和寿命调节通路的显著富集表明，当暴露于臭氧压力时，外周感觉器官可能会启动保守的生存机制。有趣的是，我们观察到嗅觉器官中Arrestin 2 (Arr2)的显著上调，这是光转导通路的关键组成部分。这一发现与Merrill等人（2002年）的研究一致，该研究表明这些视觉成分也在触角中表达，并对嗅觉很重要。然而，臭氧暴露如何具体影响触角中这些光转导基因的功能仍有待研究。此外，我们观察到热休克蛋白（Hsp70Ab, Hsp70Ba, Hsp26, Hsp27）和应激传感器（Atf6, Thor）的上调，这些都是寿命调节通路的关键组成部分。这表明可能存在向增强蛋白质折叠和细胞保护的转变，可能有助于减轻氧化损伤。先前的研究已经确定了Hsps在应激和衰老中的作用，强调了它们在不利条件下降维持蛋白质稳态的重要性（Tower，2011年）。在脑数据集中，尽管个别基因的变化同样微妙，富集分析确定了与RNA处理相关的通路的上调，特别是剪接体。鉴于描述替代剪接和剪接因子调节作为应激反应的保守特征的研究（Dutertre等人，2011年），这一发现非常有趣，表明剪接体动态与慢性臭氧暴露引起的应激适应之间存在联系。
我们的研究是首次全面调查臭氧暴露的影响，特别关注大脑和嗅觉器官，分别进行了分析。先前的研究已经记录了黑腹果蝇（D. melanogaster）对各种压力源（包括电离辐射、真菌感染和冷休克）的差异性基因表达反应，这些结果通常通过RT-PCR分析得到验证（Moskalev等人，2015年）。相比之下，针对粉虱的研究表明，臭氧暴露（280 ppb）可以增强其适应性，并调节有害细菌和真菌群落，但RT-PCR分析未能检测到处理条件之间的基因表达显著变化，这提示存在一个新的臭氧-肠道微生物轴，该轴决定了生物体的适应性（Hong等人，2016年）。在我们的研究中，我们承认观察到的差异可能受到这一尚未探索的臭氧-肠道微生物组轴的影响。这些发现强调了基因表达对环境压力源的反应具有复杂性和依赖性，突显了需要在不同生物体和压力条件下进行全面研究的必要性。由于我们的研究主要集中在臭氧暴露对气味检测、嗅觉处理和气味引导行为的影响上，因此我们分析了大脑以及触角和上颚须（即参与气味检测的主要组织）中的基因表达模式。未来的全身分析可能会揭示更多受臭氧暴露影响的基因和通路。总体而言，我们观察到长期臭氧暴露在多个层面上产生了微妙但可辨别的影响。我们的研究表明，4天的200 ppb臭氧暴露足以对果蝇的嗅觉感知产生生理效应。此前已有研究表明，臭氧会降解具有生态意义的挥发物，如食物气味（Venkateswaran等人，2023年）和信息素（Jiang等人，2023年）。我们的研究进一步证明了臭氧对果蝇气味检测和嗅觉驱动行为的影响。臭氧对果蝇信息化学系统和嗅觉系统的双重不利影响可能会加剧其在现实环境中的生存和繁殖挑战。
**作者贡献声明：**
Somasundar Arumugam：撰写初稿、数据可视化、实验设计、概念构建。
Karen Rihani：撰写初稿、数据可视化、实验设计、概念构建。
Vignesh Venkateswaran：撰写初稿、数据可视化、实验设计、概念构建。
Yusuke Shiota：方法学研究。
Devasena Thiagarajan：方法学研究。
Bill S. Hansson：撰写、审稿与编辑、资金筹集、概念构建。
Markus Knaden：撰写、审稿与编辑、监督、资金筹集、概念构建。
Silke Sachse：撰写、审稿与编辑、监督、资金筹集、概念构建。
**资助：**
本研究得到了马克斯·普朗克学会的资助，特别是通过“下一代昆虫化学生态学”（nGICE）中心的资助。
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