摘要：Lantana camara是一种在传统治疗中广泛使用的药用植物，因其含有多种具有药理学重要性的生物活性化合物而备受关注。在完整植物中，次级代谢产物的产生受到多种环境因素和破坏生态系统的人为活动的限制。因此，植物细胞和器官培养成为连续生产高质量高价值产品的重要替代方案。通过系统的细胞操作，可以产生所需的代谢产物，这些产物可以直接从培养基或细胞中分离出来。外植体的表面消毒通常较为困难。研究表明，L. camara的愈伤组织培养在体外产生的化感物质与体内相同，这可能会干扰健康的愈伤组织生长和再生。本研究的目的是开发一种有效的协议，用于建立L. camara的体外 shoot 和愈伤组织培养，并评估水杨酸（SA）对愈伤组织培养的影响。添加35.2 µML−1 BAP的MS培养基最适合 shoot 的繁殖，分别可以产生2.3 ± 0.28和2.0 ± 0.35个shoot来自顶芽和外节外植体；而添加4.6 µML−1 Kin的培养基最适合shoot 的伸长，分别可以产生6.05 ± 0.28和7.92 ± 0.79厘米长的shoot。使用7.5 µML−1 IBA时，每株植物产生的根的数量最多（3.80 ± 0.59条）。胚胎发生性愈伤组织在光照培养条件下形成。对于叶外植体，5.4 µML−1 NAA + 0.88 µML−1 BAP的组合能够获得最高的愈伤组织诱导频率（90%）和生物量（0.41 ± 0.04克）。对于节间外植体，5 µML−1 BAP + 1 µML−1 NAA + 1 µML−1 2,4-D的植物激素组合最适合愈伤组织诱导（90%），而40 µML−1 NAA + 4 µML−1 BAP组合最适合愈伤组织增殖（2.01 ± 0.09克）。在黑暗培养条件下，40 µML−1 NAA + 4 µML−1 BAP和5.4 µML−1 NAA + 0.88 µML−1 BAP分别最适合叶和外节外植体的愈伤组织诱导和增殖。对于诱导反应，添加了5.4 µML−1 NAA + 0.88 µML−1 BAP的MS培养基以及低浓度（125 µML−1）的SA在黑暗培养条件下比在光照条件下更有利于愈伤组织生物量的积累。
1 引言
自人类文明伊始，植物及其产品就被广泛用于治疗各种疾病，自然界是这些治疗药物的主要来源[1, 2]。植物的治疗价值在于一些被称为次级代谢物的生物活性植物化学物质，这些物质是在外部刺激（如外来感染或营养变化）的作用下合成的[3]。此外，它们还能提供对不同环境压力的保护[4]。这些化合物是从初级代谢物生物合成的，在人体内具有特定的生理作用。次级代谢物的作用类型与植物的防御机制之间的相关性催生了可用于治疗动物和人类疾病的植物衍生药物[5]。根据Süntar[6]的研究，大约25%的处方药含有直接从植物中提取或基于植物材料开发的活性成分。
在过去的几十年里，由于植物的多种生物活性、潜在的生理功能、与系统生物学的兼容性以及对多种退行性疾病的保护作用，人们对使用植物作为天然药物的兴趣重新燃起[7]。基于植物的产品或提取物作为药物具有成本效益高、安全性好且副作用少的优点，相比之下，合成药物常常存在掺假和副作用的问题[8,9,10]。因此，为了发现和开发新的药物，人们将注意力重新转向了那些世代以来就被用于治疗各种疾病的传统药用植物。由于药用植物的利用率较高，许多植物因此受到威胁[11]。此外，用于提取的原材料供应有限，以及传统化学合成生产天然产品的复杂性，限制了基于植物的药物的大规模扩展。在完整植物中，次级代谢产物的产生也受到多种因素的限制。为了解决这些问题，通过细胞、组织或器官培养在受控条件下进行体外生物合成已成为大规模生产具有工业意义天然产品的一个有前景的替代方法。组织培养技术提供了重要的植物药物的连续、可靠和可再生的来源[12, 13]。在现代时代，植物细胞和组织培养技术被广泛用于商业重要植物物种的再植被和体外操作[14, 15]。通过系统的细胞操作，可以产生所需的代谢产物，这些产物可以直接从培养基或细胞中分离出来[16]。诱导效应已被广泛用于诱导次级代谢物的从头合成或增强植物细胞培养中的体外生产，因为它具有低成本、高效率和易于操作的特点[17]。通过使用非生物和生物化合物（称为诱导剂）来刺激植物代谢的特定方面，可以提高所需次级代谢物的产量[18, 19]。诱导剂可以刺激任何类型的植物防御机制，从而促进次级代谢以保护细胞和整个植物[20]。植物生长调节剂如茉莉酸（JA）、甲基茉莉酸（MeJA）和水杨酸（SA）也是已知的强效诱导剂，可以诱导或增强次级代谢物的体外生产，促进细胞生长和生物量积累。外源应用SA可以诱导生理活动，如氧化应激和超敏反应，类似于其内源性对应物，因此可以用来促进代谢物的合成[21, 22]。L. camara属于马鞭草科，被列为世界重要的药用植物之一[23]。应开发新的方法来研究这种植物的药理潜力，以优化其效果[24]。L. camara含有多种重要的生物活性分子。据报道，该属植物中含有多种化合物，例如黄酮类、单萜类、倍半萜类、呋喃萘醌类、苯乙酰糖苷和环烯醚萜糖苷[25]。L. camara具有多种传统的药用价值：叶油可用作伤口消毒剂[26]；花和根提取物用于治疗白血病[27]；叶提取物用于治疗腹泻、疟疾、多种皮肤和呼吸系统疾病[28,29,30]；果实对治疗咳嗽和痔疮有益[31]。已报道Lantana的多种药理活性，包括酶活性、抗真菌、抗菌、抗疟疾、抗惊厥、中枢神经系统抑制、免疫抑制、降压、止血、镇痛、降血糖、血液毒性、肝毒性、肾毒性、造血、驱虫、杀虫和杀螺作用[32]。迄今为止，关于通过应用诱导剂研究L. camara体外培养中次级代谢物积累的研究还很少。本研究的目的是开发一种有效的协议，用于建立L. camara的体外 shoot 和愈伤组织培养。在本研究中，我们使用了SA诱导剂。假设是使用SA作为诱导剂可能会增加Lantana愈伤组织培养的生物量。据我们所知，这是首次观察到Lantana愈伤组织培养对SA诱导的反应。本研究结果还观察到了体细胞胚胎发生。
2 材料与方法
2.1 培养基制备
使用4.4克Sigma-Aldrich MS培养基粉末，加入30 gL−1蔗糖和8 gL−1琼脂，制备了一升Murashige和Skoog（MS）培养基[33]。测试了不同组合和浓度的植物激素添加到MS基础培养基中对愈伤组织形成的效果（20 µML−1 NAA + 40 µML−1 BAP、40 µML−1 NAA + 40 µML−1 BAP、40 µML−1 NAA + 4 µML−1 BAP、21.5 µML−1 NAA + 22.5 µML−1 BAP、5.4 µML−1 NAA + 0.88 µML−1 BAP、5 µML−1 BAP + 1 µML−1 NAA + 1 µML−1 2,4-D）以及直接再生（35.2 µML−1 BAP、20 µML−1 BAP、6.6 µML−1 BAP、4.4 µML−1 BAP + 2.45 µML−1 IBA、12 µML−1 TDZ、0.44 µML−1 IAA、4.6 µML−1 Kin）。IBA（0.49 µML−1, 7.5 µML−1）和IAA（0.44 µML−1, 5.7 µML−1）用于根诱导。不同浓度的SA（0（对照组）、125、250和500 µML−1）被添加到MS培养基中，用于体外培养的愈伤组织进行应力处理。
2.2 植物材料收集、外植体制备和消毒
从L. camara（凭证编号LAH. 20062）中收集了健康、无病虫害的植物材料，这种植物开黄色花朵，种植在拉合尔（N 31° 30′ 4.3236″, E 74° 18′ 5.4684″）的旁遮普大学植物园。外植体用流动自来水冲洗10分钟，然后浸入家用洗涤剂（Lemon Max，卡拉奇，巴基斯坦）中20分钟，再用蒸馏水彻底冲洗。随后，使用表1中列出的不同浓度的化学消毒剂进行表面消毒，并在不同的处理时间内进行消毒，然后用高压灭菌蒸馏水在预先灭菌的层流柜中冲洗三次，以去除消毒剂的痕迹。
2.3 文化条件
对于微繁殖和愈伤组织诱导，培养物在16小时的光周期下培养，光合光子通量密度（PPFD）为40 µmol m−2 s−1，使用白色荧光灯（36瓦特，Philips，巴基斯坦）在25 ± 2°C和55–60%的相对湿度下进行。为了优化愈伤组织形成的培养条件，培养物也在完全黑暗的条件下进行培养。实验设计是完全随机的。在培养第30天，记录了用于再生的生长参数数据；而在第60天，则记录了用于愈伤组织形成的数据。对于每种植物生长调节剂（PGRs）的组合，保持了10个重复实验，并定期进行观察。通过每30天进行一次传代培养来维持愈伤组织的生长。在传代过程中，要小心地去除坏死组织和琼脂残留物，同时不影响健康的愈伤组织。
2.4水杨酸对Lantana camara愈伤组织的影响：将生长旺盛、60天大的愈伤组织转移到优化后的愈伤组织增殖培养基中（5.4 µML−1 NAA + 0.88 µML−1 BAP），并加入不同浓度的水杨酸[0（对照）、125、250和500 µML−1]。从每个处理的5个重复实验中记录数据，分别在光照和黑暗条件下，以评估水杨酸对愈伤组织生物量增加或减少的影响及其形态发生反应。
2.5统计分析：使用IBM SPSS统计软件版本26.0.0通过单因素方差分析（One-way ANOVA）对各种生长参数进行了分析。Duncan的多重范围检验（DMRT）在5%的显著性水平上确定了均值之间的差异显著性，同样使用IBM SPSS版本26.0.0进行。
3.1外植体消毒的优化：L. camara的外植体接受了不同浓度的NaOCl和HgCl2的处理，这些处理可以单独进行也可以联合使用。化学浓度和处理时间都对外植体的消毒效果有显著影响（表1）。用20%的NaOCl处理会导致外植体变褐；降低NaOCl的浓度可以减少褐变，但污染率会增加。用0.1%的HgCl2处理10分钟后，外植体会死亡。用0.1%的HgCl2处理5分钟后，污染率显著降低，但大多数外植体会变褐且无法再生。然而，将处理时间缩短至1分钟后，污染率反而增加。联合使用这两种化学消毒剂被证明是最佳的消毒方法。先用0.1%的HgCl2处理1分钟，然后再用10%的NaOCl处理10分钟对于茎段的培养外植体，以及用5分钟处理对于叶段的培养外植体，分别获得了最低的污染率。
3.2通过直接器官发生进行再生：细胞分裂素可以促进细胞增殖、克服顶端优势、打破侧芽休眠、诱导腋芽形成并控制细胞周期，这些都是茎段增殖所必需的[34,35,36,37]。从田间种植的成熟L. camara植株上切下的茎尖和节段外植体被接种到含有不同浓度细胞分裂素和生长素（单独或联合使用）的MS培养基上。不同生长参数的结果显示在表2和表3中。接种后5-7天内观察到了顶端和腋芽的分化。添加了35.2 µML−1 BAP的MS培养基对茎段增殖效果最好，每个茎尖和节段外植体分别产生了2.30 ± 0.28和2.00 ± 0.35个茎段。茎段簇紧凑，节间短，叶片小（图1A）。在4.6 µML−1 Kinetin的MS培养基中观察到最大的茎段长度。单独使用BAP并未促进茎段长度的增长（图1A-C），但与IBA联合使用后，茎段长度显著增加（图1D）。添加TDZ的MS培养基产生了短而簇生的茎段，叶片呈浅绿色（图1E和2E）。同样，生长素（IAA）的添加增加了每个茎段的节数和叶片数，但并未增加茎段长度。在添加了4.4 µML−1 BAP + 2.45 µML−1 IBA的MS培养基上，茎段基部形成了紧凑的黄白色愈伤组织（图1D和2D）。
表2 植物生长调节剂对L. camara茎尖外植体再生频率和生长参数的影响
表3 在16小时光照周期、25 ± 2°C条件下，植物生长调节剂对L. camara节段外植体再生频率和生长参数的影响
图1 通过添加不同植物生长调节剂的MS培养基，L. camara的茎尖外植体再生植株
图2 通过添加不同植物生长调节剂的MS培养基，L. camara的节段外植体再生植株
3.3再生茎段的生根：细胞伸长是生长素的作用之一，但根细胞需要低浓度的生长素才能生长，因为生长素会刺激乙烯的产生，而乙烯会抑制根的生长。IBA是培养基中重要的植物生长调节剂之一，它不仅增加了内源IAA的水平，还增加了IAAsp（吲哚-3-乙酰-天冬氨酸）的水平，这对根分生组织的正常生长和根的最终发育至关重要[38, 39]。体外再生的微茎段被转移到含有不同浓度生长素（IAA和IBA）的MS培养基中以诱导生根。结果如表4所示。IBA（7.5 µML−1）和IAA（5.7 µML−1）的添加都显示出最高的生根效果，每株植物的生根率为100%。IBA（5.7 µML−1）导致最少的根数（1.80 ± 0.33根）和最长的根长（4.05 ± 0.17厘米）。相比之下，IBA促进了根数的增加，而IAA促进了根长的增加。IBA在0.49 µML−1的浓度下没有诱导生根，反而促进了从茎尖外植体再生的微茎段的开花（图3）。
3.4愈伤组织的诱导和增殖：
3.4.1光照条件下的愈伤组织诱导：对于两种外植体，接种后5-8天内都形成了愈伤组织。关于生长参数的数据见表5。对于叶段外植体，含有5.4 µML−1 NAA + 0.88 µML−1 BAP的MS培养基最适合产生黄白色的、易碎的愈伤组织（图4C），其愈伤组织诱导频率最高（90%），鲜重也最高（0.41 ± 0.04克）。在添加了21.5 µML−1 NAA + 22.5 µML−1 BAP的MS培养基中，观察到了含有心形体细胞胚胎（HSSEs）的黄白色、易碎的愈伤组织（图4B）。对于节段外植体，添加5 µML−1 BAP + 1 µML−1 NAA + 1 µML−1 2,4-D的MS培养基在90%的外植体中诱导出了愈伤组织。在这种培养基上，既产生了有毛根的绿色愈伤组织（图5D），也产生了含有HSSEs的致密胚胎性愈伤组织（图5E）。在40 µML−1 NAA + 4 µML−1 BAP的培养基中，获得了最高的愈伤组织鲜重（2.01 ± 0.09克）。
表5 植物生长调节剂对L. camara愈伤组织诱导、鲜重和形态特征的影响（光照条件下）
图4 在25 ± 2°C、16小时光照周期下，添加不同植物生长调节剂的MS培养基对L. camara叶段衍生的愈伤组织的影响
图5 在25 ± 2°C、16小时光照周期下，添加不同植物生长调节剂的MS培养基对L. camara节段衍生的愈伤组织的影响
3.5黑暗条件下的愈伤组织诱导：在黑暗条件下培养有利于愈伤组织的形成，但会延迟10-15天。关于愈伤组织形成的数据见表6。对于叶段外植体，在相同的培养基上偶尔会同时产生易碎和致密的愈伤组织。在添加了40 µML−1 NAA + 4 µML−1 BAP的MS培养基中，形成了乳白色、易碎且半透明的愈伤组织（图6C），其鲜重最高（1.60 ± 0.14克）。在这种培养基上发育的大多数愈伤组织上也再生出了有毛根。
图6 在25 ± 2°C、16小时光照周期下，添加不同植物生长调节剂的MS培养基对L. camara叶段衍生的愈伤组织的影响
图7 在25 ± 2°C、16小时光照周期下，添加不同植物生长调节剂的MS培养基对L. camara节段衍生的愈伤组织的影响
3.6诱导剂处理对Lantana camara愈伤组织的影响：表7展示了SA处理对光照和黑暗条件下叶段和节段衍生的愈伤组织形态的影响。在16小时光照周期内，0-250 µML−1浓度范围内的SA处理显示出不同的效果。低浓度的SA（125和250 µML−1）促进了愈伤组织的更多增殖。随着SA浓度的增加，愈伤组织在500 µML−1时变为棕色并发生坏死（见图8）。愈伤组织的鲜重随着SA浓度的增加而减少。叶段衍生的愈伤组织对SA处理的反应比节段衍生的愈伤组织更好，在125和250 µML−1的条件下，无论是在光照还是黑暗条件下，愈伤组织的鲜重都没有显著减少。而对于节段衍生的愈伤组织，在光照和黑暗条件下培养时，125和250 µML−1的SA处理都显著降低了其鲜重（见图9）。
4讨论：药用植物几乎是所有传统医疗系统的核心资源基础。利用改进的生物活性谱和细胞培养技术进行药用植物的体外繁殖，已被证明非常适合在大规模商业化生产中提高药物植物化物的目标代谢产物的产量[40]。使用体外植物材料有助于减少森林入侵和自然植物的过度开发，从而获取天然材料[41]。在本研究中，通过0.1% HgCl2处理1分钟，随后分别用10% NaOCl处理10分钟和5分钟，实现了Lantana外植体的最佳灭菌效果。随着HgCl2浓度和处理时间的增加，外植体的存活率下降。单独使用NaOCl效果不佳，而长时间（5-10分钟）的HgCl2处理对外植体有负面影响，导致培养物质量下降。HgCl2作为一种强效灭菌剂，会破坏植物组织的膜完整性，因此较长的处理时间会导致外植体存活率降低[42]。因此，优化了这两种化学灭菌剂的浓度和处理时间。体外再生受到多种因素的影响，如外植体类型、年龄、生长调节激素（PGRs）的应用及其与内部植物激素的相互作用，以及微环境条件[43,44,45]。适当浓度的PGRs补充总是决定外植体的生长方式[46]。本研究结果表明，对于茎尖和外节外植体，35.2 µML−1的BAP最适合促进枝条增殖；然而，由于所有含有BAP的培养基中都产生了短而密集的枝条，因此并未促进枝条长度的增长。同样，Wang [47]报道Pseudostellaria heterophylla的微型枝条在繁殖系数较高的情况下生长旺盛但较短。Veraplakorn [48]发现20 µML−1的BA可以最大程度地促进枝条增殖，但枝条长度较短，并观察到培养基中BA浓度与产生的枝条数量之间存在直接关系。在本研究中，BAP（4.4 µML−1）与IBA（2.45 µML−1）联合使用不仅促进了枝条长度的增长，还促进了基部愈伤组织的形成。Veraplakorn [48]在含有40 µML−1 BA和20或40 µML−1 NAA的培养基中也得到了类似的结果。本研究还发现4.6 µML−1的Kin最适合促进枝条伸长。Charan和Kamlesh [49]以及Tien [50]也有类似的发现。根据本研究的结果，IAA和TDZ并未促进枝条长度的增长，但促进了枝条增殖以及节和叶子的发育。Veraplakorn [51]还观察到在TDZ补充条件下形成了紧凑的枝条丛，节间短且叶片小。相反，Samani [52]认为TDZ不适合L. camara的增殖。研究结果表明，在外节外植体培养中，枝条增殖的效率低于茎尖外植体。然而，在再生频率、枝条长度、节数和叶片数量方面，外节外植体更为有效。在本研究中，IAA更有利于根系的形成，同时IAA也促进了根长[表5]。Veraplakorn [48]和Samani [52]也报告了IAA补充剂作用下根系数量最多。与本研究结果相反的是，Veraplakorn [48]发现在含有IAA的培养基中根系伸长更多。本研究的结果与Tien [50]的研究一致，即含有IAA的培养基中的根系更多。体外诱导开花的情况极为罕见，因为这是一个受内部和外部因素共同调控的复杂过程[53]。花诱导的初级阶段需要快速的细胞伸长和扩展，这与生长素浓度的升高有关[54]。在本研究中，当茎尖外植体转移到含有IBA（0.49 µML−1）的生根培养基中时，观察到了开花现象[图3]。Amutha [55]也在Basilicum polystachyon的体外枝条转移到含有IBA和IAA的生根培养基后观察到了开花现象。体细胞胚胎发生是全能性的一个综合模型[56]。这是一个多因素事件，主要取决于所使用的PGRs的种类和浓度，其中生长素起着关键作用[57, 58]。本研究发现，在光照条件下培养可以诱导胚胎发生。Veraplakorn [51]发现在16小时光照周期（40 µmol m−2 s−1）下，22.5 µML−1 BA + 21.5 µML−1 NAA的培养基中愈伤组织的相对生长率最高。利用这种植物激素组合，获得了带有心脏形体细胞胚胎（HSSEs）的黄绿色、易碎的愈伤组织。对于节间外植体，5 µML−1 BAP + 1 µML−1 NAA + 1 µML−1 2,4-D的组合产生了紧凑的、具有HSSEs的愈伤组织[图5E]。然而，40 µML−1 NAA + 4 µML−1 BAP产生的愈伤组织生物量（2.01 ± 0.09 g）最高，并含有HSSEs。本研究发现，与之前的研究结果一致，暗培养条件有利于愈伤组织的形成[Mohamed [59]}。与我们的发现一致，Veraplakorn [48]也报告了愈伤组织上形成了毛根。在本研究中，叶外植体更适合愈伤组织的形成，而节间外植体在愈伤组织生物量生产方面更有效。Veraplakorn [48]还发现叶外植体的愈伤组织诱导反应优于茎尖外植体。相反，Singh和Saxena [60]发现茎外植体的愈伤组织诱导反应更好，但它们也从茎外植体获得了生长迅速且生物量高的愈伤组织。本研究表明，在外节外植体培养中，枝条增殖的效率低于茎尖外植体。然而，在再生频率、枝条长度、节数和叶片数量方面，外节外植体更有效。在本研究中，IBA更有利于根系的产生，同时IBA也促进了枝条增殖以及节和叶子的发育[Veraplakorn [51]}。相反，Samani [52]认为TDZ不适合L. camara的增殖。本研究发现，在外节外植体培养中，枝条增殖的效率低于茎尖外植体。此外，IBA在诱导根系方面表现更好[表5]。体外开花的情况非常罕见，因为这是一个复杂的进程，受内部和外部因素的共同调控[53]。花诱导的初级阶段需要快速的细胞伸长和扩展，这与生长素浓度的升高有关[54]。在本研究中，当茎尖外植体转移到含有IBA（0.49 µML−1）的生根培养基中时，观察到了开花现象[图3]。Amutha [55]也在Basilicum polystachyon的体外枝条转移到含有IBA和IAA的生根培养基后观察到了开花现象。体细胞胚胎发生是全能性的一个典型例子[56]。这是一个多因素事件，主要取决于所使用的PGRs的种类和浓度，生长素起着关键作用[57, 58]。本研究发现，在光照条件下培养可以诱导胚胎发生。Veraplakorn [51]发现在16小时光照周期下，22.5 µML−1 BA + 21.5 µML−1 NAA的培养基中愈伤组织的相对生长率最高。使用这种植物激素组合，获得了带有心脏形体细胞胚胎（HSSEs）的黄白色、易碎的愈伤组织。对于节间外植体，5 µML−1 BAP + 1 µML−1 NAA + 1 µML−1 2,4-D的组合产生了紧凑的、具有HSSEs的愈伤组织[图5E]。然而，40 µML−1 NAA + 4 µML−1 BAP产生的愈伤组织生物量（2.01 ± 0.09 g）最高，并含有HSSEs。本研究发现，与之前的研究一致，暗培养条件有利于愈伤组织的形成[Mohamed [59]}。与我们的发现一致，Veraplakorn [48]也报告了愈伤组织上形成了毛根。在本研究中，叶外植体更适合愈伤组织的形成，而节间外植体在愈伤组织生物量生产方面更有效[Veraplakorn [48]}。相反，Singh和Saxena [60]发现茎外植体的愈伤组织诱导反应更好，但它们也从茎外植体获得了生长迅速且生物量高的愈伤组织。本研究表明，低浓度的SA（125 µML−1）可以增加愈伤组织生物量，而高浓度（250和500 µML−1）则会降低生物量[Nadeem [61]}。Nadeem [61]还观察到中等浓度的SA（50 µML−1）在处理72小时后对Linum usitatissimum细胞培养中的生物量积累有积极作用，而高浓度则抑制了细胞生长。类似地，Al-Khayri和Naik [62]发现低浓度的SA（50 mgL−1）有利于Phoenix dactylifera细胞悬浮液的生物量生产，而高浓度则显著抑制了细胞生长。Biswas [63]也观察到在添加SA（100和200 µML−1）后Panax quinquefolius细胞悬浮液的生物量急剧下降。由于诱导剂会引起细胞的生理和形态变化，因此通常会观察到诱导细胞培养物的生物量减少[64]。在本研究中，随着SA浓度的增加，愈伤组织逐渐变褐，在500 µML−1 SA时趋于坏死[Martínez [65]}。Martínez [65]还观察到，在360 µML−1 SA诱导下，Laelia caulescens愈伤组织的颜色从浅绿色变为褐色。由于诱导是一个剂量依赖的过程，因此在高剂量诱导剂下，体外培养物中经常会出现过度敏感的反应[66]。同样，SA也具有剂量依赖性效应，低和高浓度分别可以诱导或抑制植物功能。在高浓度下，SA会导致细胞内H2O2的积累，从而引起氧化损伤，可能导致细胞死亡[67, 68]。这可能是本研究中观察到的培养物变褐的原因[5]。
结论：我们已经开发出一种有效的协议，用于建立L. camara的体外枝条和愈伤组织培养。茎尖和外节外植体在BAP补充下表现出最佳的枝条增殖效果，而Kin则最有利于枝条伸长。叶外植体和节间外植体对愈伤组织形成的反应表现出差异性。光照条件下培养产生了胚胎发生型愈伤组织，而暗培养条件有利于愈伤组织生物量的积累。低浓度的SA可以促进愈伤组织的增殖。本研究的发现可以扩展到细胞悬浮培养中，通过对诱导愈伤组织培养物的代谢物分析，可能提示L. camara作为重要药物植物化学物质来源的潜力。本研究中获得的体细胞胚胎可以用于植物的大规模克隆生产。
