摘要
凝集素是一类能够结合碳水化合物的蛋白质，参与多种生物过程，在生物技术应用中的重要性日益增加。在本研究中，我们报道了一种来自海洋红藻Amansia multifida（AML）的凝集素的结构特征。质谱分析显示该凝集素存在两种主要异构体，分子量分别为28,388 Da和28,661 Da。通过N端Edman降解、串联质谱和RACE-PCR技术确定了分子量为28,661 Da的凝集素的一级结构，发现其含有四个串联重复的结构域，并且与OAAH（Oscillatoria agardhii凝集素家族）成员具有高度序列相似性。值得注意的是，AML属于Ceramiales目，这表明该凝集素家族的分布范围可能比之前认为的更广，因为之前仅限于Gigartinales目的物种。二级和三级结构分析表明其主要为β-折叠结构，具有OAAH凝集素的典型特征。分子对接实验显示该凝集素能够识别甘露糖基化的糖链，这一特性得到了所有碳水化合物识别域中存在QWGGREGPI基序的支持。尽管AML没有表现出直接的抗菌或抗生物膜活性，但它能够使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌凝集，表明其可能与富含甘露糖的细胞表面糖链发生相互作用。这些发现增强了我们对海洋凝集素多样性的理解，并将AML确定为OAAH家族的一个新成员。
引言
凝集素是一类能够结合碳水化合物的蛋白质，在多种生物过程中发挥作用，并在生物技术应用中越来越受到重视。本研究报道了一种来自海洋红藻Amansia multifida（AML）的凝集素的结构特征。质谱分析揭示了两种主要异构体，分子量分别为28,388 Da和28,661 Da。通过N端Edman降解、串联质谱和RACE-PCR技术确定了分子量为28,661 Da的凝集素的一级结构，发现其含有四个串联重复的结构域，并且与OAAH（Oscillatoria agardhii凝集素家族）成员具有高度序列相似性。AML属于Ceramiales目，这表明该凝集素家族的分布范围可能比之前认为的更广，因为之前仅限于Gigartinales目的物种。二级和三级结构分析表明其主要为β-折叠结构，具有OAAH凝集素的典型特征。分子对接实验显示该凝集素能够识别甘露糖基化的糖链，这一特性得到了所有碳水化合物识别域中存在QWGGREGPI基序的支持。尽管AML没有表现出直接的抗菌或抗生物膜活性，但它能够使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌凝集，表明其可能与富含甘露糖的细胞表面糖链发生相互作用。这些发现增强了我们对海洋凝集素多样性的理解，并将AML确定为OAAH家族的一个新成员。
凝集素是一类能够结合碳水化合物的蛋白质，在多种生物过程中发挥作用，并在生物技术应用中越来越受到重视。在本研究中，我们报道了一种来自海洋红藻Amansia multifida（AML）的凝集素的结构特征。质谱分析揭示了两种主要异构体，分子量分别为28,388 Da和28,661 Da。通过N端Edman降解、串联质谱和RACE-PCR技术确定了分子量为28,661 Da的凝集素的一级结构，发现其含有四个串联重复的结构域，并且与OAAH（Oscillatoria agardhii凝集素家族）成员具有高度序列相似性。AML属于Ceramiales目，这表明该凝集素家族的分布范围可能比之前认为的更广，因为之前仅限于Gigartinales目的物种。二级和三级结构分析表明其主要为β-折叠结构，具有OAAH凝集素的典型特征。分子对接实验显示该凝集素能够识别甘露糖基化的糖链，这一特性得到了所有碳水化合物识别域中存在QWGGREGPI基序的支持。尽管AML没有表现出直接的抗菌或抗生物膜活性，但它能够使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌凝集，表明其可能与富含甘露糖的细胞表面糖链发生相互作用。这些发现增强了我们对海洋凝集素多样性的理解，并将AML确定为OAAH家族的一个新成员。
凝集素是一类能够结合碳水化合物的蛋白质，在多种生物过程中发挥作用，并在生物技术应用中越来越受到重视。在本研究中，我们报道了一种来自海洋红藻Amansia multifida（AML）的凝集素的结构特征。质谱分析揭示了两种主要异构体，分子量分别为28,388 Da和28,661 Da。通过N端Edman降解、串联质谱和RACE-PCR技术确定了分子量为28,661 Da的凝集素的一级结构，发现其含有四个串联重复的结构域，并且与OAAH（Oscillatoria agardhii凝集素家族）成员具有高度序列相似性。AML属于Ceramiales目，这表明该凝集素家族的分布范围可能比之前认为的更广，因为之前仅限于Gigartinales目的物种。二级和三级结构分析表明其主要为β-折叠结构，具有OAAH凝集素的典型特征。分子对接实验显示该凝集素能够识别甘露糖基化的糖链，这一特性得到了所有碳水化合物识别域中存在QWGGREGPI基序的支持。尽管AML没有表现出直接的抗菌或抗生物膜活性，但它能够使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌凝集，表明其可能与富含甘露糖的细胞表面糖链发生相互作用。这些发现增强了我们对海洋凝集素多样性的理解，并将AML确定为OAAH家族的一个新成员。来自Oscillatoria agardhii（OAA）的凝集素被用作外群来构建系统发育树。
**圆二色性测量**
圆二色性（CD）光谱测量使用Jasco J-815光谱偏振仪（Jasco International Co., Japan）进行，该仪器配备了用于温度控制的Peltier系统。AML（0.20 mg mL⁻¹，溶解在20 mM磷酸盐缓冲液中，pH 7.0）被放置在一个路径长度为0.05 cm的矩形石英比色皿中。光谱以50 nm min⁻¹的扫描速度和1 nm的带宽采集，覆盖190–240 nm（远紫外）的波长范围。二级结构分析使用DICHROWEB网络服务器（Whitmore和Wallace 2004）进行。通过监测216 nm处椭圆率随温度的变化来确定凝集素的折叠热力学参数（Greenfield 2006）。凝集素被置于20至100°C的温度范围内。
**动态光散射（DLS）分析**
动态光散射（DLS）用于评估不同pH条件下AML的流体动力学行为和寡聚化特性。首先使用HullRad程序基于模型化的蛋白质结构在计算机上估算AML的理论流体动力学直径。在实验测量中，凝集素在三种不同的缓冲液中溶解至最终浓度0.5 mg mL⁻¹：20 mM醋酸钠（pH 5.0）、20 mM磷酸钠（pH 7.0）和20 mM甘氨酸–HCl（pH 10.0）。分析前，所有样品在4°C下以10,000 × g的离心力离心20分钟以去除不溶性聚集体和颗粒物质。上清液转移到一次性聚苯乙烯比色皿中，并使用Malvern Instruments公司的Zetasizer Advance Ultra仪器在25°C下进行DLS测量。流体动力学尺寸分布是根据制造商提供的通用分析模型从强度自相关函数计算得出的。每种条件重复测量三次，每次重复代表多次扫描的平均值，遵循先前报告中的程序（Saraiva 2025）。
**结构预测**
使用AlphaFold2服务器对AML凝集素进行结构建模，利用已确定的凝集素氨基酸序列（Jumper等人2021）。该服务器生成了五个预测的三维结构，模型分析基于序列覆盖率和同一性图。对于立体化学评估，通过MolProbity服务器（Chen等人2010；Williams等人2018）评估了诸如空间重叠、Cβ位移参数、Ramachandran图、旋转异构体和键角质量等标准。选择质量最高的模型，并在PyMol Molecular Graphics System（版本1.8，Schrödinger, LLC）中进行可视化检查。
**对接计算**
出于当前目的，使用该凝集素家族的典型底物——五甘露糖苷3α,6α-曼诺戊糖进行对接计算，其坐标来自Burkholderia oklahomensis的BOA凝集素的晶体结构（ID: 4GK9）（Whitley等人2013）。计算使用AutoDock Vina版本1.5.6（Trott和Olson 2010）进行，其中受体结构被视为刚性的，而配体保持灵活性。搜索在每个碳水化合物结合位点上方的30 Å × 30 Å × 30 Å立方空间内进行，设置条件如下：构象数=20，穷尽性=15，种子=2009。计算基于理论结合能（以千卡/摩尔计）进行，并根据结构比较进行选择。此外，使用DogSiteScorer工具（https://proteins.plus）分析了AML的碳水化合物识别域（CRD），该工具对蛋白质的三维表示应用高斯差分滤波器以定位潜在的结合位点（Volkamer等人2012；Schoning-Stierand等人2020）。通过使用上述BOA凝集素的晶体结构（与五甘露糖苷3α,6α-曼诺戊糖复合）进行重新对接计算，验证了AutoDock Vina的有效性，其结构存储在RCSB蛋白质数据库中（https://www.rcsb.org/）。结果基于实验确定的配体位置与计算出的配体位置之间的均方根偏差（RMSD）进行分析，使用Visual Molecular Dynamics软件中的RMSD计算器工具（Humphrey等人1996）。
**抗菌活性**
使用了来自美国典型培养物收藏中心（ATCC）的三种参考菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、金黄色葡萄球菌ATCC 700698和大肠杆菌ATCC 11303。
**细菌凝集**
细菌在Trypticase Soy Broth（TSB；Himedia，印度）中于37°C培养过夜，然后以2000 × g的离心力离心10分钟。细胞用含有150 mM NaCl的20 mM Tris–HCl（pH 7.6）洗涤两次，悬浮在含有4%甲醛的TSB中，并在4°C下孵育16小时。之后，细胞再次用TSB洗涤并重新悬浮在同一缓冲液中。使用前，将每种细菌悬浮液的细胞密度调整至最终浓度2 × 10⁶ cells mL⁻¹。凝集试验按照先前描述的方法进行（de Melo等人2014）。
**AML对浮游细胞的影响**
根据临床和实验室标准研究所文件M07-A10的方法（Vasconcelos等人2014；CLSI 2015）通过微稀释法评估AML对浮游细胞的影响，并进行了一些修改。
**AML对生物膜形成的影响**
使用Stepanovic及其同事描述的方法（Stepanović等人2000；Vasconcelos等人2014；Marques等人2018）通过微量滴定板试验评估AML对生物膜形成的影响，并进行了一些修改。
**结果**
**AML的纯化**
AML通过硫酸铵沉淀和DEAE-Sephacel柱上的单次色谱步骤进行纯化。SDS-PAGE分析显示出一个相对分子质量约为29 kDa的单一条带（数据未显示），这与Costa等人（1999）描述的纯化方案和产量一致。在整个纯化过程中监测了凝集素的血凝活性，该凝集素在蛋白质浓度为1 mg mL⁻¹时能够以512 U/mL的浓度使胰蛋白酶处理的兔红细胞发生凝集。血凝抑制试验显示了酵母甘露聚糖的血凝活性的最小抑制浓度（MIC）为7.8 µg mL⁻¹。
**N端氨基酸序列**
通过Edman降解确定了AML的前十二个氨基酸。位置1、2、3和10的残基无法鉴定。AML的N端序列为XYTVENQXGG。使用NCBI的PROTEIN BLAST进行相似性搜索，发现AML与OAAH家族成员之间存在高度相似性。
**通过MS/MST进行分子质量和氨基酸测序**
LC–MS光谱显示了与AML相关的独特离子系列（图1）。观察到两个主要离子，质量分别为28,388 Da和28,661 Da，接近SDS-PAGE观察到的表观分子质量29 kDa。这两个离子系列表明AML制备物中至少存在两种异构体。离子系列中的微小变化表明可能存在加合物形成或其他异构体。
**图1**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**使用主要离子28,388 Da和28,661 Da的AML的分子质量确定。LC–MS的ESI–MS去卷积质谱，放大28,000至29,000 Da的质量区域。
**手动解释测序数据**
显示的肽与属于OAAH家族的海洋红藻凝集素相似（ASL-1：BAX08598.1；KAA-2：BAU19431.1；KSA-2：BAR91206.1；ESA-2：P84331.1；SfL-1：C0HL89.1）。在序列的某些区域检测到多个具有轻微氨基酸差异的肽，表明AML制备物中存在异构体（表S1）。因此，无法将肽的氨基酸序列重叠以获得至少一种AML异构体的完整初级序列。
**AML的初级结构**
3’RACE PCR的测序得到一个911个核苷酸的凝集素蛋白编码序列，而5’RACE PCR得到442个核苷酸。根据这些序列设计的特异性寡核苷酸用于凝集素的开放阅读框（ORF），得到810个核苷酸的序列，相当于270个氨基酸。通过MS/MS确定的氨基酸序列与cDNA获得的序列重叠，从而确定了AML一种异构体的初级结构（图2）。
**图2**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**AML的一种异构体的初级结构。**通过cDNA克隆、N端测序和胰蛋白酶肽的串联质谱（T）确定了初级结构。肽的分子质量由质谱显示，括号内表示。下划线残基表示引物设计位置。箭头表示从3’RACE和5’RACE实验获得的测序方向。AML的ORF包含270个氨基酸，包括一个起始甲硫氨酸残基和一个半胱氨酸残基，没有糖基化位点。通过将肽与cDNA数据重叠得到的序列包含269个氨基酸，不包括起始甲硫氨酸。肽序列显示了一些异质性，证实了异构体的存在（数据未显示）。计算出的AML的分子质量与LC–MS确定的分子质量（28,661 Da）一致。
**AML的初级结构包括四个串联重复的域，每个域大约由66个氨基酸组成，序列同源性为45.44%。**AML与MPA-2（BAX08602.1）、ASL-1（BAX08598.1）、SfL-1（C0HL89.1）、SfL-2（C0HL90.1）、KAA-2（BAU19431.1）、KSA-2（BAR91206.1）、ESA-2（P84331.1）、EDA-2（BAR91516.1）和BOA（4GK9_A）等具有序列相似性（图3）。
**图3**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**AML与其他OAAH家族成员的比对。**AML的氨基酸序列与Meristotheca papulosa凝集素（MPA-2）、Kappaphycus alvarezii凝集素（KAA-2）、Kappaphycus striatus凝集素（KSA-2）、Eucheuma serra凝集素（ESA-2）、Eucheuma denticulatum凝集素（EDA-2）、Agardhiella subulata凝集素（ASL-1）、Solieria filiformis凝集素（SfL-1和SfL-2）以及Burkholderia oklahomensis EO147凝集素（BOA）进行了比对。下划线残基表示参与碳水化合物结合的氨基酸，如Whitley等人（2013）所描述。黑色和白色框分别代表相同的和非相同的氨基酸。
**基于红藻OAAH型凝集素比对构建的系统发育树**
使用最大似然法构建的系统发育树显示，来自Amansia multifida（Ceramiales目）的AML形成了一个独立的分支，与大多数Gigartinales属的凝集素明显分离（图4）。拓扑结构还显示了密切相关的分类单元之间的连贯分组：ESA-2和EDA-2都来自Eucheuma属，聚集在同一分支上，而SfL-1和SfL-2来自Solieria filiformis也聚集在一起。排除几乎相同的序列（如KAA-2和KSA-2）提高了树的分辨率，并在几个内部节点增强了自举支持。这些结果表明每种凝集素的系统发育位置与其分类学起源一致（图4）。
**图4**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**OAAH家族红藻凝集素之间的系统发育关系。**使用JTT替换模型在MEGA 12中构建的OAAH型红藻凝集素的最大似然系统发育树。该树基于MUSCLE生成的多个序列比对，并使用500次自举复制进行评估。包括来自Amansia multifida（AML）、Meristotheca papulosa（MPA-2：BAX08602.1）、Kappaphycus alvarezii凝集素（KAA-2：BAU19431.1）、Kappaphycus striatus凝集素（KSA-2：BAR91206.1）、Eucheuma serra（ESA-2：P84331.1）、Eucheuma denticulatum（EDA-2：BAR91516.1）、Agardhiella subulata（ASL-1：BAX08598.1）和Solieria filiformis（SfL-1：C0HL89.1，SfL-2：C0HL90.1）的凝集素。使用Oscillatoria agardhii（OAA：WP_227350609.1）作为外群。节点处的自举值大于50%用相应符号表示。
**圆二色性**
天然AML在CD测量中在215 nm处显示出最小吸收（图5 A）。根据CONTIN预测方法（van Stokkum等人1990），一种通用的连续分布约束正则化方法，AML的理论二级结构由3% α-螺旋、40% β-折叠、19% β-转角和38% 螺旋组成（图5）。
**图5**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**AML的远紫外CD光谱。**（A）从190至240 nm记录的AML的远紫外圆二色光谱。测量使用路径长度为0.05 cm的比色皿，在pH 7的PBS中，蛋白质浓度为0.2 mg mL⁻¹。（B）在固定波长下监测AML的热变性曲线。热转变的中点（Tm）估计约为60.8°C，曲线显示非线性展开模式，表明存在多态性转变。
**AML的热变性分析**
AML的热变性分析显示非线性展开曲线（图5 B）。从平滑的椭圆率曲线确定的熱转变中点（Tm）估计约为60.8°C，与在较宽温度范围内发生的部分展开事件一致。
**动态光散射（DLS）分析**
在三种不同pH条件下使用DLS评估AML的流体动力学行为（图S1）。使用HullRad在计算机上估算的单体理论流体动力学半径为2.4 nm，对应的理论流体动力学直径约为4.8 nm。在pH 5.0（醋酸盐缓冲液）时，实验DLS曲线显示出一个平均流体动力学直径约为4.5 nm的单一群体，这与理论模型预测的单体状态一致。在pH 7.0（磷酸盐缓冲液）时，AML显示出一个以7–8 nm为中心的单一群体，表明形成了二聚体物种。在该pH值下观察到的颗粒大小增加表明亚基间界面相互作用的稳定，这可能是由于表面电荷分布的变化所介导的。在pH 10（甘氨酸-HCl缓冲液）时，AML的流变学特性发生了显著变化，出现了一个直径约为1.5–2.0微米的宽峰，表明在高度碱性条件下蛋白质发生了广泛的聚集。
结构预测显示，AML凝集素的结构由两个横向排列的β-桶结构域组成，并通过一个柔性段连接（图6 A）。碳水化合物结合位点位于每个桶的顶端和基底部分，共有四个CRD，根据凝集素的结构进行编号，其中位点1最接近N端，位点4最接近C端（图6 B）。获得的结构经过分析并得到验证，显示98.13%的氨基酸残基位于Ramachandran图中的优选区域。
图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
AML的整体结构。（A）AML的结构以淡绿色卡通形式表示。（B）AML的碳水化合物识别域（CRD）以透明的淡绿色卡通形式显示，交互式残基用绿色线条表示，结合的碳水化合物分子用粉色棒状物表示。
对接计算结果显示，AML与五甘露糖苷在所有结合位点的相互作用模式相似（表1）。Man1–Man5对应于五甘露糖苷配体的五个甘露糖单元。精氨酸、三个甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和脯氨酸的侧链与配体中的α-D-甘露糖（Bma1）和α-甘露糖（Man2和Man3）单元的不同氧原子形成极性相互作用（图7）。然而，色氨酸和异亮氨酸等残基负责疏水接触，与配体的Bma1和Man3单元建立相互作用。在这种情况下，Trp残基与配体中的一个甘露糖残基的吡喃糖环形成疏水相互作用，影响配体的结合亲和力和构象稳定性。
表1：AML碳水化合物结合位点的氨基酸组成和拓扑特性。
图7：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
AML的碳水化合物结合位点和对接结果。3α,6α-甘露戊糖在AML的四个CRD上的结合，用粉色棒状物表示（A、B、C和D）。蛋白质结构以淡绿色卡通形式显示，而AML残基和关键相互作用分别用浅绿色棒状物和黄色虚线表示。分析中考虑的相互作用截止距离为4.0 Å。为了清晰起见，省略了一些相互作用和结合残基。
所描述的相互作用发生在距离配体表面4.0 Å的半径范围内。因此，检测到甘露糖单元与Trp残基的侧链之间的较长π-σ型相互作用（4.0–5.0 Å），这是芳香族单键系统的特征。此外，Man4和Man5单元与预期半径内的位点残基没有建立可检测的相互作用。
AML能够以500 µg/mL的浓度使大肠杆菌（E. coli）和两种金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株（ATCC 25923和ATCC 700698）聚集（图8）。然而，AML并未抑制浮游生长，也未对生物膜形成产生影响（数据未显示）。
图8：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
AML对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的聚集作用。（A）与AML（500 µg/mL）孵育的大肠杆菌ATCC 11303；（C）金黄色葡萄球菌ATCC 25923；（E）金黄色葡萄球菌ATCC 700698；（B）与TBS（对照）孵育的大肠杆菌ATCC 11303；（D）金黄色葡萄球菌ATCC 25923；（F）金黄色葡萄球菌ATCC 700698。箭头表示细菌聚集。所有图像均在120倍放大下获取。
在这项研究中，我们成功纯化并表征了来自Amansia multifida（AML）的凝集素。纯化的蛋白质在SDS–PAGE中的表观分子质量约为29 kDa，其血凝活性被酵母甘露聚糖抑制，这与之前对该物种凝集素的报道一致（Costa等人，1999年）。不同研究中报告的SDS–PAGE估计值之间的差异可能反映了电泳迁移和不同分子量标准校准的变化。质谱分析进一步揭示了AML的分子质量和序列，检测到两个主要离子，分别为28,388 Da和28,661 Da，表明至少存在两种异构体。这种异质性通过肽测序得到证实，表明序列存在变异。基于确定的一级结构计算出的28,661 Da的分子质量与观察到的质量非常吻合，验证了我们结构表征的准确性。
AML的氨基酸序列与其他OAAH家族的凝集素有很强的相似性，表现出该家族特有的串联重复结构域。与MPA-2（70.72%）、ASL-1（69.66%）、SfL-1（68.06%）、SfL-2（67.80%）、KAA-2（66.67%）、KSA-2（66.67%）、ESA-2（66.67%）、EDA-2（66.67%）和BOA（60.92%）的序列相同。有趣的是，所有先前被归类为OAAH家族成员的大型藻类凝集素都是从Gigartinales目（Agardh 1847, 1872；Kraft和Wynne 1979；Gabrielson 1985；Gabrielson和Cheney 1987；Liao 1996）的物种中分离出来的。相比之下，AML属于Ceramiales目（Lamouroux 1809），这表明AML可能是首次在Gigartinales目之外的大型藻类中发现的OAAH凝集素，暗示这一凝集素家族可能有更广泛的分类学分布。
实际上，AML与其他OAAH型凝集素的系统发育区分突显了该家族内潜在的独特进化路径。虽然所有先前表征的红藻OAAH凝集素都来自Gigartinales目的物种，但AML来源于Ceramiales目的A. multifida。这种系统发育分离得到了自举分析的支持，表明可能是从共同的祖先凝集素早期分化而来，或者是Ceramiales目内的特定谱系适应。树的总体一致性，包括Eucheuma（ESA-2和EDA-2）在属级别的聚类以及Solieria filiformis（SfL-1和SfL-2）在物种级别的分组，增强了系统发育重建的可靠性，并支持OAAH凝集素保留谱系特异性分子特征的假设。AML相对于Gigartinales目来源的凝集素的基部位置可能表明Ceramiales目代表了红藻中之前未被识别的凝集素多样性库。这些发现强调了扩大分类学采样范围以更好地理解OAAH型凝集素在红藻谱系中的分布和多样化的重要性。
该家族的成员在碳水化合物结合残基（WGGREGPI）上也表现出保守性，这一点也在AML凝集素中观察到（Whitley等人，2013年）。结合其先前报道的对含有高甘露糖N-糖苷的糖蛋白的亲和力，这些发现进一步支持了将AML归类为OAAH家族。对富含甘露糖的N-糖苷的结合特异性引起了广泛关注，因为这些结构在癌细胞和病毒衣壳上非常普遍（Ferir等人，2014年；Barre等人，2019b, 2021年；Sato等人，2020年）。
CD分析显示，天然AML主要由β-折叠和随机卷曲结构组成，α-螺旋和β-转角的结构贡献较小，与其他OAAH凝集素一致，并与AML的建模数据相符（Whitley等人，2013年；Chaves等人，2023年）。AML的预测三级结构显示由两个横向排列的β-桶结构域组成，并通过一个柔性连接器连接。这种结构组织在OAAH凝集素中很常见，它们通常是单体蛋白质，由一个或两个β-桶结构域组成，分别来源于两个或四个串联重复的同源序列（Koharudin等人，2011年，2012年；Whitley等人，2013年；Chaves等人，2023年）。虽然一些甘露糖结合凝集素表现出β-棱柱、β-三明治或β-三叶折叠，但AML预测的β-桶结构表明了不同的结构组织，这可能影响其碳水化合物结合特性（Barre等人，2019a, b）。此外，温度梯度上椭圆性的逐渐丧失，由多个拐点标记，与多结构域组织一致。每个结构域可能表现出不同的热稳定性，独立贡献于整体的展开特征。此外，蛋白质制备中存在多个异构体，其中两种占主导地位，先前研究中至少报告了五种异构体（Costa等人，1999年；Mesquita等人，2021年），这也可能有助于广泛的和非协同的变性行为。这些异构体在结构特征上可能存在微妙差异，进一步多样化了热响应。
我们还评估了AML在不同pH值下的流变学行为。观察到的聚集模式似乎依赖于pH值，并与AML异构体的等电点（pI）范围密切相关。最丰富的异构体的pI值约为6.05和6.33（Mesquita等人，2021年），而本研究中表征的异构体的计算pI为6.26。因此，我们认为接近中性的pH值可能减少静电排斥，有利于二聚体的形成，而更碱性的条件可能由于蛋白质不稳定而促进非特异性聚集。
AML的碳水化合物识别域（CRDs）在蛋白质表面显示出与其他OAAH凝集素（包括来自B. oklahomensis的BOA和S. filiformis的SfL）观察到的类似腔体（Koharudin等人，2011年；Whitley等人，2013年；Chaves等人，2018b）。这些CRD在结合位点具有保守的氨基酸组成，特别是QWGGREGPI基序，这与碳水化合物识别有关。尽管存在这种保守性，但在拓扑特征（如腔体深度、表面积和体积）上观察到了变化。这些结构差异可能影响配体的容纳和结合位点的模块化。
进行的计算揭示了涉及残基QWGGREGPI的保守相互作用模式，这些残基已知与甘露糖单元形成极性相互作用。特别是，QGGREGP段与配体上的各种氧原子一致形成氢键，表明这些残基在配体识别中起关键作用。此外，涉及色氨酸和异亮氨酸的疏水接触有助于稳定配体-蛋白质复合物。在所有四个CRD中观察到的配体构象与OAAH凝集素的晶体复合物中的构象高度相似，支持了保守识别机制的假设（Whitley等人，2013年；Chaves等人，2023年）。
CRD结构的高度保守性表明OAAH凝集素经历了进化压力，以保持对类似糖苷结构的特异性。尽管如此，分子间距离和CRD拓扑的微妙差异表明氨基酸残基的空间排列变化可能影响结合亲和力和选择性。OAAH凝集素家族的成员以其抗菌特性而闻名（Liao等人，2003年；Ferir等人，2014年；Hung等人，2015a, b；Hirayama等人，2016年），其中一些代表具有细菌聚集活性。例如，MEL和SfL分别被证明能聚集Vibrio alginolyticus和多重耐药性的沙门氏菌株以及大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（Chaves等人，2018a，2023年）。AML之前在文献中展示了多种生物活性，包括抗HIV和抗流感作用（Gondim等人，2019年）。在本研究中，尽管AML没有表现出直接的抗菌或抗生物膜活性，但它能够聚集大肠杆菌ATCC 11303、金黄色葡萄球菌ATCC 25923和金黄色葡萄球菌ATCC 700698，表明细菌表面可能存在甘露糖苷或类似甘露糖苷的结构。所有生物测定都是使用含有异构体池的纯化凝集素制备进行的，因此无法将观察到的活性归因于特定的异构体。
在大型藻类OAAH凝集素中，迄今为止主要报道了针对海洋细菌的抗菌活性，特别是Vibrio属的物种，ESA-2和EDA-2分别能够抑制V. vulnificus和V. alginolyticus的生长（Liao等人，2003年；Hung等人，2015b）。这些发现可能表明大型藻类OAAH凝集素的抗菌潜力与海洋细菌目标更为相关。然而，需要对更广泛的细菌菌株（包括海洋和陆地细菌）进行更广泛的筛选，以全面评估海洋大型藻类凝集素的抗菌潜力。
总之，我们在Costa等人（1999年）首次报道26年后，表征了一种新的OAAH家族凝集素的结构。AML表现出对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的聚集活性，并与其他OAAH凝集素共享关键的结构特征，包括β-桶结构和保守的碳水化合物结合基序。这些发现将OAAH家族的分类范围扩展到Ceramiales目，并有助于更广泛地理解海洋藻类凝集素及其潜在的生物技术应用。
