用于合成纳米体筛选的核糖体展示文库的设计与验证

摘要：单域抗体（纳米抗体）是一种紧凑且高度可工程化的结合支架，在结构生物学、生物技术和治疗学中得到广泛应用。当与Legobody工具包结合使用时，它们能够实现对小分子膜蛋白的高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析。核糖体展示是一种生成合成纳米抗体（sybodies）的强大方法，具有极高的库多样性。然而，现有的sybody库与Legobody系统不兼容，需要额外的亚克隆步骤，这降低了通量并限制了效率。在这里，我们报告了一种新的核糖体展示兼容纳米抗体库S1.0的合理设计，通过对其C末端区域的修改，使其与Legobody平台具有内在兼容性。与基准sybody库相比，S1.0在决定互补性的CDR1和CDR3区域具有更高的随机化程度，而在CDR2区域的变异性降低。针对钙调蛋白的选择显示出了与基准库相当的效率。此外，针对耐热绿色荧光蛋白（TGP）的选择产生了多个高亲和力的sybodies，其纳摩尔解离常数通过尺寸排阻色谱和生物层干涉测量法得到了验证。重要的是，所选sybodies可以直接与Legobody系统兼容，无需进一步工程化或亚克隆。S1.0库是纳米抗体发现的宝贵资源，特别是为通过cryo-EM对具有挑战性的小分子蛋白进行结构研究提供了高效的结合剂生成途径。

1 引言
纳米抗体（单域抗体）（Muyldermans 2021）是一种紧凑且高度可工程化的结合支架（Li et al. 2021; Yao et al. 2021），可以高效生产（Li et al. 2024）并针对多种应用进行定制，包括细胞内靶向（Wang et al. 2025）、生物传感（例如，毒素检测）（Guo et al. 2024）和体内成像（Kang et al. 2021; Wang et al. 2025）。在临床应用中，它们已成为有前景的治疗手段——例如Caplacizumab（Scully et al. 2019）——并在癌症（Fan et al. 2023; Papp et al. 2021; Girard et al. 2025; Fang et al. 2022; Mehra et al. 2024; Zhao et al. 2024; Yi et al. 2025）、自身免疫性疾病（Dörner et al. 2017; Cong et al. 2024; Leeuw et al. 2025）和传染病（Cunningham et al. 2021）中得到越来越多的应用。传统上，纳米抗体是通过免疫骆驼科动物（例如，羊驼）或鲨鱼（Pardon et al. 2014）获得的。然而，这种方法受到抗原毒性、不稳定性或在非生理条件下（例如，低pH值、完全配位状态）捕获特定构象状态的需求的限制。体外选择平台（Xia et al. 2025; McMahon et al. 2018; Zimmermann et al. 2018; Doshi et al. 2014; Kondo et al. 2021）通过使用编码具有随机CDR区域的合成库来克服这些限制。其中，核糖体展示（Zimmermann et al. 2018）特别吸引人，因为它能够在小体积内实现非常高的库多样性（10^12—10^13）。纳米抗体在结构生物学中特别有价值，因为它们能够识别构象表位（Li et al. 2021; Yao et al. 2021; Li et al. 2022; 2022），从而稳定不同的功能状态（Rasmussen et al. 2011; Schoof et al. 2020; Redrado-Hernández et al. 2024; Irobalieva et al. 2023; Kirchhofer et al. 2010）并促进结构确定。此外，纳米抗体可以作为结晶伴侣，有助于结晶包涵（Löw et al. 2013），这对于表面面积有限的膜蛋白尤其有价值。它们还可以作为参考标记，帮助处理缺乏可识别可溶性区域的膜蛋白的冷冻电子显微镜（cryo-EM）数据对齐（Yang et al. 2022）。

为了进一步改善小分子膜蛋白的可视化，开发了Legobody系统（约120 kDa），以增加纳米抗体-靶标复合物的有效分子量（Wu and Rapoport 2021; Kang and Chen 2023; Lin et al. 2025）。然而，这种方法的实用性目前受到与广泛使用的Seeger核糖体展示库（Zimmermann et al. 2018; Ackle et al. 2025）不兼容的限制，这些库中的纳米抗体构建缺乏Legobody结合所需的C末端His标签。因此，需要额外的亚克隆步骤，这成为高通量筛选的瓶颈。在这里，我们通过设计一种与Legobody组装具有内在兼容性的核糖体展示纳米抗体库来解决这一限制。具体来说，我们在库支架中引入了一个C末端His标签，并重新设计了序列多样性，目的是将结合位点向CDR3/1区域移动。我们对耐热绿色荧光蛋白（TGP）和钙调蛋白进行了sybody选择，证明修改后的库支持高效的结合剂发现。我们还证明这些sybodies无需重新工程化即可与Legobody结合。该库不仅为纳米抗体发现提供了有用的资源，还为选择适合通过cryo-EM进行结构研究的Legobody兼容结合剂提供了有效途径。

2 材料与方法
2.1 库构建
编码CDR区域中最常见残基的纳米抗体的DNA（详见正文）被合成并亚克隆到pRDV5载体中（Li et al. 2024）。这个质粒被称为pRDV5-Nb，用作模板，使用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶（Cat. M0530L，New England Biolabs）或PrimeSTAR Max DNA聚合酶（Cat. R045A，Takara）扩增以下三个片段：片段1包含T7启动子、核糖体结合位点和纳米抗体的框架1（纳米抗体包含4个由三个CDR区域分隔的框架区域），使用引物对5’-Flank-F（5’-CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3’）和FW1-R（5’-CCCTGACGCTGCGCATGATAA C-3’）进行扩增；片段2包含框架3，使用引物对FW3-F（5’-TACGCTGATAGCGTGAAAGG-3’）和FW3-R（5’-ATGCATGGTCTCACAGCTGTATCTTCTGGTTTTAATGAG-3’）进行扩增；片段3包含框架4、用于legobody组装的短连接子（Wu and Rapoport 2021）（SLEHHHHHH）、tolA序列（用于核糖体停滞）和BspQI切割位点，使用引物对FW4-F（5’-GGCCAGGGTACTCAAGTCAC-3’）和TolA-R1（5’-CAGCAGCTATAGCTCTTCAAAACCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCAGTTGCCGCTTTCTTG-3’）进行扩增。这些片段通过凝胶纯化（Cat. 28706，Qiagen）并用作后续组装步骤中的巨引物。

根据我们的设计，在CDR和juxta-CDR区域含有所需三核苷酸的单链DNA（ssDNA）从GeneScript定制订购。这些ssDNA分别称为rCDR1、rCDR2、rCDR3，包含半随机化的CDR1/2/3序列以及与上述三个片段重叠的侧翼区域。使用三个引物通过PCR反应将片段1与ssDNA rCDR1组装，得到名为F-CDR1的片段。5’引物与片段1的5’端（5’-Flank-F）退火。第一个3’引物FW2-R（5’-ATGCATGGTCTCACCCATTCGCGCTCCTTCCGGAGCTTGACGAAACC-3’）与rCDR1的3’端退火，并引入框架2和用于后续连接的IIS型限制位点。第二个3’引物Link1-R是FW2-R的截短版本，共享FW2-R 3’端的21个核苷酸。在PCR反应中，引物5’-Flank-F和Link1-R的最终浓度为1 μM，而FW2-R引物的浓度为25 nM。片段1和rCDR1的最终浓度分别为50 nM和25 nM。

片段2和rCDR2使用引物对（每种1 μM）Link1-F（5’-GAATGGGTGAGACCATGCATGAAGACCTTGGGTTGC-3’）和FW3-R连接在一起，得到名为F-CDR2的片段。片段2和rCDR2的最终浓度分别为50 nM和25 nM。片段3和rCDR3使用引物对（每种1 μM）Link2-F（5’-GTGAGACCATGCATTATATCGAAGACCTGCTGTTTACTACTG-3’）和TolA-R2（5’-CAGCAGCTATAGCTCTTCAAAACCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCAGTTGCCGCTTTCTTG-3’）连接在一起。片段3和rCDR3的最终浓度分别为50 nM和25 nM。

F-CDR1、F-CDR2和F-CDR3通过3%（w/v）琼脂糖凝胶分析纯度。DNA片段分别使用PCR-clean试剂盒（F-CDR3）或凝胶纯化（其他两个）。F-CDR1（2 μg）和F-CDR2（2 μg）分别用BsaI和BbsI消化，然后凝胶纯化，并连接得到1.2 μg的名为CDR1—2的片段。使用300 ng的该片段和每种0.8 μM的引物对5’-Flank-F和FW3-R进行PCR反应，扩增得到75 μg的CDR1—2。CDR1—2（65 μg）再次用BsaI消化，纯化后与F-CDR3（68 μg）连接，后者用BbsI消化，得到11 μg的DNA产物，其中包含所有功能单元（T7启动子、核糖体结合位点、纳米抗体编码开放阅读框、间隔区和用于核糖体停滞的TolA）。最后，使用10 μg的片段和引物对5’-Flank-F和TolA-R2进行5-mL PCR反应（PrimeSTAR Max DNA聚合酶，Cat. R045A，Takara），得到92 μg的DNA。50微克的DNA用BspQI消化，以去除含有大约200 bp的间隔区反向互补序列的无意DNA片段。通过凝胶纯化得到48 μg的DNA。

DNA（10 μg）使用RiboMAX™大规模RNA生产系统（Cat. P1300，Promega）转录。产物使用RNeasy Mid Kit（Cat. 75144，QIAGEN）纯化，得到200 μL总体积中的360 μg mRNA。mRNA产物在−80°C下以2.7-μL的体积分装保存。

2.2 TGP的表达和纯化
耐热绿色荧光蛋白（TGP）（Cai et al. 2020）在大肠杆菌中表达为C末端带有His标签的蛋白质。携带pETSG（Cai et al. 2019）的BL21（DE3）细胞在OD600为0.6–0.8时，在20°C下用1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导18小时。细胞通过离心收集，并悬浮在含有150 mM NaCl、50 mM Tris–HCl pH 8.0的裂解缓冲液中，然后用高压均质器破坏细胞。裂解液在4°C下以20,000 × g离心30分钟。上清液与1 mL Ni–NTA树脂在4°C下温和搅拌2小时。树脂装入重力柱，并用20柱体积（CV）的Wash缓冲液（20 mM咪唑在裂解缓冲液中）洗涤。TGP用300 mM咪唑洗脱。

2.3 钙调蛋白的表达和纯化
钙调蛋白（Uniprot ID P62162）的编码序列被合成（Azenta），用BamHI/KpnI消化并连接到载体p3EC（Cai et al. 2019）中，作为C末端带有His标签的蛋白质。携带该质粒的BL21(DE3)细胞在OD₆₀₀为0.6–0.8时用1 mM IPTG诱导，并在20°C下生长18小时。细胞通过离心收集，并悬浮在裂解缓冲液（150 mM NaCl、50 mM Tris–HCl pH 8.0、10 mM CaCl₂）中，然后在冰上用超声波破坏细胞。裂解液在4°C下以48,000 × g离心30分钟。上清液与1 mL Ni–NTA树脂在4°C下温和搅拌2小时。树脂装入重力柱，并用20 CV的Wash缓冲液（20 mM咪唑在裂解缓冲液中）洗涤。TGP用300 mM咪唑洗脱。

2.4 sybodies的表达和纯化
sybodies含有来自库设计的六组氨酸标签，并在大肠杆菌中表达，C末端还带有由载体pSb-init（Zimmermann et al. 2018）编码的Myc和His标签。携带这些质粒的MC1061细胞过夜培养后，以1:100的比例接种到含有25 μg/mL氯霉素的50 mL terrific肉汤（TB）中。细胞在37°C培养箱中培养2小时。然后温度降至22°C以减缓细胞生长。细胞在OD600为0.6–0.8时用0.02%(w/v)阿拉伯糖诱导17小时。细胞通过离心收集，并悬浮在TES缓冲液（20%(w/v)蔗糖、0.5 mM EDTA和200 mM Tris–HCl pH 8.0）中，并在4°C下旋转30分钟进行脱水。脱水后的细胞用2 mL冰冷的MilliQ H2O在4°C下重新水化1小时。通过离心在4°C下以20,000 × g收集胞外液。上清液被调整至含有150 mM NaCl、5 mM MgCl2和20 mM咪唑的浓度，然后与0.2 mL Ni–NTA树脂在4°C下混合并轻轻旋转1小时。树脂被装入重力柱中，并用20 CV的洗涤缓冲液（20 mM咪唑、150 mM NaCl、20 mM Tris–HCl pH 8.0）洗涤，之后用300 mM咪唑洗脱。

2.5 Fab_8D3_2的表达和纯化
编码Fab_8D3_2轻链和C端带有His标签的重链的基因分别插入pDEC载体中（Li等人，2021；2024）。每毫升含有2.0×10^6个Expi293细胞，使用线性聚乙烯亚胺（3 mg/L）将两种质粒以最终浓度0.5 mg/L转染到细胞中。为了增强表达，在转染后10至12小时之间加入丁酸钠至最终浓度10 mM。细胞在培养瓶中继续培养60小时。通过离心从培养基中收集分泌的Fab蛋白，然后通过0.22 μm过滤器过滤。得到的上清液被调整至含有5 mM咪唑、150 mM NaCl和50 mM Tris–HCl pH 8.0的浓度，随后与Ni Sepharose（目录号17371202，Cytiva）一起孵育过夜。混合物被装入重力柱中，用含有10 mM咪唑的20 CV缓冲液（150 mM NaCl、20 mM Tris–HCl pH 8.0）洗涤，最后用300 mM咪唑在缓冲液中洗脱。洗脱液被分装，迅速冷冻在液氮中，并在-80°C下保存直至使用。

2.6 MBP_PrAC的表达和纯化
编码与Protein A/C融合的麦芽糖结合蛋白（MBP）的DNA片段（MBP_PrAC）（Wu和Rapoport 2021），其C端带有8×His标签，被插入p3EC载体中（Cai等人，2019）。携带该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37°C下培养，在摇床中以220 rpm的速度培养，直到OD600达到0.6。细胞在37°C下用1 mM IPTG诱导4小时。收集细菌沉淀物，重新悬浮在裂解缓冲液（400 mM NaCl、20 mM Tris–HCl pH 7.5）中，加入5 mM MgCl₂、10 μg/mL DNase I和1 mM PMSF，然后用匀浆器破碎。在25,000×g下离心30分钟以去除细胞碎片后，将裂解液与预先用裂解缓冲液平衡的Ni–NTA树脂混合。在4°C下进行批量结合3小时后，树脂珠子用20 CV的缓冲液A（150 mM NaCl、20 mM Tris–HCl pH 8.0）洗涤，最后用300 mM咪唑在缓冲液A中洗脱。洗脱液被分装，迅速冷冻在液氮中，并在-80°C下保存直至使用。

2.6 MBP_PrAC的表达和纯化
编码与Protein A/C融合的麦芽糖结合蛋白（MBP）的DNA片段（MBP_PrAC）（Wu和Rapoport 2021），其C端带有8×His标签，被插入p3EC载体中（Cai等人，2019）。携带该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37°C下培养，在摇床中以220 rpm的速度培养，直到OD600达到0.6。细胞在37°C下用1 mM IPTG诱导4小时。收集细菌沉淀物，重新悬浮在裂解缓冲液（400 mM NaCl、20 mM Tris–HCl pH 7.5）中，加入5 mM MgCl₂、10 μg/mL DNase I和1 mM PMSF，然后用匀浆器破碎。在25,000×g下离心30分钟以去除细胞碎片后，将裂解液与预先用裂解缓冲液平衡的Ni–NTA树脂混合。在4°C下进行批量结合3小时后，树脂珠子用20 CV的缓冲液A（150 mM NaCl、20 mM Tris–HCl pH 8.0）洗涤，随后用300 mM咪唑在缓冲液B（150 mM NaCl、20 mM HEPES pH 7.5）中洗脱。洗脱液进一步通过Superdex 200 Increase 10/300 GL柱进行尺寸排阻色谱纯化，使用含有5%（v/v）甘醇的缓冲液B。收集峰部分，迅速冷冻在液氮中，并在-80°C下保存直至使用。

2.7 Legobody和TGPTGP的Pull-down
将Legobody组分与TGP: sybody: MBP_PrAC和Fab_8D3_2的摩尔比为2:1.5:1.5混合，并在冰上孵育1小时。混合物在4°C下与淀粉样蛋白树脂一起孵育1小时并轻轻旋转。树脂用10 CV的缓冲液C（150 mM NaCl、50 mM Tris–HCl pH 8.0）洗涤以去除未结合的蛋白质，然后用20 mM麦芽糖在缓冲液C中洗脱。洗脱液通过SDS-PAGE分析以检查复合物的形成。

2.8 TGP和钙调蛋白的生物素化
为了便于选择sybody，将Avi标签（GLNDIFEAQKIEWHE）融合到TGP或钙调蛋白的C端。所得构建体（TGPavi/calmodulinavi）使用上述相同的方法进行表达和纯化。对于生物素化，将1 mL纯化的TGPavi/calmodulinavi（浓度为3 mg/mL）与0.17 mg/mL的生物素连接酶BirA、5 mM ATP、10 mM醋酸镁、0.16 mM生物素在4°C下孵育16小时。生物素化的TGPavi和钙调蛋白avi通过Superdex 200 10/300 GL柱进行凝胶过滤，流动相含有150 mM NaCl、20 mM Tris–HCl pH 8.0。对于TGPavi，收集493 nm（A493）吸光度的部分，并使用A493和摩尔消光系数64,500 M−1 cm−1确定浓度。钙调蛋白avi的浓度使用A280和摩尔消光系数2,980 M−1 cm−1确定。收集的部分被分装，迅速冷冻在液氮中，并在-80°C下保存直至使用。

2.9 Sybody的选择
Sybody的选择过程包括核糖体展示、噬菌体展示和单克隆筛选。使用PUREfrex 2.1试剂盒（目录号PF213—0.25-EX，Genefrontier）和二硫键异构酶DSbC（DS补充剂，目录号PF005—0.5-EX，Genefrontier）按照制造商的说明进行体外翻译反应，反应混合物中含有4.8 μg mRNA。反应混合物稀释至100 μL冰冷的筛选溶液中，该溶液含有150 mM NaCl、50 mM醋酸镁、0.5%（w/v）BSA、0.1%（w/v）Tween 20、0.5%（w/v）肝素、1 μL RNaseIn（RNase抑制剂；目录号N2611，Promega），然后在4°C下以20,000×g离心5分钟。上清液在冰上与50 nM生物素化的TGPavi/calmodulinavi孵育20分钟。通过向溶液中加入12 μL链霉亲和素珠子（Dynabeads MyOne Streptavidin T1；目录号65601，Invitrogen）进行Pull-down步骤。mRNA用EDTA和酵母RNA从珠子上洗脱。回收的mRNA使用引物（5′-CTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCTTG-3′）进行逆转录。所得cDNA文库使用以下引物对进行PCR扩增：5′-ATATGCTCTTCTAGTCAAGTACAGTTAGTAGAAAGTGGTGGTGG-3′和5′-TATAGCTCTTCATGCTGCGCTATGATGATGATGATGATGCTC-3′。PCR产物通过凝胶纯化，用BspQI消化后连接到用相同酶消化的pDX-init载体上。连接产物通过电穿孔法转入E. coli SS320感受态细胞中。噬菌体颗粒的生成和筛选如前所述（Li等人，2021）。简要来说，第一轮噬菌体展示是通过在涂有60 nM中性亲和素（目录号31000，Thermo Fisher Scientific）的96孔板的47个孔中孵育4.7 mL预先混合了50 nM生物素化的TGPavi/calmodulinavi的噬菌体颗粒来进行的。结合的噬菌体颗粒用胰蛋白酶洗脱后扩增，用于第二轮噬菌体展示。为此，将100 μL预先与50 nM生物素化的TGPavi/calmodulinavi孵育的噬菌体颗粒与12 μL链霉亲和素C1珠子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1；目录号65001，Invitrogen）混合。在用5 μM非生物素化的TGPavi/calmodulinavi处理以去除高离率结合物后，噬菌体颗粒被回收用于感染E. coli SS320细胞。整个筛选过程在含有0.1%（w/v）Tween 20、150 mM NaCl、50 mM Tris–HCl pH 7.4的缓冲液中进行的。富集的sybody文库使用片段交换（FX）克隆方法亚克隆到pSb-init载体中，并转入E. coli MC1061中进行单克隆表达和纯化。

2.10 酶联免疫吸附测定（ELISA）
为了在单克隆水平上筛选TGP结合物，sybody按照以下步骤表达和提取。携带pSb-init-sybody质粒的MC1061单克隆接种到含有25 μg/mL氯霉素的1 mL TB培养基中，培养在2.2 mL的96孔板中。细胞在37°C、300 rpm下培养5小时，然后以1:20的稀释比例接种到新的96孔板中。在37°C下培养2小时后，温度降至22°C，细胞再培养1.5小时，然后用0.02%（w/v）阿拉伯糖诱导。16小时后，细胞在3,345×g下离心30分钟。细胞沉淀物用含有0.5 μg/mL溶菌酶、20%（w/v）蔗糖、0.5 mM EDTA和50 mM Tris–HCl pH 8.0的缓冲液重新悬浮，并在室温下摇动30分钟。悬浮液用含有150 mM NaCl、1 mM MgCl2和50 mM Tris–HCl pH 7.4的缓冲液稀释900 μL。通过离心在3,345×g下分离胞质提取物。上清液在冰上与50 nM生物素化的TGPavi/calmodulinavi孵育20分钟。通过向溶液中加入12 μL链霉亲和素珠子（Dynabeads MyOne Streptavidin T1；目录号65601，Invitrogen）进行Pull-down步骤。mRNA用EDTA和酵母RNA从珠子上洗脱。回收的mRNA使用引物（5′-CTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCTTG-3′）进行逆转录。所得cDNA文库使用以下引物对进行PCR扩增：5′-ATATGCTCTTCTAGTCAAGTACAGTTAGTAGAAAGTGGTGGTGG-3′和5′-TATAGCTCTTCATGCTGCGCTATGATGATGATGATGATGCTC-3′。PCR产物通过凝胶纯化，用BspQI消化后连接到用相同酶消化的pDX-init载体上。连接产物通过电穿孔法转入E. coli SS320感受态细胞中。噬菌体颗粒的生成和筛选如前所述（Li等人，2021）。首先，将4.7 mL预先与50 nM生物素化的TGPavi/calmodulinavi混合的噬菌体颗粒与96孔板中的47个孔中的60 nM中性亲和素孵育，进行第一轮噬菌体展示。结合的噬菌体颗粒用胰蛋白酶洗脱后扩增，用于第二轮噬菌体展示。为此，将100 μL预先与50 nM生物素化的TGPavi/calmodulinavi孵育的噬菌体颗粒与12 μL链霉亲和素C1珠子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1；目录号65001，Invitrogen）混合。在用5 μM非生物素化的TGPavi/calmodulinavi处理以去除高离率结合物后，噬菌体颗粒被回收用于感染E. coli SS320细胞。整个筛选过程在含有0.1%（w/v）Tween 20、150 mM NaCl、50 mM Tris–HCl pH 7.4的缓冲液中进行的。富集的sybody文库使用片段交换（FX）克隆方法亚克隆到pSb-init载体中，并转入E. coli MC1061中进行单克隆表达和纯化。

2.10 酶联免疫吸附测定（ELISA）
为了在单克隆水平上筛选TGP结合物，sybody按照以下步骤表达和提取。携带pSb-init-sybody质粒的MC1061单克隆接种到含有25 μg/mL氯霉素的1 mL TB培养基中，培养在2.2 mL的96孔板中。细胞在37°C、300 rpm下培养5小时，然后以1:20的稀释比例接种到新的96孔板中。在37°C下培养2小时后，温度降至22°C，细胞再培养1.5小时，然后用0.02%（w/v）阿拉伯糖诱导。16小时后，细胞在3,345×g下离心30分钟。细胞沉淀物用含有0.5 μg/mL溶菌酶、20%（w/v）蔗糖、0.5 mM EDTA和50 mM Tris–HCl pH 8.0的缓冲液重新悬浮，并在室温下摇动30分钟。悬浮液用含有150 mM NaCl、1 mM MgCl2和50 mM Tris–HCl pH 7.4的缓冲液稀释900 μL。胞质提取物在3,345×g下离心30分钟。混合物再次在3,000×g下离心30分钟，所得上清液直接用于ELISA或荧光检测尺寸排阻色谱（FSEC）分析。对于ELISA，将5 μg/mL的蛋白质A稀释在PBS缓冲液中，与F96 MaxiSorp nunc-immuno板（目录号442404，Thermo Scientific）在4°C下孵育过夜。板子每次用125 μL TBS（150 mM NaCl、20 mM Tris–HCl pH 7.4）洗涤一次，并用0.5%（w/v）BSA在TBS缓冲液中在室温（RT）下封闭30分钟。板子用TBS洗涤三次后，与抗-Myc抗体（目录号M4439，Sigma）在TBS-BSA-T缓冲液（TBS中加入0.5%（w/v）BSA和0.05%（v/v）Tween 20）以1:2,000的比例结合。20分钟后，板子用TBS-T（0.05%（v/v）Tween 20洗涤三次。加入上述Myc标记的sybody提取物并在室温下孵育20分钟。之后用TBS-T洗涤三次，然后向每个孔中加入生物素化的钙调蛋白或TGP（作为对照），最终浓度为50 nM。20分钟后孵育，板子用TBS-T洗涤三次，然后加入streptavidin-HRP结合物（目录号S2438，Sigma）在TBS-BSA-T缓冲液中以1:5,000的比例孵育。20分钟后，板子用TBS-T洗涤三次，然后用TBS-T洗涤三次。ELISA信号（在650 nm处的吸光度）使用板式微孔读数仪测量。

2.11 FSEC测定用于筛选TGP结合物
对于FSEC测定，将50 μL上述胞质提取物与0.25 μM的TGP混合并在冰上孵育30分钟。将1微升混合物加载到连接到Shimadzu高效液相色谱（HPLC）机器上的Sepax Zenix-C SEC-300柱上，该机器配备有荧光检测器（RF-20A，Shimadzu），激发/发射波长为482/508 nm。流动缓冲液含有150 mM NaCl和50 mM Tris–HCl pH 8.0。使用含有无关sybody的TGP样品作为阴性对照。

2.12 生物层干涉测量法（BLI）
使用Octet系统通过生物层干涉测量法（BLI）确定TGP和sybody之间的结合动力学。将生物素化的TGP通过孵育与1 μg/mL TGPavi（稀释在含有0.005% Tween20、150 mM NaCl、50 mM Tris pH 8.0的Blank Buffer中）固定在链霉亲和素涂层的传感器上（目录号18—5019，ForteBio）。传感器首先在Blank Buffer中孵育以进行基线平衡。然后将传感器浸泡在含有不同浓度sybody的Blank Buffer中以进行结合，随后在Blank Buffer中孵育以进行解离。所有动力学数据使用Octet Analysis Studio 13.0.3.52（Sartorius）和1:1结合模型进行处理，该模型假设固定抗原和分析物（Sybody）之间具有可逆的双分子相互作用。拟合基于以下方程：d[AB]/dt = kon × [A](t) × [B] − koff × [AB](t)，[AB](0) = 0，其中[AB](t)是时间t时结合表面的复合物摩尔浓度；[A](t)是时间t时分析物的摩尔浓度；[B]是可用固定配体的摩尔浓度；kon是结合速率常数（M−1 s−1）；koff是解离速率常数（s−1）。

2.13 下一代测序（NGS）样品制备和测序
为了生成NGS测序的适配子序列和条形码，使用20 ng的原始DNA文库作为PCR模板。第一次PCR使用引物对P5-F（5′-GACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATATCCATGGGTAGTCAAGTACAG-3′）和P7-R（5′-CATGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCCATATAAAGCTTTGCG-3′）进行。第二次PCR使用引物对P5-F2（5′-AATGATACGGCGACCACGGAGATCTACACCTCCATCGAGACACTCTTTCCCTACACG-3′）和P7-R2（5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTCGCATGGTGACTGGAGTTCAG-3′）进行。所得片段通过凝胶纯化（目录号740609，Macherey Nagel），并使用Illumina NovaSeq X Plus系统以150 bp（PE150）模式进行测序。

2.14 NGS数据处理
原始Illumina NovaSeq X Plus PE150读段通过fastp（Chen等人，2018）进行质量过滤和适配子修剪。sybody序列使用由原始nanobody模板构建的定制文库进行注释，使用MIXCR v3.0.3。基于CDR1和CDR3区域进行克隆型组装。序列信息用于后续的绘图和分析。

3 结果
3.1 合成nanobody文库的设计和验证
原则上，如果化学空间无限，例如三个CDR的所有可能组合，可以保证获得结合物。然而，即使是最大的展示平台（例如mRNA展示，达到10^13–10^14）的实际多样性也远远低于完全随机文库的理论多样性。例如，仅包含15个完全随机残基的文库的理论多样性约为3.3×10^19。因此，半随机化策略对于创建可管理的文库大小同时最大化有意义的多样性至关重要。这涉及选择性地随机化每个CDR位置，并根据特定的氨基酸偏好进行随机化。我们的设计基于我们之前从Seeger Concave文库中筛选合成nanobody（sybody）的成功经验（Zimmermann等人，2018；Yue等人，2024；Li等人，未注明日期）。该文库具有短的7残基CDR3，并设计了一个稳定的疏水核心，以形成凹形结合位点（Zimmermann等人，2018），非常适合识别凸形表位。对凹形sybody-抗原复合物结构的分析揭示了几个关键特征。首先，与天然存在的纳米体相比，后者通常严重依赖CDR3来识别抗原（图1a），凹形sybodies的结合位点（paratope）更偏向CDR1和CDR2区域（图1b）。这很可能是由于CDR3较短以及在Seeger文库中随机化程度有限（Zimmermann等人，2018年）直接导致的，其中只有三个核心CDR3残基和两个侧翼残基被随机化。其次，与一些天然纳米体不同（图1c），凹形sybodies的CDR1前半部分不与抗原结合（图1d）。这与原始文库设计一致，其中这些侧翼和CDR1残基是固定的（Zimmermann等人，2018年），以保持凹形结构。

图1
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S1.0文库的设计与验证。a,b 抗原（浅灰色卡通图）和纳米体（黄色卡通图，CDR区域标有颜色）的整体结构。使用PDB条目7PHP（a）（Bloch等人，2021年）和6LZ2（b）（Cai等人，2020年）进行分析。参与抗原-抗体结合的残基以棍状表示。黑色虚线表示3.4 Å范围内的氢键或盐桥。c,d 抗原（浅灰色表面）和纳米体（黄色卡通图，CDR区域标有颜色）的整体结构。球体代表参与抗原结合的关键残基。使用PDB条目7F5G（c）（Li等人，2022年）和6LZ2（d）（Cai等人，2020年）进行分析。e 凹形文库和S1.0文库的序列比对。CDR区域用括号标出，并用不同颜色区分。CDR残基和侧翼区域的随机化残基用粗体字符标出并标有颜色。随机化位置下划线标出。非大写字母表示随机化组成。f （e）中随机化位置的氨基酸组成。g 下一代测序（NGS）观察到的氨基酸频率（O，观察值）与预期设计（E）的比较。残基编号与（e）一致。h 小提琴图显示潜在钙调蛋白结合物的ELISA信号比率。比率计算为存在Ca2⁺时的ELISA信号除以不存在Ca2⁺时的信号（使用EGTA/EDTA）。仅绘制信号比率大于1.5的克隆。上虚线、中虚线和下虚线分别代表群体的第25百分位、中位数和第75百分位。使用非配对双尾t检验评估统计显著性。

基于这些观察结果，我们设计了一个新的文库（称为S1.0），对Seeger（Zimmermann等人，2018年）框架进行了修改（图1e），目的是将结合位点向CDR3/1侧移动。首先，CDR3的长度增加了一个残基，并且CDR3及其侧翼区域的随机化位置数量设置为七个。其次，CDR1及其侧翼区域的随机化残基数量也增加到了七个。第三，通过将一个完全随机化的位置（除了半胱氨酸和脯氨酸之外的所有氨基酸）改为有限随机化，减少了CDR2区域的多样性（图1e，1f）。这个位置被观察到会与抗原接触，因此限制为一个小的、灵活的残基（丝氨酸）和三个体积较大的残基（酪氨酸、精氨酸和谷氨酸），以多样化表面形状（图1f）。

这个S1.0设计包括19个随机化位置。如果完全随机化，其理论多样性将达到约5.2×10^24，远超过核糖体展示的实际限制（10^12–10^13）。因此，我们在几个位置实施了有限的变异性（图1f）。通常，体积较大的残基被富集在预期远离表位的位置，以增加接触抗原的可能性，残基的选择基于在天然纳米体中观察到的天然氨基酸频率。最终设计的理论多样性为10^18，与Seeger凹形文库（Zimmermann等人，2018年）相当。

该文库是通过一系列重叠PCR、IIS型限制性内切酶消化和T4 DNA连接构建的（见方法部分）。为了评估构建的文库是否忠实地捕获了设计的序列多样性，我们对原始的S1.0 DNA文库进行了下一代测序（NGS），重点关注CDR1和CDR3区域。我们获得了大约9×10^7个读段，其中98%是独特序列。

对于CDR1区域，所有32个设计的随机化组合（图1e，f）都得到了体现。其中，23个组合与预期分布非常吻合（差异<10%）。两个组合显示出中等程度的差异（10%-13%），而其余六个组合显示出较大的差异（24%-55%）（图1g，表S1）。在CDR3区域，97个设计的随机化组合中，46%（45个组合）的频率与设计值相差在10%以内，34个组合的差异在10%-20%之间，18个组合的差异大于20%（图1g，表S1）。

总的来说，S1.0文库在很大程度上保留了预期的序列组成，显示出对原始设计的高度忠实度。

3.2 对sybodies进行钙调蛋白筛选
为了评估S1.0文库的性能，我们同时使用S1.0文库和基准Seeger凹形文库（Zimmermann等人，2018年）对sybodies进行了钙调蛋白的筛选。经过一轮核糖体展示后，再进行两轮噬菌体展示，然后通过ELISA筛选单个克隆。为了选择特异性结合Ca2⁺结合态钙调蛋白的结合物，在10 mM EDTA-EGTA存在下进行了平行ELISA。如果ELISA信号比率（Ca2⁺条件/EDTA-EGTA条件）超过1.5，则认为克隆为阳性。

从每个文库中随机选取了96个克隆进行ELISA评估。S1.0文库产生了45个阳性克隆，而Seeger凹形文库产生了61个阳性克隆（图1h，图S1）。尽管S1.0文库的阳性克隆率略低，但其信号比率在统计上显著高于基准文库（图1h）。这些结果表明S1.0文库的质量与已建立的基准文库相当。

3.3 对合成纳米体进行TGPTGP的筛选
TGPTGP使用BirA酶在工程化的Avi标签上进行酶法生物素化。通过凝胶迁移率测定评估标记效率。与链霉亲和素孵育后，BirA处理的TGP的Coomassie染色条带（图2a的Lane 3）和荧光条带（图2b的Lane 2）完全发生了移动，原来的条带消失了，出现了两条新的条带（图2a的Lane 4；图2b的Lane 3）。上面的条带迁移大约在78 kDa，可能对应于一个TGP分子（约25 kDa）结合到一个链霉亲和素四聚体上，后者在52-60 kDa范围内呈模糊条带（图2a的Lane 5）。下面的条带迁移大约在58 kDa，可能代表一个TGP结合到一个SDS诱导的链霉亲和素二聚体上。

图2
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TGP的生物素化用于sybody筛选。a TGP生物素化的SDS-PAGE分析。凝胶使用Coomassie染色。Lane 1，带有分子量标记的宽范围标记；Lane 2，自制标记；Lane 3，生物素化的TGP；Lane 4，与链霉亲和素孵育的生物素化TGP；Lane 5，链霉亲和素。
b TGP生物素化的凝胶内荧光分析。Lane 1，带有理论分子量标记的自制荧光标记；Lane 2，生物素化的TGP；Lane 3，与链霉亲和素孵育的生物素化TGP；Lane 4，链霉亲和素。

在纯化核糖体进行体外翻译后，将生物素化的TGP加入混合物中，使TGP能够与仍然与编码mRNA和核糖体复合的新生纳米体结合。然后加入磁性链霉亲和素珠子来沉淀该复合体。从沉淀物中回收的mRNA被逆转录成cDNA，用于后续的噬菌体展示文库筛选。

噬菌体文库在越来越严格的条件下对TGP进行了两轮筛选，筛选溶液中含有高浓度的非生物素化TGP，以排除高解离率的结合物。通过比较噬菌体与TGP包被珠子和负对照蛋白（MBP）的结合情况来监测富集情况。半定量分析显示，经过第二轮噬菌体展示后，富集因子达到了427，表明成功筛选出了特异性结合物。对12个克隆进行Sanger测序，发现了10个独特序列（图3）。

图3
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S1.0文库中针对TGP的sybodies的序列比对。CDR和随机化侧翼位置分别用绿色（CDR1）、青色（CDR2）和品红色（CDR3）标记。非大写字母表示随机化组成，如（图1f）中解释的。残基编号在顶部标出。sybodies按照与S1.0共识序列的相似度从高到低排列（从上到下）。

3.4 TGP sybodies的特性分析
我们表达了10个克隆，并使用荧光检测尺寸排阻色谱法（FSEC）评估了它们与TGP形成复合体的能力。利用TGP的固有荧光，我们在将其注入装有荧光检测器的分析HPLC柱之前，将粗制的周质提取物与TGP混合。所有十个sybodies都与TGP孵育后显示出峰位移动（图4a）。

图4
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筛选出的sybodies的特性分析。a 使用FSEC鉴定TGP结合物。TGP与本研究的sybodies（颜色）或无关纳米体（黑色）混合后使用FSEC进行分析。b-f sybodies与TGP的结合动力学。使用Biolayer干涉测量法（BLI）在各种浓度下（黑色，40 nM；蓝色，20 nM；红色，10 nM；紫色，5 nM）进行测定。数据（实线）使用内置软件（虚线）按照1:1的化学计量比进行拟合。g sybody结合动力学的总结。h sybody-Legobody组装的结构示意图（PDB：7RXC）（Wu和Rapoport，2021年）。识别sybody的Fab（8D3—2）、工程化的麦芽糖结合蛋白（MBP-PrAC）和sybody（Sb）分别用红色、绿色和浅蓝色标记。i 使用SDS-PAGE分析Legobody与S1.0 sybodies的组装。Sybodies与含有MBP蛋白的Legobody组分孵育后，与装载控制（L）一起加载到凝胶上，以比较条带强度。

我们进一步使用生物层干涉测量法（BLI）定量了一部分结合物的结合动力学（图4b-f）。与观察到的峰位移动一致，所有表征的sybodies与TGP的结合亲和力都在纳摩尔范围内。最佳结合物SH2的解离常数（KD）为1.9 nM（图4g）。

3.5 S1.0 sybodies与Legobody的结合
为了研究从S1.0文库中筛选出的sybodies是否可以与Legobody组分组装，我们使用两个代表性的sybodies SH1和SH2进行了沉淀实验。TGP结合的sybodies与含有麦芽糖结合蛋白（MBP）的Legobody组分混合（图4h）。与淀粉样树脂孵育并充分洗涤后，用麦芽糖洗脱结合的蛋白质。洗脱部分与装载控制（所有组分等摩尔比预混合）一起进行SDS-PAGE分析。SH1和SH2在洗脱部分中均被清晰检测到（图4i），表明在抗原TGP存在下成功形成了稳定的sybody–Legobody组装。

4 讨论
纳米体越来越被认为是基础研究和生物医学应用中的强大工具。合成文库相比动物免疫有几个关键优势，包括能够在非生理条件下进行筛选、减少抗原消耗、缩短时间线以及不依赖动物设施。这些文库的整体质量对于成功的纳米体发现至关重要。随着关于纳米体-抗原复合体的结构数据不断增多，文库设计也在不断改进。在这里，我们基于现有凹形sybody复合体的结构观察设计了一个新的文库（S1.0）。

针对两种可溶性蛋白——钙调蛋白和热稳定绿色荧光蛋白（TGP）的验证表明，S1.0文库的表现与基准Seeger凹形文库（Zimmermann等人，2018年）相当，效率和结合物质量也相当。值得注意的是，从S1.0中筛选出的sybodies表现出纳摩尔级的亲和力，并且可以直接与Legobody工具包兼容，无需额外工程化。这种内在的兼容性是一个重要的实际优势，因为它消除了亚克隆步骤，显著提高了生成适合冷冻电镜研究的小分子膜蛋白结合物的通量。

然而，仍然存在一些限制。我们的评估仅针对两种可溶性目标进行，S1.0文库对更具挑战性的膜蛋白目标的稳健性尚未得到验证。此外，尽管NGS分析确认了与设计组成的良好整体忠实度，但某些位置的偏差比预期的大，这可能会微妙地影响文库的多样性。对于合成纳米体文库来说，有效的功能多样性比理论序列多样性更为重要，因为后者最终受到展示系统（例如核糖体或噬菌体拷贝数）的物理限制。未来的纳米抗体库优化应继续在随机化位点的数量与每个位点的随机化程度之间取得平衡，这一过程需结合抗原结合界面中天然氨基酸的使用情况以及经验性选择的结果来进行指导。例如，本研究的测序数据显示，尽管异亮氨酸在设计中的编码频率为20%，但在功能性纳米抗体中其出现频率却明显偏低（仅占29%）。这些观察结果可以为后续库版本的针对性改进提供依据。我们预计，CDR1区域随机化程度的提高将改变抗原结合位点的分布情况，从而与原始的凹形库形成对比。这一假设可以通过对更多S1.0衍生纳米抗体的结构分析来验证。此外，随着来自原始库和富集库的大规模下一代测序（NGS）数据的不断积累，数据挖掘和机器学习方法在指导下一代纳米抗体库设计方面具有巨大潜力。建立用于存储合成纳米抗体库原始测序数据的公共数据库将极大促进这一领域的进展。