弗朗切斯卡·武罗（Francesca Vurro）| 玛丽安娜·米科利斯（Mariana Miccolis）| 朱塞佩·纳特雷拉（Giuseppe Natrella）| 贾科莫·斯克奥（Giacomo Squeo）| 米凯莱·法恰（Michele Faccia）| 弗朗切斯科·卡波尼奥（Francesco Caponio）| 安东内拉·帕斯夸洛内（Antonella Pasqualone）
意大利巴里大学“阿尔多·莫罗”分校（University of Bari “Aldo Moro”）土壤、植物与食品科学系（Department of Soil, Plant and Food Science, DISSPA）
地址：Via Amendola 165/a, 70126 Bari, Italy
**摘要**
干法分离是一种可持续的技术，主要用于从豆类面粉中提取蛋白质浓缩物，该过程能耗低且不消耗水资源。尽管蛋白质浓缩物在烘焙食品中的应用仍然非常有限，但对其消费者接受度的评估却往往被忽视。本研究旨在通过使用干法分离的扁豆蛋白浓缩物（DFLP，蛋白质含量为57克/100克）来改善佛卡恰（focaccia）的营养成分和氨基酸评分，同时探讨其对风味、技术营养特性及消费者接受度的影响。实验设计（DoE）用于分析面团和佛卡恰的表现，并优化配方，其中小麦面粉的比例在60%至100%之间变化，DFLP的比例在0%至40%之间变化。最终确定的最佳配方为用DFLP替代20%的小麦面粉。这种佛卡恰具有“高蛋白质”（蛋白质提供的能量占比超过20%）和“高纤维”（纤维含量超过6克/100克）的特点。DFLP的添加提高了佛卡恰中的赖氨酸含量。强化后的佛卡恰挥发性成分分析显示，其中己醛（hexanal）浓度较高，这种物质通常与豆类特有的气味相关，同时马利亚德反应（Maillard reaction）相关化合物的含量也有所增加。不过，含有20% DFLP的佛卡恰在消费者测试中的接受度较低，尽管其评分尚可，但仍存在改进空间。
**1. 引言**
食品加工将原材料转化为安全且美味的食品，但这一过程可能对环境产生显著影响。主要挑战之一是减少能源和水资源的消耗，以转向更可持续的生产方式，实现联合国粮食及农业组织（FAO）2030年可持续发展议程的目标[1][2]。
扁豆面包是一种历史悠久的主食，在许多地区广泛流行[3][4][5]。与其他烘焙食品相比，扁豆面包更具可持续性，因为其烘焙时间短且形状扁平，便于包装和运输，从而降低了能源消耗。扁豆面包可以填充多种配料，属于无需餐具即可食用的街头食品，进一步减少了水资源浪费[3]。在意大利，一种非常受欢迎的扁豆面包是佛卡恰。这种面包可搭配洋葱、土豆、奶酪或番茄等配料，可构成一顿完整的餐食[6]。佛卡恰因其口感柔软、外皮酥脆以及丰富的风味而受到喜爱。然而，其主要问题在于营养成分，而非技术或感官特性[6]。传统佛卡恰的能量密度较高，且由于使用了精制小麦面粉，导致蛋白质和纤维含量不足[6]。除了可持续性外，扁豆面包还因其多功能性和适应消费者需求的能力而受到重视[7]。当前的趋势之一是强化蛋白质产品，市场对新的蛋白质来源（尤其是植物蛋白）的需求不断增长[8]。蛋白质强化通常通过酸或碱溶液在等电点沉淀的方式获得蛋白质浓缩物或分离物（湿法分离）。另一种方法是干法分离，该方法基于微粒的空气分级，根据其空气动力学特性进行分离，比湿法分离更环保，因为不涉及水和化学物质的使用[9]。
然而，关于在面包制作中使用干法分离豆类蛋白浓缩物的研究仍处于初步阶段，目前仅有一项研究提出在无麸质面包中添加豌豆蛋白[10]，另一项研究则探讨了使用干法分离的鹰嘴豆酸面团发酵剂[11]。尽管这两项研究均表明蛋白质和纤维含量有所提高，但产品的结构性能有所下降。这凸显了在提升营养成分的同时需保证产品质量的必要性。此外，现有文献中缺乏对消费者接受度和偏好的评估，而这一因素对于包含豆类成分的食品改良策略的成功至关重要，尤其是考虑到某些研究指出蛋白质强化可能对风味产生负面影响[12]。此外，尽管干法分离的扁豆蛋白具有宝贵的营养和功能性，但目前尚未有相关研究对其应用进行探索[13]。
在食品开发领域，实验设计（DoE）已被证明可以提高实验效率，减少确定最佳配方所需的试验次数，并提升结果的可靠性和重复性[14]。本研究采用单纯型格子设计（simplex-lattice mixture design）来确定最佳添加量的干法分离扁豆蛋白（DFLP），并评估其对发酵能力、面团流变特性、最终产品质地和气味的影响。DFLP的添加比例范围为0%至40%（重量百分比），以评估其作为功能性成分的潜力。研究旨在解决传统佛卡恰的营养缺陷。研究假设DFLP的添加将提升蛋白质和纤维含量，同时保持可接受的技术性能和感官特性，从而开发出符合消费者需求的佛卡恰。最终选定的最佳配方为DFLP占比20%，并对其进行了全面评估，包括技术营养特性、氨基酸评分、挥发性成分及消费者接受度，与仅使用小麦面粉的传统佛卡恰进行了对比。
**2. 材料与方法**
2.1. **原料**
小麦面粉（Casillo Spa，Corato，意大利，碳水化合物69克/100克；蛋白质11克/100克；脂肪1克/100克；纤维3克/100克）、酵母（Saccharomyces cerevisiae，Mulino Caputo，那不勒斯，意大利）、橄榄油（Olearia De Santis，Bitonto，意大利）和海盐（Com-Sal Srl，佩萨罗，意大利）均从当地零售商处购买。DFLP（碳水化合物14克/100克；蛋白质57克/100克；脂肪1.5克/100克；纤维17克/100克）由Innovaprot srl（Gravina in Puglia，意大利）提供。
2.2. **实验设计与佛卡恰制作**
采用单纯型格子设计来优化小麦面粉与DFLP的比例，研究这两种成分的影响。实验变量的范围为：小麦面粉60%至100%，DFLP 0%至40%。实验结果通过二次数学模型进行建模：
y = b1X1 + b2X2 + b12X1X2
其中y表示实验结果，b1和b2表示线性项系数，b12表示交互项系数。实验点详见表1。
表1. 实验佛卡恰样品的配方
| DFLP含量（克/100克） | 小麦面粉含量（克/100克） | 复制次数 |
|-----------------|-----------------|-------------|-----------------|
| 0 | 90 | 3 | |
| 5 | 60 | 3 | |
| 10 | 80 | 3 | |
| 15 | 70 | 3 | |
| 20 | 100 | 3 | |
| 25 | 60 | 3 | |
| 30 | 70 | 3 | |
| 35 | 60 | 3 | |
| 40 | 70 | 3 | |
| 45 | 60 | 3 | |
| 50 | 70 | 3 | |
| 55 | 60 | 3 | |
| 60 | 70 | 3 | |
| 65 | 60 | 3 | |
| 70 | 60 | 3 | |
| 75 | 60 | 3 | |
| 80 | 60 | 3 | |
| 85 | 60 | 3 | |
| 90 | 60 | 3 | |
佛卡恰的制作方法参照Vurro等人的研究[6]。将面粉、酵母和水混合（使用Bosch MFQ40304搅拌机，德国慕尼黑），搅拌时间为6分钟。随后加入盐和橄榄油（总量的一半），继续搅拌6分钟。面团被手工压平（厚度约1.5厘米），并用环形模具（直径10.8厘米，Tescoma，Cazzago San Martino，意大利）塑形。面团放入预先涂油的金属烤盘中，在35°C和33.5%相对湿度条件下发酵90分钟（Memmert proofer，EN.CO.，Spinea，意大利）。发酵完成后，在佛卡恰表面涂抹20%的橄榄油，然后在200°C的烤箱中烘烤25分钟（Oem Ali Group，Bozzolo，意大利）。每种配方制作了三批样品。
2.3. **面团与佛卡恰的分析**
2.3.1. **发酵测试**
发酵测试参照Canale等人的方法进行，略有修改。将25克面团压入预先涂油的250毫升量筒中，置于35±2°C的培养箱中（Memmert，米兰，意大利）。每隔10分钟记录一次体积变化，持续90分钟（即佛卡恰的发酵时间）。发酵后面团体积的变化百分比计算如下：
[数学处理错误]
所有分析均重复三次进行。
2.3.2. **面团的流变特性**
使用流变仪（HAAKE MARS iQ Air，Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）测量面团的流变特性，该流变仪配备平行板几何结构（P35/Ti 02180932）。实验条件为频率范围0.1-10 Hz，温度25°C，应变值为1.0%，处于线性粘弹性区域（LVR）。分析结果重复三次进行。
2.3.3. **佛卡恰的质地特性**
佛卡恰的质地分析参照Vurro等人的方法[17]，使用ZI.0 TN质地分析仪（ZwickRoell GmbH & Co. KG，乌尔姆，德国），该仪器配备50牛顿的负载传感器和直径36毫米的压缩探头。每个样品切成边长3厘米的立方体，以1毫米/秒的速度压缩两次，每次压缩间隔5秒，压缩过程中样品变形不超过40%。硬度、弹性、咀嚼性和内聚性均重复三次进行测量。
2.3.4. **佛卡恰的感官评价**
感官评价采用定量描述分析（QDA）方法，由十名受过培训的评估人员（5名男性，5名女性，年龄25-60岁）完成，评估过程遵循巴里大学土壤、植物与食品科学系的伦理指南及ISO标准[18]。评估人员为常食烘焙食品的消费者，无食物过敏或不耐受史。测试前进行了预测试，以便让参与者熟悉评估指标。样品随机放置在白色盘子中。评价在室温（20±2°C）下进行，评估室配备独立隔间以确保评估人员之间的隔离。对传统佛卡恰和强化佛卡恰的气味进行强度评分（1表示未感知，9表示强烈感知）。分析结果重复三次进行。
2.3.5. **最佳配方的选择**
在实验范围内选择最佳配方，兼顾技术目标、感官特性和营养目标（最大化蛋白质和纤维含量）。具体而言，综合考虑整体满意度、综合营养指标（蛋白质和纤维含量）以及实验设计参数（如面团发酵体积、流变行为、质地特性和感官质量），最终确定DFLP占比20%的配方为最佳方案。
2.4. **最佳佛卡恰的分析**
2.4.1. **近似成分分析**
水分含量采用AACC 44-01.01方法[19]通过自动水分分析仪（Radwag Wagi Elektroniczne，波兰拉多姆）测定。蛋白质含量（N × 6.25）和脂质含量分别采用AACC 46–11.02方法[19]和AOAC 945.38 F方法[20]测定。总膳食纤维含量采用酶法-重量法（编号991.43[20]）测定。碳水化合物含量是通过从100中减去蛋白质、脂质、纤维和水分含量来确定的。能量值（千卡）是使用转换因子计算得出的，考虑到蛋白质和碳水化合物每克贡献4千卡，脂质每克贡献9千卡，总膳食纤维每克贡献2千卡[21]。分析进行了三次重复。
2.4.2 抗营养化合物
总植酸的含量是使用商业试剂盒（Megazyme International，爱尔兰）通过分光光度法测量的，按照制造商的程序进行。具体来说，1克样品在20毫升0.66 M盐酸中提取，并在室温下避光搅拌过夜。然后，提取物在15000 × g的离心机（Thermo Fisher Scientific，Osterode am Harz，德国）中离心，并用0.5毫升0.75 M氢氧化钠溶液中和。样品在40°C下用植酸酶处理10分钟进行酶促去磷酸化，随后再用碱性磷酸酶处理15分钟。反应用三氯乙酸（50% w/v）终止，上清液用于比色法测定磷酸盐含量。显色过程包括将酶处理后的提取物与新鲜制备的钼酸盐/抗坏血酸试剂混合，然后在40°C下孵育1小时。吸光度在655纳米处读取（Cary 60分光光度计，Cernusco，米兰，意大利）。磷酸盐含量是根据已知的磷浓度通过标准校准曲线计算得出的。分析进行了三次重复。
寡糖（水苏糖、棉子糖和蔗糖）是通过高效液相色谱仪（Agilent Technologies，Santa Clara，美国）测定的，该色谱仪配备了折射率检测器（RID 1260），方法如Vurro等人[6]中所述。具体来说，10毫克样品与5毫升去离子水（ELGA Purelab，High Wycombe，英国）涡旋混合5分钟，然后收集上清液。提取物通过0.22微米醋酸纤维素滤膜（Thermo Fisher Scientific，Monza，意大利）过滤。提取物被注入高效液相色谱仪（Agilent Technologies，Santa Clara，美国），该色谱仪配备了1260 Infinity折射率检测器（Agilent Technologies，Santa Clara，美国）。流动相是去离子水（ELGA Purelab，High Wycombe，英国），在等渗条件下流速为0.8毫升/分钟。固定相是300 × 7.8毫米阳离子交换柱（Rezex RCM柱，Ca2+，8微米，Torrance，CA，美国），温度为80°C。为了鉴定和定量，通过制备水苏糖和棉子糖的水溶液来建立校准曲线（Merck KGaA，Darmstadt，德国）。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为：水苏糖：LOD = 0.009毫克/克，LOQ = 0.027毫克/克；棉子糖：LOD = 0.002毫克/克，LOQ = 0.006毫克/克。分析进行了三次重复。
2.4.3 氨基酸谱
样品的水解是使用Waters Pico-Tag系统（Milford，MS，美国）进行的，方法如Ismail等人[22]所述。使用硼酸盐缓冲液、OPA和FMOC溶液（Agilent，Santa Clara，CA，美国）进行了自动在线预衍生化。单个氨基酸的定量是通过HPLC分析进行的。流动相由（A）10 mM Na2HPO4: 10 mM Na2B4O7，pH 8.2: 5 mM NaN3和（B）丙腈: 甲醇: 水 45:45:10（v/v/v）组成。流速为1.5毫升/分钟。色谱分离是在C18 Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱（4.6毫米 × 150毫米，3微米）（Agilent，Santa Clara，CA，美国）上完成的。柱温设置为40°C，检测使用二极管阵列检测器（DAD）。定量分析是根据通过注射不同浓度氨基酸标准品获得的校准曲线进行的。由于没有脯氨酸和色氨酸的标准品，因此这些氨基酸没有被鉴定和定量。氨基酸评分是根据Yang等人[23]的方法，使用FAO/WHO参考氨基酸模式[24]进行的。分析进行了三次重复。
2.4.4 挥发性化合物
Focaccia样品的挥发性化合物是通过顶空固相微萃取（HS-SPME）提取的，并通过气相色谱/质谱（GC–MS）分析的，方法如Vurro等人[25]所述。样品（0.5克）称重放入玻璃小瓶中，加入4毫升NaCl水溶液（20克/100克）和150微升1-丙醇水溶液（160毫克/千克），作为内标。化合物的挥发通过在40°C下加热50分钟完成，然后吸附到75微米Carboxen/Polydimethylsiloxane（CAR/PDMS） SPME纤维（Supelco，Bellefonte，PA，美国）上。化合物的脱附是在气相色谱仪（6850，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国）的进样口进行的，该色谱仪与质谱仪（5975，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国）相连。分离使用HP-Innowax极性毛细管柱（60米 × 0.25毫米内径 × 0.25微米膜厚度）完成。进样温度设置为250°C。载气使用氦气，流速为1.5毫升/分钟，压力为30千帕。化合物的鉴定使用国家标准与技术研究所（NIST）和Wiley库的参考质谱进行。VOCs的浓度表示为样品的微克/克（LOD=0.02微克/克；LOQ=0.08微克/克）。分析进行了三次重复。
2.4.5 物理性质
样品的外皮和内部的颜色是通过CM-600d分光光度计（Konica Minolta，东京，日本）测定的。进行了五次重复实验。总颜色差异（ΔE）的计算如下：
L*0、a*0和b*0是对照Focaccia的颜色坐标。计算考虑了平均值。Vurro等人[17]报告的ΔE尺度用于评估结果。根据Djordjević等人[26]的方法计算了内部和外皮的增白指数（WI）和褐变指数（BI）与对照Focaccia的比较。
2.4.6 消费者测试
一百五十名消费者（89名女性和61名男性，年龄在18至65岁之间），他们没有食物过敏或不耐受问题，并且是Focaccia和扁豆的常规消费者，对DFLP样品与CTRL Focaccia进行了评价。样品被编码并放在白色盘子中呈现。消费者测试严格遵循巴里大学土壤、植物和食品科学系食品科学与技术实验室制定的伦理指南和内部审查程序。参与者获得了关于研究目的的信息，并从每个人那里获得了书面同意书。他们确认理解参与的自愿性质，并有权随时退出。参与者被要求说明他们是否喜欢每个样品，考虑颜色、气味、质地和整体喜好。喜好程度在1到9的结构化愉悦量表上评分，其中1=极其不喜欢，9=极其喜欢[28]。
2.5 统计分析
实验设计和数据处理是使用Design Expert 12（StatEase Inc., Minneapolis, USA）进行的，该软件还制定了整体满意度。计算了决定系数（R2和R2adj）和统计显著性（p<0.05）。分析结果表示为平均值±标准差（SD）。使用Minitab 21统计软件（Minitab Inc., State College, PA, USA）进行了单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），随后进行了Tukey’s HSD（Honestly Significant Differences）检验和双样本T检验。差异在p < 0.05时被认为是统计显著的。使用GraphPad Prism 10（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）绘制了流变行为图。使用XLSTAT（Addinsoft, New York, USA）进行了偏好图的制作。
3. 结果和讨论
3.1 模型评估和DFLP富集最佳配方的选择
实验面团和Focaccia样品基于与面团质量、烘焙产品的结构质量以及对感官气味轮廓的影响的相关参数进行了分析。响应的回归模型及其统计显著性总结在表2和图1、图3、图4中。R2和调整后的R2的高值验证了二次模型的强大预测能力，表明观察到的实验变异性主要归因于研究因素及其相互作用。
表2. 发酵后体积变化（%）流变参数（弹性模量（G'）和粘度模量（G'')以及频率1 Hz时的tan(δ)，质地参数，嗅觉属性和样品预测模型方程的分析
分析1234567
R2R2 Adjp-value
ΔV150±20a155±14a70±7d75±5d130±8b100±10a0.990.99<0.001
G'4200±100b6440±40a2930±30d2940±50d3280±40c3070±20d6500±100a0.990.98<0.001
G''2200±100b3150±40a1888±6de1828±7e2090±20c1980±40cd3090±20a0.960.94<0.05
tan(δ)0.53±0.01b0.49±0c0.64±0.01a0.62±0.01a0.64±0.01a0.65±0.02a0.49±0.01c0.930.89<0.05
硬度（N）12±2b7.4±0.4c19±3a20±3a11±2bc12.1±0.6b7.3±0.4c0.900.84<0.05
弹性（N）0.94±0.03a0.97±0.02a0.93±0.06a0.92±0.05a0.89±0.04a0.93±0.01a0.96±0.01a0.750.62ns
咀嚼性（N）7±1abc4.8±0.3c8.±2ab9±1ab5.7±0.4bc6.1±0.3bc4.7±0.2c0.770.65ns
内聚性0.61±0.01ab0.66±0.02a0.46±0.05c0.47±0.04c0.58±0.03b0.54±0.01b0.67±0.02a0.980.98<0.001
Focaccia的气味8.00±0.53a8.3±0.5a5±2b5±1b6±1b5.6±0.5b8.4±0.5a0.970.95<0.05
扁豆的气味1.7±0.7c1.1±0.4c7.6±0.9a7±0.7a4.4±0.9b5±1b1.3±0.5c0.980.97<0.05
数据以重复次的平均值±标准差表示。同一行中不同的字母表示显著差异（p < 0.05）。ns = 不显著
下载：下载高分辨率图像（362KB）
下载：下载全尺寸图像
图1. 单纯型-格子混合设计图：(a) 发酵体积变化，(b) 弹性模量（G'），(c) 粘度模量（G''), (d) 频率1 Hz时的tan δ。
下载：下载高分辨率图像（211KB）
下载：下载全尺寸图像
图3. 单纯型-格子混合设计图：(a) 硬度，(b) 弹性，(c) 内聚性，(d) 咀嚼性（N）。
下载：下载高分辨率图像（134KB）
下载：下载全尺寸图像
图4. 单纯型-格子混合设计图：(a) Focaccia的气味，(b) 扁豆的气味。
对于大多数响应变量，决定系数始终显示出较高的值，通常在0.93到0.99之间。Focaccia的质地参数的值略低，这可以合理地归因于样品本身的变异性，而不是模型不足。二次模型突出了系统的非线性行为，这与成分之间可能的复杂相互作用有关，如果在结构层面考虑面团流变性和Focaccia的质地，以及在化学和感官层面考虑气味的发展。DFLP比例的增加导致发酵步骤后面团的体积减小（图1a），这是由于面团保留由S. cerevisiae产生的二氧化碳的能力降低。实际上，添加无麸质面粉的主要问题是破坏了麸质网络，从而导致烘焙产品内部的硬度和咀嚼性增加[29]。对于面团的流变行为，储存（G′）和损失（G′′）模量随着频率的增加而增加（图1b-d）。在实验试验中，G′在整个频率范围内始终高于G′′，表明弹性成分占主导地位（图2）。DFLP的加入导致弹性模量降低，这可以归因于麸质的稀释和混合过程中麸质网络的形成改变。因此，面团变得不那么抗变形且更粘稠，这与Zhou等人的研究结果一致[30]。总体而言，储存和损失模量的值与包括添加替代面粉在内的面包配方中的值一致[30]，[31]。然而，必须认识到这些流变参数受到多种因素的强烈影响，如面粉类型和组成、水分含量、其他成分和加工条件。在这个框架内，观察到的流变变化与之前在富含豆类面粉的小麦面团系统中的发现一致。在这些系统中，G′的降低通常归因于麸质的稀释和麸质网络的部分破坏[31]，[32]，[33]。因此，在本研究中，DFLP的加入可能通过干扰面团的发育而导致了这些效应。豆类蛋白质整合到麸质网络中的能力有限，加上纤维的吸水特性和稀释效应，可能为观察到的粘弹性结构减弱提供了合理的解释[31]，[32]，[33]。通过分析参考频率1 Hz时的tan δ值，所有样品的tan δ值都小于1，表明弹性贡献大于粘性贡献。然而，涉及DFLP添加的实验点显示出显著更高的数值，尤其是在浓度高于20%时，与对照组相比，这表明由于加入了小扁豆蛋白而导致粘度增加。这证实了之前的假设，即以DFLP形式添加纤维和蛋白质改变了面筋网络，从而修改了流变特性。下载：下载高分辨率图像（361KB）下载：下载全尺寸图像图2. 七个实验点对应的面团的流变特性。显示了弹性模量（G′）和损耗模量（G″）作为线性频率（Hz）的函数。总体而言，这些结果突显了非面筋成分（如DFLP）的添加如何通过削弱面团的弹性结构来显著改变其流变行为。添加了DFLP的佛卡夏面包比对照配方更硬、更有嚼劲，并且凝聚力和弹性较低（图3）。硬度与嚼劲呈正相关（R = 0.93），而与凝聚力呈负相关（R = -0.88）。这些结果可能与小扁豆蛋白的作用有关，因为小扁豆蛋白不形成面筋，因此会削弱面筋网络[11] [27] [34]。此外，强化还增加了纤维含量，这也干扰了面团的发育和最终产品的质地[11] [27] [34]。事实上，其他作者在面包制作中用豆类面粉替代小麦面粉也报告了类似的结果[11] [27] [35]。感官分析的结果表明，DFLP的加入显著改变了佛卡夏面包的香气特征（p < 0.05），这是一个在感官可接受性方面被高度重视的属性（图4）。具体来说，所研究的成分掩盖了佛卡夏面包的特征气味，同时引入了小扁豆的气味。这些后者气味通常不被大多数消费者所喜欢[12]，被认为是定义整体感官质量的关键参数。在对结果进行全面评估后，在定义的实验范围内确定了最佳配方，通过协调营养目标（特别是蛋白质和纤维的增强）与技术和感官要求。具体来说，选择最佳配方是在整体满意度最高的基础上，结合了营养声明（蛋白质和纤维含量）以及实验设计的流变、质地和感官参数。目的是最大化积极属性（例如，发酵体积、弹性和佛卡夏面包的特征气味），同时最小化不希望出现的特征（例如，硬度和小扁豆气味）。这种方法符合DoE的原则，旨在减少实验分析的数量，促进更可持续、更高效的时间策略，同时限制努力和环境影响[14]。模型确定了10%至20% DFLP含量的稳健最佳配方范围（图5）。该范围内的样品满意度值>0。总体满意度范围从0到1，较高的值对应于更理想的响应。DFLP含量为20%的样品满意度为0.36，而DFLP含量为10%的样品满意度为0.30。因此，DFLP含量为20%的替代水平被确定为最佳配方，它在提高营养质量的同时确保了良好的技术性能和感官特性。下载：下载高分辨率图像（94KB）下载：下载全尺寸图像图5. 根据单纯形格子混合设计得出的佛卡夏面包满意度图。3.2. 最佳配方的表征及与对照组的比较3.2.1. 原始组成和抗营养化合物佛卡夏面包满足了人们对美味、便宜且易于食用产品的需求[17]，但从营养角度来看，它还有改进的空间，因为它富含碳水化合物而蛋白质和纤维含量较低。DFLP的加入改善了营养状况，因为添加了DFLP的佛卡夏面包的蛋白质和纤维含量是对照组的两倍（表3），从而满足了“高蛋白质”（至少20%的能量来自蛋白质）和“高纤维”（纤维含量高于6克/100克）的营养标准[36]。DFLP的高蛋白质含量（每100克含57克蛋白质）比Gallo等人[37]通过添加天然小扁豆面粉所获得的结果有所进步（每100克含25.2克蛋白质）。使用天然豆类面粉通常需要更高的添加量才能实现适度的营养改善。例如，Vurro等人[6]报告说，需要添加40%的天然豆类面粉才能达到“蛋白质来源”的标准（>12%的能量来自蛋白质），相当于每100克含13.3克蛋白质。同样，Pasqualone等人[27]使用黑鹰嘴豆面粉在面包、佛卡夏面包和披萨饼皮等产品中实现了9.9至10.5克/100克的蛋白质含量。Xing等人[11]研究了在面包配方中添加干法分离的鹰嘴豆蛋白浓缩物（每100克含31克蛋白质，添加量为20-30%）的效果。面包的最终蛋白质含量在14至16克/100克之间，低于本研究的结果。表3. 样品的营养组成和抗营养化合物。营养组成CTRLDFLP-20水分（克/100克）30.5±0.2b34.6±0.4a蛋白质（克/100克）8.1±0.4b16.3±0.2a脂质（克/100克）8.1±0.28.2±0.4纤维（克/100克）4.3±0.5b8.6±0.6a碳水化合物（克/100克）49±2a32±2b能量值（千卡/100克）310±6a283±5b抗营养化合物植酸（克/100克干重）0.070±0.005b0.40±0.01a水苏糖（毫克/克干重）0.38±0.03棉子糖（毫克/克干重）0.38±0.03Raffinose（毫克/克干重）ɤ3.5±0.5LOD = 0.009毫克/克；ɤ LOD = 0.002毫克/克。数据为三次重复实验的平均值±标准差。同一行中的不同字母表示显著差异（p < 0.05）。CTRL = 小麦基佛卡夏面包（对照组）；DFLP-20 = 添加了干法分离小扁豆面粉的佛卡夏面包。DFLP的添加还导致水分含量略有但显著增加，这可能是由于蛋白质和膳食纤维在烘焙过程中的高保水能力所致。较高的水分含量加上较高的纤维含量导致DFLP添加的佛卡夏面包的能量值较低。由于小麦面粉和DFLP的成分相似[16]，因此没有观察到脂质浓度的显著差异。实际上，佛卡夏面包的脂质含量主要来源于橄榄油的添加。其他研究人员[6]在强化豆类成分的佛卡夏面包中也记录了类似的结果，其脂质含量约为8克/100克，能量值约为300千卡/100克。然而，需要注意的是，商业佛卡夏面包通常具有较高的油含量，这是为了提供浓郁的风味[6] [27]。另一方面，添加了DFLP的佛卡夏面包含有一些常见的抗营养化合物，如植酸和RFOs（表3），其浓度与其他研究人员在添加了小扁豆面粉或鹰嘴豆面粉的烘焙食品中报告的浓度相似[38] [39]。植酸会干扰营养素的吸收或利用。它在胃肠道中通过与Fe、Zn和Ca结合来降低它们的生物利用度。然而，与其他豆类相比，小扁豆的植酸含量较低[40] [41]。同样，RFOs由于在胃肠道中的发酵作用而不受欢迎。另一方面，最近重新评估了植酸和RFOs的抗氧化活性、抗炎作用、预防糖尿病的效果以及调节结肠癌风险的作用[42] [43]。因此，这些化合物的抗营养效应可以通过潜在的健康益处来平衡。3.2.2. 氨基酸谱佛卡夏面包的氨基酸谱如表4所示。DFLP的添加使得赖氨酸含量达到较高水平（每100克蛋白质含5.5克），弥补了小麦面粉中这种必需氨基酸的不足。赖氨酸在维持骨骼肌合成和整体健康方面起着关键作用[44] [45]。另一方面，小扁豆中限制性的氨基酸是甲硫氨酸和半胱氨酸，而小麦面粉中这两种氨基酸的含量较为丰富[46] [47]。实际上，通常采用豆类面粉和小麦面粉的组合来提供更平衡的氨基酸谱[44]。对照面包配方的氨基酸组成与其他作者报告的结果一致[26]。同样，含有20% DFLP的佛卡夏面包的氨基酸谱与添加了豆类面粉的面包（如蚕豆）的氨基酸谱相当[48]。表4. 样品的氨基酸组成。氨基酸（克/100克蛋白质）CTRLDFLP-20His3.01±0.03a1.63±0.01bLeu9.2±0.1a8.02±0.04bIle3.11±0.03b4.460±0.004aLys2.53±0.02b5.5±0.2aMet2.40±0.02a1.29±0.05bPhe4.44±0.04b4.94±0.02aThr2.62±0.02b3.21±0.01aVal4.6±0.2b4.79±0.02a总EAA31.9±0.2a33.9±0.1bAla8.3±0.2a6.69±0.04bArg5.42±0.01a2.94±0.01bAsp5.9±0.1b9.93±0.02aCys2.27±0.03a1.441±0.001bGlu31.41±0.05b33.79±0.05aGly4.76±0.01a3.95±0.02bSer6.81±0.02a5.76±0.03aTyr3.18±0.04a1.65±0.01b总NEAA68.1±0.2b66.2±0.1数据为三次重复实验的平均值±标准差。同一行中的不同字母表示显著差异（p < 0.05）。CTRL = 小麦基佛卡夏面包（对照组）；DFLP-20 = 添加了干法分离小扁豆面粉的佛卡夏面包；EAA = 必需氨基酸；NEEA = 非必需氨基酸。每种氨基酸的得分是根据FAO/WHO[24]推荐的成人饮食值计算的。当某种氨基酸的得分超过100时，被认为是非限制性的。赖氨酸在对照组样品中是限制性氨基酸，与其他研究[49]一致，在添加了DFLP的佛卡夏面包中其得分超过了100。另一方面，甲硫氨酸+半胱氨酸的得分随着DFLP的添加而降低，但仍高于100。表5. 根据FAO/WHO（2013）成人饮食蛋白质参考模式计算的佛卡夏面包的氨基酸得分。氨基酸得分FAO/WHO成人参考值CTRLDFLP-20His1.6188.33101.87Leu6.1150.84131.46Ile3.0103.61148.83Lys4.852.70114.79Met+Cys2.3203.04118.69Phe+Tyr4.1185.85160.73Thr2.5104.80128.47Val4.0115.77119.75限制性氨基酸Lys-CTRL = 小麦基佛卡夏面包（对照组）；DFLP-20 = 添加了干法分离小扁豆面粉3.2.3. 挥发性化合物小扁豆是一种廉价且容易获得的蛋白质来源，但消费者通常对添加了小扁豆的产品的嗅觉影响持负面看法[12] [50]。表6显示了佛卡夏面包样品的挥发性化合物谱，包括气味特征和每种化合物的来源。表6. 样品的挥发性化合物。CTRL = 小麦基佛卡夏面包（对照组）；DFLP-20 = 添加了干法分离小扁豆面粉的佛卡夏面包化合物（μg/克）RT（分钟）CTRLDFLP-20气味特征1,2来源醛类Hexanal13.041.7±0.2b2.3±0.1a氧化的新鲜草、新鲜青豆FFA2-Hexenal13.380.17±0.04甜味、杏仁FFA2-Methylbutanal6.442.31±0.05a2.02±0.03b杏仁、可可和咖啡M3-Methylbutanal6.575.3±0.5a5.04±0.04b果味、坚果味、巧克力、可可MNonanal25.140.51±0.04a0.27±0.04b脂肪味、青草味FFA2-Butanal10.800.20±0.02花香OBenzaldehyde28.864.1±0.2a2.9±0.3b杏仁、苦味、甜味、焦糖味FFA, AA醇类乙醇8.774.3±0.6b9.4±0.6a酒精味、甜味AA, FFA, F酸类乙酸21.280.5±0.1a0.30±0.01b乙酸FKetones2-Butanone6.1342.5±0.1刺激性、甜味OFuran化合物2-Furanmethanol33.380.26±0.04b0.53±0.07a烘焙、烤制MEthanone, 1-(2-furanyl)-28.410.61±0.01烘焙、烤制M2-Furancarboxaldheyde27.381.1±0.1b1.4±0.1a烘焙、烤制MPyrazinesMethyl-pyrazine21.490.293±0.001b0.55±0.07a烘焙、烤制MPyrazine 2 ethyl-5-methyl21.730.13±0.01烘焙、烤制MOthersUndecane17.490.10±0.03植物Op-Methylphenyl acetate23.350.40±0.06甜味、花香、果味、蜂蜜O1FoodDB [55]; 2The Good Scents Company Information System.[56]。数据为三次重复实验的平均值±标准差。同一行中的不同字母表示显著差异（p < 0.05）。*LOD = 0.02 μg/克；CTRL = 小麦基佛卡夏面包（对照组）；DFLP-20 = 添加了干法分离小扁豆面粉；RT= 保留时间；FFA = 游离脂肪酸；AA = 氨基酸；F = 发酵；O = 其他；M = 美拉德反应识别出的主要挥发性化合物类别是醇类和醛类。醇类的浓度可能是由于酵母菌对碳水化合物的代谢和发酵所致。特别是乙醇在添加了小扁豆蛋白的佛卡夏面包中含量较高。这是酒精发酵的产物，同时还有CO2。前者在烘焙过程中部分蒸发，而后者负责发酵阶段的体积增加和随后的烘焙过程。然而，酵母还可以作用于基质中的氨基酸，通过Ehrlich途径进行转氨酶、脱羧酶和还原酶等反应。因此，较高的乙醇含量可能是由于这个原因[51]。相比之下，对照组中的乙酸含量略高。乙酸通常是面包面团中由酵母发酵产生的主要有机酸，负责特征性的醋酸气味[52]。Hexanal是与小扁豆相关的主要化合物，其气味被描述为豆腥味、变质味和草腥味[53]。它是在脂氧合酶催化下多不饱和脂肪酸（PUFAs）分解后形成的[54]。因此，强化样品中PUFAs的较高含量（CTRL中的∑PUFA = 10.26%；DFLP-20中的∑PUFA = 12.09%，数据未显示）可能导致DFLP添加的佛卡夏面包中的Hexanal含量较高（比对照组高约35%）。美拉德反应涉及糖类和氨基酸之间的一系列反应，这些反应有助于食品的风味和面包皮的颜色变化。呋喃和吡嗪类化合物产生了甜味、烤制味和焦糖味。由于DFLP中的赖氨酸含量较高，这些化合物在其中的浓度显著更高。由此反应产生的其他化合物包括2-甲基丁醛和3-甲基丁醛，它们赋予了令人愉悦的烘烤和果味。总结马氏反应产生的所有化合物，强化了扁豆的样品中的浓度比对照组高出五倍以上（9.3 μg/g 对 47.3 μg/g），这可能有助于产生令人愉悦的香气。最后，在添加了DFLP的佛卡夏面包的挥发性成分中检测到了十一烷和对甲基苯乙酸等化合物，它们具有甜味和花香的香气。总体而言，挥发性成分表明添加DFLP可能会导致一种豆腥味，但这种味道可能被马氏反应相关化合物的强烈香气所掩盖。
3.2.4 物理性质
佛卡夏面包样品的物理性质，即面包屑和面包皮的颜色，以及烘焙过程中引起的物理变化，如表7所示。
表7. 样品的物理性质
参数 CTRL DFLP-20
颜色 L* 面包皮 61±5 44±1 a*
面包皮 11±3 b 24.1±0.2 ab*
面包皮 37±1 a 34±1 b
BI 39±5 b 56±1 a
ΔE 面包皮 -21.2
L* 面包屑 77.6±0.9 a 72±1 b
a* 面包屑 0.8±0.1 b 3.74±0.08 ab*
面包屑 24±2 b 34.3±0.4 a
WI 67.3±0.7 a 55±1 b
ΔE 面包屑 -12.3
烘焙过程中的变化
重量损失（%） 13±1 a 8.3±0.2 b
直径变化（%） -9±1 b -2.1±0.4 a
厚度变化（%） 90±7 90±8
数据以四次重复实验的平均值±标准差表示，其中质地数据四次重复，颜色数据五次重复，烘焙过程中的变化数据三次重复。同一行中不同的字母表示有显著差异（p < 0.05）。
CTRL = 小麦基佛卡夏面包（对照组）；DFLP-20 = 添加了干法分离扁豆面粉的佛卡夏面包；BI = 焦糖化指数；WI = 白化指数。
关于颜色属性，添加了DFLP的佛卡夏面包的面包皮和面包屑明显更暗且更红（a*值更高，L*和b*值更低），这通过ΔE值得到了证实，其值大于12，表明与传统佛卡夏面包相比有“非常明显的差异”[17]。类胡萝卜素（橙红色），通常存在于扁豆中[13]而在软质小麦面粉中不存在，很可能是两种佛卡夏面包颜色差异的原因。添加了DFLP的佛卡夏面包的面包屑的WI值较低。这些结果通过面粉的颜色差异得到了证实（小麦面粉：L*=77.3±1.3, a*=-0.86±0.02, b*=8.6±0.1；DFLP：L*=73.41±0.03, a*=4.9±0.1, b*=23.1±0.5，数据未显示）。添加了DFLP的佛卡夏面包的面包皮与对照组之间的ΔE值特别高（21.2），以及L*值显著较低，a*值较高，BI值较高，这些都是由于DFLP中马氏反应的强度更大所致，而这又是因为扁豆蛋白中的赖氨酸含量较高。
添加了DFLP的佛卡夏面包的直径在烘焙过程中几乎没有变化，这与De Angelis等人的研究结果[10]中添加了豌豆蛋白的扁面包的情况相似，而对照组佛卡夏面包由于面筋的弹性而收缩更多。两种佛卡夏面包的厚度增加程度相同，没有显著差异。添加了DFLP的佛卡夏面包的重量损失较低，这可能是由于其较高的纤维含量和更好的保水能力。
3.2.5 消费者测试
进行消费者测试至关重要，因为它可以直接获得潜在消费者的反馈，从而克服了小规模样本在评估实际市场接受度方面的局限性。消费者测试显示，对照组佛卡夏面包的受欢迎程度显著更高（p < 0.05）（表8）。
表8. 样品的消费者接受度
样品 颜色 质地 气味 风味 整体喜好
CTRL 7±1 a 7±1 a 7±1 a 7±1 a
DFLP-20 7±1 b 6±1 b 6±1 b 6±2 b 7±1 b
同一列中不同的字母表示有显著差异（p < 0.05）。
CTRL = 小麦基佛卡夏面包（对照组）；DFLP-20 = 添加了干法分离扁豆面粉的佛卡夏面包。
然而，两种佛卡夏面包在每个评价指标上的感官差异都不到一分，DFLP添加的佛卡夏面包的得分始终在1-9的愉悦度量表上大于6。在质地和气味方面的喜好差异最大，这突显了嗅觉特征和质地属性在驱动喜好和购买意图中的核心作用[57]、[58]、[59]。气味喜好的降低可能与豆类特有的植物气味有关，这些气味在佛卡夏面包中被认为是意外的，并且通过挥发性成分分析得到了进一步的支持。相反，质地偏好有所下降，这可能是由于面包屑结构较硬所致。这一发现得到了仪器质地分析的证实。
研究结果得到了偏好图（图6）的支持。这种多变量分析方法将消费者偏好与根据其强度标定的感官属性相关联。然后使用多项式回归对变量进行建模，以在感官空间内绘制愉悦度得分[58]、[60]。两种不同的佛卡夏面包在偏好图中的位置不同，对照组佛卡夏面包是最受欢迎的选择（60–80%），而添加了DFLP的佛卡夏面包获得了中等程度的偏好（40–60%）。然而，DFLP添加的佛卡夏面包的这种中等偏好水平似乎是一个良好的起点，未来可以进一步改进，以达到与对照组佛卡夏面包相当的偏好水平。
4. 结论
总之，研究表明，将DFLP以20%的比例与小麦面粉结合使用改善了佛卡夏面包的营养价值，表现为更高的纤维和蛋白质含量，后者具有平衡的氨基酸组成。这些营养素有助于预防心血管疾病、糖尿病、癌症和整体身体健康。挥发性成分显示马氏反应产物的含量增加，伴随着令人愉悦的香气，部分掩盖了扁豆典型的“豆腥”气味。然而，消费者喜好评估显示，添加了DFLP的佛卡夏面包的受欢迎程度足够高，但低于对照组佛卡夏面包。因此，未来的研究应重点关注减轻感官上的变化，以便干法分离的蛋白质浓缩物能够在烘焙食品强化中充分发挥其潜力。尽管如此，添加了DFLP的佛卡夏面包仍然是一个有前景的产品，符合当前消费者对可持续、清洁标签和功能性食品的需求。
作者贡献声明
Michele Faccia：撰写 – 审稿与编辑
Francesco Caponio：撰写 – 审稿与编辑
Giuseppe Natrella：撰写 – 审稿与编辑，形式分析
Giacomo Squeo：撰写 – 审稿与编辑，形式分析
Antonella Pasqualone：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念化
Francesca Vurro：撰写 – 原始草稿，方法论，调查，形式分析，数据管理
Mariana Miccolis：撰写 – 审稿与编辑，方法论，调查，数据管理
机构审查委员会声明
不适用。
知情同意声明
所有研究参与者在参与研究前均提供了书面知情同意。
利益冲突
作者确认他们与本手稿描述的工作没有利益冲突。
数据可用性
支持本研究所有发现的数据均包含在论文中。
资助
本文得到了PRIMA计划的支持，授予协议编号为2031，项目名称为“地中海地区的扁面包：创新和新兴工艺和技术（Flat Bread Mine）”。PRIMA计划是Horizon 2020框架计划下的Art.185倡议，该计划由欧盟资助。本文的结果和内容仅代表作者的观点。PRIMA基金会不对本文所含信息的任何使用负责。
本研究在Agritech国家研究中心进行，并获得了欧盟下一代欧盟（PIANO NAZIONALE DI RIPRESA E RESILIENZA (PNRR)-MISSIONE 4 COMPONENTE 2, INVESTIMENTO 1.4–D.D.103217/06/2022, CN00000022）的资助。本手稿仅反映作者的观点和意见，欧盟委员会对此不承担责任。
打赏
